(EU) 2019/1390Nařízení Komise (EU) 2019/1390 ze dne 31. července 2019, kterým se přizpůsobuje technickému pokroku příloha nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (REACH) (Text s významem pro EHP)

Publikováno: Úř. věst. L 247, 26.9.2019, s. 1-508 Druh předpisu: Nařízení
Přijato: 31. července 2019 Autor předpisu: Evropská komise
Platnost od: 16. října 2019 Nabývá účinnosti: 16. října 2019
Platnost předpisu: Ano Pozbývá platnosti:

Text předpisu s celou hlavičkou je dostupný pouze pro registrované uživatele.



NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2019/1390

ze dne 31. července 2019,

kterým se přizpůsobuje technickému pokroku příloha nařízení (ES) č. 440/2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (REACH)

(Text s významem pro EHP)

EVROPSKÁ KOMISE,

s ohledem na Smlouvu o fungování Evropské unie,

s ohledem na nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (REACH), o zřízení Evropské agentury pro chemické látky, o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení nařízení Rady (EHS) č. 793/93, nařízení Komise (ES) č. 1488/94, směrnice Rady 76/769/EHS a směrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a zejména na čl. 13 odst. 2 uvedeného nařízení,

vzhledem k těmto důvodům:

(1)

Nařízení Komise (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje zkušební metody pro účely stanovení fyzikálně-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity chemických látek, které se uplatní pro účely nařízení (ES) č. 1907/2006.

(2)

Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj (OECD) připravuje harmonizované a mezinárodně schválené pokyny ke zkoušení chemických látek pro regulační účely. OECD pravidelně vydává nové a revidované pokyny ke zkoušení zohledňující vědecký pokrok v této oblasti.

(3)

Aby bylo možné zohlednit technický pokrok a co nejvíce snížit počet zvířat používaných pro experimentální účely v souladu s čl. 13 odst. 2 nařízení (ES) č. 1907/2006, je třeba po přijetí příslušných pokynů OECD ke zkoušení stanovit dvě nové zkušební metody pro posuzování ekotoxicity a devět nových zkušebních metod pro stanovení toxicity pro lidské zdraví a aktualizovat sedm zkušebních metod. Jedenáct z těchto zkušebních metod se týká zkoušek in vitro na dráždivé/leptavé účinky na kůži a oči, senzibilizaci kůže, genotoxicitu a endokrinní účinky. Navrhovaná změna byla konzultována se zúčastněnými stranami.

(4)

Nařízení (ES) č. 440/2008 by proto mělo být odpovídajícím způsobem změněno.

(5)

Opatření stanovená tímto nařízením jsou v souladu se stanoviskem výboru zřízeného podle článku 133 nařízení (ES) č. 1907/2006,

PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:

Článek 1

Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění v souladu s přílohou tohoto nařízení.

Článek 2

Toto nařízení vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

V Bruselu dne 31. července 2019.

Za Komisi

předseda

Jean-Claude JUNCKER


(1)  Úř. věst. L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Nařízení Komise (ES) č. 440/2008 ze dne 30. května 2008, kterým se stanoví zkušební metody podle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek (REACH) (Úř. věst. L 142, 31.5.2008, s. 1).


PŘÍLOHA

Příloha nařízení (ES) č. 440/2008 se mění takto:

(1)

V části B se kapitola B.4 nahrazuje tímto:

„B.4   AKUTNÍ DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) 404 (2015). Pokyny OECD pro zkoušení chemických látek jsou pravidelně přezkoumávány s cílem zajistit, aby odrážely nejlepší dostupné vědecké poznatky. Při přezkumu Pokynu OECD pro zkoušení č. 404 byla zvláštní pozornost věnována možným zlepšením v oblasti dobrého zacházení se zvířaty a vyhodnocování veškerých existujících informací o zkoušené chemické látce s cílem vyhnout se zkouškám na laboratorních zvířatech, které nejsou nutné. Aktualizovaná verze Pokynu OECD pro zkoušení č. 404 (původně přijatého v roce 1981, revidovaného v letech1992, 2002 a 2015) obsahuje odkaz na pokyny k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování (IATA) dráždivých/leptavých účinků na kůži (1) a navrhuje pro zkoušení dráždivých a leptavých účinků na kůži modulový přístup. Integrované přístupy ke zkouškám a posuzování popisují několik modulů obsahujících informační zdroje a analytické nástroje a i) poskytují návod na integraci a používání stávajících údajů ze zkoušek a dalších údajů pro posouzení potenciálu dráždivých a leptavých účinků chemických látek na kůži a ii) a navrhují přístup, když je nutné další zkoušení (1). Navíc se v případě potřeby v počáteční zkoušce in vivo doporučuje v tomto pokynu namísto současného aplikování postupná aplikace tří testovacích náplastí.

2.

Definice dráždivých a leptavých účinků na kůži jsou uvedeny v dodatku této zkušební metody.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

3.

V zájmu spolehlivého vědeckého přístupu a dobrého zacházení se zvířaty by se zkoušky in vivo neměly provádět, dokud nebyly všechny dostupné údaje, významné pro potenciální leptavé nebo dráždivé účinky zkoušené chemické látky, vyhodnoceny na základě analýzy průkaznosti výsledků, jak se uvádí v pokynech k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování dráždivých/leptavých účinků na kůži, tj. ve třech částech tohoto pokynu a v příslušných modulech (1). Stručně řečeno, podle části 1 se stávající údaje hodnotí v sedmi modulech zahrnujících údaje o účincích na člověka, údaje in vivo, údaje in vitro, údaje o fyzikálně chemických vlastnostech (například pH, zejména silná kyselost nebo zásaditost) a jiné než zkušební metody. Podle části 2 se provádí analýza průkaznosti výsledků. Je-li tato analýza stále neprůkazná, je třeba provést další zkoušení podle části 3, přičemž se začíná metodami in vitro a zkoušení in vivo se používá až jako poslední možnost. Tato analýza by tedy měla snížit potřebu zkoušek leptavých nebo dráždivých účinků na kůži metodou in vivo u zkoušených chemických látek, u nichž již existují dostatečné důkazy z jiných studií, pokud jde o tyto dvě sledované vlastnosti.

PRINCIP ZKOUŠKY IN VIVO

4.

Chemická látka, která má být zkoušena, se v jedné dávce nanese na kůži pokusného zvířete; oblasti neexponované kůže pokusného zvířete slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se určí, vyhodnotí a následně popíše stupeň dráždivých/leptavých účinků, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné zhodnotit vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků.

5.

Zvířata, která v jakékoli fázi zkoušky vykazují přetrvávající příznaky značného utrpení a/nebo bolesti, se humánně utratí a zkoušená chemická látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Kritéria rozhodování o humánním usmrcení umírajících a značně trpících zvířat lze nalézt v samostatných pokynech OECD (2).

PŘÍPRAVA NA ZKOUŠKU IN VIVO

Výběr zvířecích druhů

6.

Upřednostňovaným laboratorním zvířetem je albín králíka, používají se zdravá mladá dospělá zvířata. Použití jiného druhu by mělo být zdůvodněno.

Příprava zvířat

7.

Asi 24 hodin před zahájením zkoušky se zvířatům ostříhá srst na zádech. Je třeba dbát na to, aby se kůže neporanila. Smějí se použít pouze zvířata se zdravou, neporaněnou kůží.

8.

Některé kmeny králíka mají plošky husté srsti, které jsou v některých obdobích roku výraznější. Na takových oblastech husté srsti by se zkouška provádět neměla.

Podmínky chovu a krmení

9.

Zvířata se chovají samostatně. Teplota v místnosti pro pokusná zvířata by měla být u králíků 20 oC (± 3 oC). Ačkoli by relativní vlhkost vzduchu měla být minimálně 30 % a pokud možno by kromě doby úklidu místnosti neměla přesáhnout 70 %, cílem by měla být hodnota 50–60 %. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní stravu s neomezeným přísunem pitné vody.

ZKUŠEBNÍ POSTUP

Aplikace zkoušené chemické látky

10.

Zkoušená chemická látka se nanese na malou plochu kůže (asi 6 cm2) a pokryje se plátkem mulu s nedráždivou náplastí. V případech, kdy přímá aplikace není možná (např. kapaliny nebo některé pasty), by se měla zkoušená chemická látka nejprve nanést na plátek mulu, který se následně přiloží na kůži. Po dobu trvání expozice je třeba přidržovat plátek volně na kůži vhodným semiokluzivním obvazem. Pokud se zkoušená chemická látka nanáší na mul, měl by být na kůži připevněn tak, aby se zajistil dobrý kontakt s kůží a rovnoměrné rozložení zkoušené chemické látky na kůži. Je třeba zabránit tomu, aby se zvíře dostalo k mulu a zkoušenou chemickou látku požilo nebo vdechlo.

11.

Kapalné zkoušené chemické látky se zpravidla aplikují neředěné. Při zkouškách pevných látek (které mohou být případně rozetřeny na prach) se zkoušená chemická látka navlhčí co nejmenším množstvím vody (v případě potřeby jiným vhodným vehikulem), aby se zajistil dostatečný kontakt s kůží. Pokud se používají jiná vehikula než voda, měl by být potenciální vliv vehikula na dráždivé účinky zkoušené chemické látky na kůži pouze minimální.

12.

Po uplynutí doby expozice, která je obvykle 4 hodiny, se odstraní zbytky zkoušené chemické látky, pokud možno vodou nebo vhodným rozpouštědlem, aniž by došlo k ovlivnění odezvy nebo celistvosti kůže.

Úroveň dávek

13.

Na testovací místo se nanese 0,5 ml kapaliny nebo 0,5 g pevné látky nebo pasty.

Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na kůži in vivo s použitím jednoho zvířete)

14.

Pokud byla na základě analýzy průkaznosti výsledků nebo na základě předchozího zkoušení in vitro zkoušená chemická látka posouzena jako žíravá, dráždivá nebo neklasifikovaná, není žádné další zkoušení in vivo obvykle nutné. Avšak v případech, kdy je opodstatněné získat doplňující údaje, provede se zkouška in vivo nejprve na jednom zvířeti a s použitím následujícího přístupu. Zvířeti se postupně přiloží tři testovací náplasti. První náplast se odstraní po třech minutách. Pokud není pozorována závažná kožní reakce, přiloží se na jiné místo druhá náplast a po jedné hodině se odstraní. Pokud pozorování v této fázi naznačují, že expozici lze bez porušení zásady humánního zacházení prodloužit na čtyři hodiny, přiloží se třetí náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní, a vyhodnotí se odezva.

15.

Pokud je po některé ze tří následných expozic pozorován leptavý účinek, zkouška se okamžitě ukončí. Pokud po odstranění třetí náplasti není leptavý účinek pozorován, zvíře se pozoruje po dobu 14 dnů, pokud se u něj poleptání kůže neprojeví dříve.

16.

V takových případech, kdy se u zkoušené chemické látky nepředpokládá, že vyvolá leptavé účinky, ale může být dráždivá, by se měla jednomu zvířeti přiložit jedna náplast na čtyři hodiny.

Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na kůži in vivo s dalšími zvířaty)

17.

Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit nejvýše na dvou dalších zvířatech, u každého s jednou náplastí a dobou expozice 4 hodiny. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován dráždivý účinek, lze potvrzující zkoušku provést postupně, nebo exponováním dvou dalších zvířat současně. Ve výjimečném případě, kdy se počáteční zkouška neprovádí, lze dvěma nebo třem zvířatům přiložit jednu náplast, která se po čtyřech hodinách odstraní. Jestliže se použijí dvě zvířata a u obou se projeví stejná reakce, není žádné další zkoušení nutné. Jinak se zkouší také třetí zvíře. Neurčité reakce je možné zhodnotit na dalších zvířatech.

Doba pozorování

18.

Doba studie by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena kdykoliv v okamžiku, kdy zvíře vykazuje přetrvávající příznaky značné bolesti nebo utrpení. Za účelem určení vratnosti účinků by se zvířata měla pozorovat 14 dnů po odstranění náplastí. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 14 dnů, zkouška se v tomto okamžiku ukončí.

Klinická pozorování a hodnocení reakcí kůže

19.

Všechna zvířata se pozorují na příznaky erytému a edému, reakce kůže se hodnotí po 60 min a dále po 24, 48 a 72 hodinách po odstranění náplasti. V počáteční zkoušce na jednom zvířeti se po odstranění náplasti okamžitě vyšetří také testované místo. Kožní reakce se vyhodnotí a zaznamenají podle stupnice v níže uvedené tabulce. Pokud se objeví poškození kůže, které po 72 hodinách nelze označit za dráždivé nebo leptavé účinky, může být nezbytné pokračovat v pozorování až do 14. dne kvůli stanovení vratnosti účinků. Kromě pozorování dráždivých účinků by měly být důkladně popsány a zaznamenány veškeré místní toxické účinky, jako je odtučnění kůže a jakékoli systémové nežádoucí účinky (např. vliv na klinické příznaky toxicity a tělesnou hmotnost). K objasnění neurčitých reakcí se zváží histopatologické vyšetření.

20.

Hodnocení reakcí kůže je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení reakcí kůže a napomáhat zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování (viz níže uvedená tabulka). Jako pomůcku lze použít ilustrované pokyny pro hodnocení dráždivých účinků na kůži a jiných lézí (3).

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

21.

Výsledky studie se shrnou do tabulky uvedené v závěrečné zprávě. Měly by zpracovávat všechny položky uvedené v odstavci 24.

Vyhodnocení výsledků

22.

Stupně dráždivých účinků na kůži se zhodnotí ve spojení s povahou a závažností lézí a jejich vratností nebo nevratností. Jednotlivé stupně nepředstavují absolutní měřítko dráždivých vlastností látky, neboť se hodnotí také jiné účinky zkoušené látky. Jednotlivé stupně by spíše měly být považovány za referenční hodnoty, které je nutno zhodnotit společně s dalšími pozorováními vyplývajícími ze studie.

23.

Při hodnocení dráždivých reakcí se zohlední vratnost kožních lézí. Pokud do ukončení čtrnáctidenní doby pozorování přetrvávají reakce jako alopecie (na omezené ploše), hyperkeratóza, hyperplazie a šupinatění, považuje se zkoušená chemická látka za dráždivou.

Závěrečná Zpráva

24.

Závěrečná zpráva musí obsahovat tyto údaje:

 

Odůvodnění zkoušení in vivo:

analýza průkaznosti výsledků údajů z dřívějších zkoušek, včetně výsledků strategie postupného zkoušení, s posouzením závažnosti důkazů,

popis relevantních údajů z předchozích zkoušek,

údaje získané v každé fázi strategie zkoušení,

popis provedených zkoušek in vitro, včetně podrobných údajů o postupech a o výsledcích získaných se zkoušenými/referenčními látkami,

analýza závažnosti důkazů odůvodňující provedení studie in vivo.

 

Zkoušená chemická látka:

jednosložková látka: chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.,

vícesložková látka, směs a látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologické materiály (UVCB): charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek,

fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

zdroj, číslo šarže, jsou-li k dispozici,

případně ošetření zkoušených chemických/kontrolních látek před zkoušením (např. zahřátí, mletí),

stabilita zkoušené chemické látky, datum použitelnosti nebo datum opětovné analýzy, je-li známo,

podmínky skladování.

 

Vehikulum:

identifikace, koncentrace (podle potřeby), použitý objem,

zdůvodnění výběru vehikula.

 

Pokusná zvířata:

použitý druh/kmen, zdůvodnění použití jiných zvířat, není-li použit albinotický králík,

počet zvířat každého pohlaví,

hmotnosti jednotlivých zvířat na začátku a na konci zkoušky,

stáří na začátku studie,

původ zvířat, podmínky chovu, strava atd.

 

Zkušební podmínky:

technika přípravy oblasti kůže, na kterou se nanese náplast;

podrobné údaje o materiálech použitých na náplasti a technice aplikování náplastí,

podrobné údaje o přípravě zkoušené chemické látky, jejím nanesení a odstranění.

 

Výsledky:

údaje o stupni odezvy na dráždivé nebo leptavé účinky u každého zvířete v každém okamžiku měření,

popis všech pozorovaných lézí,

podrobný popis povahy a stupně pozorovaných dráždivých nebo leptavých účinků a případné histopatologické nálezy,

popis jiných místních (např. odtučnění kůže) a systémových účinků vedle dráždivých nebo leptavých účinků na kůži.

 

Diskuse o výsledcích

 

Závěry

LITERATURA

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

Tabulka

Hodnocení kožních reakcí

Žádný erytém…

0

Velmi slabý erytém (sotva patrný)…

1

Zřetelně viditelný erytém…

2

Mírný až výrazný erytém…

3

Těžký erytém (silné zrudnutí) nebo tvorba příškvaru znemožňující posouzení erytému…

4

Maximálně možné: 4

Žádný edém…

0

Velmi lehký edém (sotva patrný)…

1

Lehký edém (okraje jsou patrné, plocha je ohraničena zřetelným vyvýšením)…

2

Mírný edém (okraje vyvýšeny asi o 1 mm)…

3

Výrazný edém (zduření více než 1 mm a otok přesahující hranice exponované plochy)…

4

Maximálně možné: 4

Pro objasnění neurčitých reakcí lze provést histopatologické vyšetření.

Dodatek

DEFINICE

Chemická látka je látka nebo směs.

Dráždivé účinky na kůži znamenají vyvolání vratných změn na kůži do 4 hodin po aplikaci zkoušené chemické látky.

Leptavé účinky na kůži znamenají vyvolání nevratného poškození kůže; zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do čtyř hodin po aplikaci zkoušené chemické látky. Typickými reakcemi na poleptání jsou vředy, krvácení, krvavé strupy a v závěru čtrnáctidenního pozorování ztráta barvy v důsledku vyblednutí kůže, úplná ložiska alopecie a jizvy. K vyhodnocení sporných lézí by se měla uvážit histopatologie.

Zkoušená chemická látka je jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

(2)

V části B se kapitola B.17 nahrazuje tímto:

„B.17   ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE V BUŇKÁCH SAVCŮ IN VITRO S POUŽITÍM GENŮ HPRT A XPRT

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 476 (2016). Zkušební metody se pravidelně přezkoumávají s ohledem na vědecký pokrok, měnící se potřeby regulace a dobré životní podmínky zvířat. Současná revidovaná verze zkušební metody B.17 odráží téměř třicet let zkušeností s touto zkouškou a vyplývá také z vývoje samostatné nové metody určené pro zkoušky na genové mutace v buňkách savců in vitro s použitím genu thymidinkinázy. Zkušební metoda B.17 je součástí série zkušebních metod v oblasti genetické toxikologie. Byl vypracován dokument, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které OECD provedla ve svých pokynech ke zkoušení genotoxicity (1).

2.

Účelem zkoušky na genové mutace v buňkách savců in vitro je detekce genových mutací vyvolaných chemickými látkami. Buněčné linie používané při těchto zkouškách měří přímé mutace reportérových genů, a to endogenního hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferázového genu (Hprt v buňkách hlodavců, HPRT v lidských buňkách; v této zkušební metodě dále jen společně gen Hprt a zkouška HPRT) a xanthin-guaninfosforibosyltransferázového transgenu (gpt) (dále jen zkouška XPRT). Zkoušky na mutace HPRT a XPRT detekují různé spektrum genetických událostí. Kromě mutací detekovaných zkouškou HPRT (např. substituce párů bází, posunové mutace, malé delece a inserce) může autosomální lokace transgenu gpt umožnit detekci mutací vzniklých z velkých delecí a případně mitotickou rekombinaci nezjištěnou zkouškou HPRT, protože se gen Hprt nachází v chromozomu X (2) (3) (4) (5) (6) (7). Pro účely regulace se zkouška XPRT v současnosti používá méně často než zkouška HPRT.

3.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY A OMEZENÍ

4.

Zkoušky prováděné in vitro obecně vyžadují použití vnějšího zdroje metabolické aktivace. Systém exogenní metabolické aktivace zcela nenapodobuje podmínky in vivo.

5.

Je třeba zabránit vzniku podmínek, které by mohly vést k uměle pozitivním výsledkům (tj. možná interakce se zkušebním systémem), které nejsou způsobeny přímou interakcí mezi zkoušenými chemickými látkami a genetickým materiálem buňky; takové podmínky zahrnují změny pH nebo osmolality (8) (9) (10), interakci se složkami média (11) (12) nebo nadměrné úrovně cytotoxicity (13). Pro zkoušku HPRT se cytotoxicita přesahující doporučené horní úrovně cytotoxicity stanovené v odstavci 19 považuje za nadměrnou.

6.

Před použitím této zkušební metody ke zkoušení směsi s cílem získat údaje pro zamýšlené regulační účely by mělo být zváženo, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč tomu tak je. Takové posouzení není nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi.

PRINCIP ZKOUŠKY

7.

Mutantní buňky s deficientní aktivitou enzymu Hprt při zkoušce HPRT nebo deficientní aktivitou enzymu xprt při zkoušce XPRT jsou rezistentní na cytostatické účinky 6-thioguaninu (TG), což je analog purinů. Buňky produkující Hprt (při zkoušce HPRT) nebo gpt (při zkoušce XPRT) jsou citlivé na TG, což způsobuje inhibici buněčného metabolismu a zastavuje další buněčné dělení. Mutantní buňky jsou tedy schopny proliferace za přítomnosti TG, zatímco normální buňky, které obsahují enzym Hprt (při zkoušce HPRT) nebo enzym gpt (při zkoušce XPRT), tuto schopnost nemají.

8.

Buňky v suspenzní nebo jednovrstevné kultuře jsou po vhodnou dobu (3–6 hodin) vystaveny zkoušené chemické látce jak s exogenním zdrojem metabolické aktivace (viz odstavec 14), tak bez něj, a poté subkultivovány za účelem stanovení cytotoxicity a za účelem exprese fenotypu před selekcí mutantů (14), (15), (16), (17). Cytotoxicita se stanoví podle relativního přežití, tj. účinnosti klonování měřené okamžitě po expozici a upravené podle případné ztráty buněk v průběhu expozice v porovnání s negativní kontrolou (odstavec 18 a dodatek 2). Exponované kultury se udržují v růstovém médiu po vhodnou dobu charakteristickou pro každý typ buněk, aby nastala přibližně optimální fenotypová exprese indukovaných mutací (obvykle 7–9 dnů). Po fenotypové expresi se četnost mutantů stanoví tak, že se nasadí známý počet buněk do média obsahujícího selekční činidlo pro detekci mutantních kolonií a do média bez selekčního činidla, aby byla stanovena účinnost klonování (životaschopnost). Po vhodné inkubační době se spočítají kolonie. Četnost mutantů se vypočítá podle počtu mutantních kolonií korigovaného účinností klonování v době selekce mutantů.

POPIS METODY

Přípravky

Buňky

9.

Typy buněk použité pro zkoušky HPRT a XPRT by měly vykazovat citlivost k chemickým mutagenům, vysokou klonovací schopnost, stabilní karyotyp a stabilní frekvenci spontánních mutací. Mezi nejčastěji používané buňky pro zkoušku HPRT patří buněčné linie CHO, CHL a V79 křečka čínského, buňky lymfomu L5178Y myší a lymfoblastoidní buňky TK6 člověka (18) (19). Pro zkoušku XPRT se používají buňky AS52 odvozené z vaječníků křečka čínského obsahující transgen gpt (a které mají deletovaný gen Hprt) (20) (21); zkoušku HPRT nelze na buňkách AS52 provést, protože gen hprt je deletován. Použití jiných buněčných linií by mělo být zdůvodněno a validováno.

10.

U buněčných linií by se měla pravidelně kontrolovat stabilita modální hodnoty počtu chromozomů a mělo by se zjišťovat, zda nejsou kontaminovány mykoplazmaty (22) (23). Pokud jsou kultury kontaminované nebo se modální hodnota počtu chromozomů změnila, neměly by se dotyčné kultury používat. Měla by být stanovena normální délka buněčného cyklu použitá ve zkušební laboratoři, která by měla být v souladu s buněčnými charakteristikami uvedenými v literatuře. Rovněž by měla být zkontrolována spontánní četnost mutací v zásobě základních buněk, a pokud četnost mutantů není přijatelná, zásoba by se neměla používat.

11.

Před použitím v této zkoušce může být nezbytné odstranit z kultury již přítomné mutantní buňky, např. kultivací v médiu HAT pro zkoušku HPRT a v médiu MPA pro zkoušku XPRT (5) (24) (viz dodatek 1). Vyčištěné buňky mohou být uchovávány zmrazené a po rozmrazení použity jako pracovní zásoby. Právě rozmrazená pracovní zásoba může být použita pro zkoušku po dosažení normální rychlosti rozmnožování. Při provádění zkoušky XPRT by měla být rutinní kultura buněk AS52 použita za podmínek, které zajišťují zachování transgenu gpt (20).

Média a podmínky kultivace

12.

Pro udržování kultur by mělo být použito vhodné kultivační médium a inkubační podmínky (kultivační nádoby, zvlhčená atmosféra s 5 % CO2, inkubační teplota 37 oC). Buněčné kultury by měly být vždy uchovávány za podmínek, při nichž je zajištěn jejich logaritmický růst. Je zvláště důležité, aby byly média a podmínky kultivace zvoleny tak, aby byl zajištěn optimální růst buněk během období exprese a optimální účinnost klonování jak mutovaných, tak nemutovaných buněk.

Příprava kultur

13.

Buněčné linie se pomnoží z kmenových kultur, nasadí se do kultivačního média v takové hustotě, aby u buněk v suspenzích nebo v monovrstvách pokračoval exponenciální růst v průběhu doby expozice a exprese (např. mělo by se zamezit konfluenci u buněk rostoucích v monovrstvách).

Metabolická aktivace

14.

Při použití buněk, které mají nedostatečnou endogenní metabolickou schopnost, by se měly použít exogenní metabolizující systémy. Nejčastěji používaným systémem, který je standardně doporučován, pokud není zdůvodněno použití jiného systému, je kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců (zpravidla potkanů) zpracovaná činidlem indukujícím enzymy, jako je Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28), nebo směsí fenobarbitalu a ?-naftoflavonu (29) (30) (31) (32). Uvedená směs není v rozporu se Stockholmskou úmluvou o perzistentních organických znečišťujících látkách (33) a bylo prokázáno, že je stejně účinná jako Aroclor 1254 pro indukování oxidáz se smíšenou funkcí (29) (31). Frakce S9 je v konečném testovacím médiu obvykle používána v koncentracích od 1 % do 2 % obj., avšak koncentraci je možné zvýšit do 10 %. Volbu oprávněného typu a koncentrace systému exogenní metabolické aktivace nebo metabolického induktoru, který se použije, může ovlivnit třída zkoušených látek (34) (35) (36).

Příprava zkoušené chemické látky

15.

Pevné zkoušené chemické látky by měly být před aplikací na buňky rozpuštěny ve vhodných rozpouštědlech a popřípadě zředěny (viz odstavec 16). Kapalné látky lze přidat přímo do zkušebních systémů a/nebo je lze před použitím k ošetření zkušebních systémů zředit. Plynné a těkavé zkoušené chemické látky by se měly zkoušet za použití vhodně upravených standardních protokolů, například prostřednictvím ošetření buněk v neprodyšně uzavřených kultivačních nádobách (37) (38). Měly by se používat čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY

Rozpouštědla

16.

Rozpouštědlo by mělo být zvoleno tak, aby optimalizovalo rozpustnost zkoušené chemické látky, aniž by nepříznivě ovlivnilo provádění zkoušky, např. měnilo růst buněk, ovlivňovalo integritu zkoušené chemické látky, reagovalo s kultivačními nádobami, narušovalo systém metabolické aktivace. Doporučuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodného rozpouštědla (nebo kultivačního média). Dobře zavedenými rozpouštědly jsou například voda a dimethylsulfoxid. Podíl organických rozpouštědel by zpravidla neměl být větší než 1 % obj. a podíl vodných rozpouštědel (fyziologického roztoku nebo vody) v konečném expozičním médiu by neměl být větší než 10 % obj. Jsou-li použita jiná než osvědčená rozpouštědla (např. ethanol nebo aceton), mělo by být jejich použití podloženo údaji o jejich kompatibilitě se zkoušenými chemickými látkami a zkušebním systémem a o tom, že nejsou v použité koncentraci genotoxické. Pokud takové podpůrné údaje neexistují, je důležité přidat neexponované kontroly (viz dodatek 1) prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné škodlivé nebo mutagenní účinky.

Měření cytotoxicity a volba expozičních koncentrací

17.

Při stanovení nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky by neměly být použity koncentrace, které jsou schopny vyvolat falešnou pozitivní odezvu, jako např. koncentrace, jež vyvolávají nadměrnou cytotoxicitu (viz odstavec 20), srážení kultivačního média (viz odstavec 21) nebo zřetelné změny pH nebo osmolality (viz odstavec 5). Pokud zkoušená chemická látka v době jejího přidání způsobuje zřetelnou změnu hodnoty pH média, lze pH upravit pufrováním konečného expozičního média tak, aby nedošlo k falešným pozitivním výsledkům a aby byly zachovány vhodné kultivační podmínky.

18.

Volba koncentrace vychází z cytotoxicity a dalších faktorů (viz odstavce 20–22). Přestože hodnocení cytotoxicity při předběžné zkoušce může být užitečné a může napomoci k lepšímu určení koncentrací, jež mají být použity při hlavní zkoušce, předběžná zkouška není vyžadována. I v případě, že se provede předběžné hodnocení cytotoxicity, je při hlavním experimentu přesto požadováno měření cytotoxicity pro každou kulturu. Cytotoxicita by se měla hodnotit podle relativního přežití, tj. podle účinnosti klonování buněk umístěných na destičky okamžitě po expozici upravené podle případné ztráty buněk v průběhu expozice, a to podle počtu buněk, v porovnání s upravenou účinností klonování u negativních kontrol (s přiřazeným přežitím 100 %) (viz dodatek 2, kde je uveden vzorec).

19.

Měly by se vyhodnotit nejméně čtyři zkušební koncentrace (nepočítaje v to kontroly s rozpouštědlem a pozitivní kontroly), které splňují kritéria přijatelnosti (vhodná cytotoxicita, počet buněk atd.). I když se doporučuje použít duplicitní kultury, lze pro každou zkušební koncentraci použít repliky nebo jednu exponovanou kulturu. Výsledky získané z duplicitních nezávislých kultur při dané koncentraci by měly být vykazovány samostatně, ale pro účely analýzy údajů je lze sloučit (17). U zkoušených látek, jež vykazují malou cytotoxicitu nebo nevykazují žádnou cytotoxicitu, budou obvykle vhodné přibližně dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrací. V případě cytotoxicity by měly zvolené zkušební koncentrace pokrývat rozpětí od koncentrace vyvolávající cytotoxicitu po koncentrace, při nichž dochází ke střední a nízké cytotoxicitě nebo nedochází k žádné cytotoxicitě. Mnohé zkoušené chemické látky vykazují strmé křivky závislosti účinku na koncentraci, a aby bylo možné postihnout celý rozsah cytotoxicity nebo podrobně studovat závislost účinku na koncentraci, může být nezbytné zvolit menší rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a více než čtyři koncentrace, zejména v situacích, kdy je požadován opakovaný experiment (viz odstavec 43). Použití více než 4 koncentrací může být zvláště důležité, když se používá jedna kultura.

20.

Je-li maximální koncentrace odvozena od cytotoxicity, měla by být nejvyšší koncentrace zvolena tak, aby se dosáhlo relativního přežití mezi 20 a 10 %. Je třeba dbát na to, aby byly interpretovány pouze ty pozitivní výsledky, které jsou vykazovány při relativním přežití 10 % nebo méně (odstavec 43).

21.

V případě špatně rozpustných zkoušených chemických látek, které nejsou cytotoxické při koncentracích nižších, než je jejich rozpustnost, by nejvyšší analyzovaná koncentrace měla na konci expozice zkoušené chemické látce vyvolat zákal nebo sraženinu viditelnou pouhým okem nebo pomocí inverzního mikroskopu. Dokonce i v případech, kdy k výskytu cytotoxicity dochází při koncentracích vyšších, než je rozpustnost, se doporučuje testovat pouze při jedné koncentraci vyvolávající zákal nebo viditelné sraženiny, neboť sraženina může vést k falešným účinkům. Při koncentraci, kdy vzniká sraženina, je třeba dbát na to, aby sraženina nemohla ovlivňovat provádění zkoušky. Užitečné může být stanovit rozpustnost v kultivačním médiu před pokusem.

22.

Není-li pozorována sraženina nebo omezení cytotoxicity, měla by největší zkušební koncentrace odpovídat 10 mM, 2 mg/ml nebo 2 ?l/ml, podle toho, která z uvedených hodnot je nejnižší (39) (40). Pokud u zkoušené chemické látky není stanoveno její složení, např. u látek s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexních reakčních produktů nebo biologického materiálu (tj. chemické látky s neznámým nebo proměnlivým složením, (UVCB)) (41), přírodních extraktů atd., bude možná muset být při nedostatečné cytotoxicitě nejvyšší koncentrace vyšší (např. 5 mg/ml), aby se zvýšila koncentrace každé ze složek. Je však třeba poznamenat, že u humánních léčivých přípravků se tyto požadavky mohou lišit (42).

Kontroly

23.

V okamžiku každého odběru by měly být použity souběžné negativní kontroly (viz odstavec 16) skládající se ze samotného rozpouštědla v kultivačním médiu, s nimiž se zachází stejným způsobem jako s exponovanými kulturami.

24.

Souběžné pozitivní kontroly jsou nutné pro prokázání schopnosti laboratoře identifikovat mutageny za daných experimentálních podmínek a případně pro prokázání účinnosti exogenního systému metabolické aktivace. Příklady pozitivních kontrol jsou uvedeny v tabulce 1 níže. V odůvodněných případech mohou být k pozitivní kontrole použity jiné látky. Jelikož jsou zkoušky na buňkách savců in vitro za účelem stanovení genetické toxicity dostatečně standardizovány, mohou být provedeny zkoušky s použitím expozice s exogenní metabolickou aktivací a bez exogenní metabolické aktivace za použití pouze pozitivní kontroly vyžadující metabolickou aktivaci. V tomto případě tato reakce jediné pozitivní kontroly prokáže činnost systému metabolické aktivace i citlivost zkušebního systému. Každá pozitivní kontrola by měla být použita při jedné nebo více koncentracích, u nichž se očekává, že poskytnou reprodukovatelný a detekovatelný nárůst oproti pozadí, čímž se prokáže citlivost testovacího systému, a reakce by neměla být narušena cytotoxicitou přesahující limitní hodnoty stanovené v této zkušební metodě (viz odstavec 20).

Tabulka 1

Referenční látky doporučené pro posouzení způsobilosti laboratoře a pro výběr pozitivních kontrol

Stav metabolické aktivace

Lokus

Látka a číslo CAS

Bez vnější metabolické aktivace

Hprt

ethyl-methansulfonát [CAS č. 62-50-0] 1-ethyl-1-nitrosomočovina [CAS č. 759-73-9] 4-nitrochinolin-1-oxid [CAS č. 56-57-5]

 

xprt

streptonigrin [CAS č. 3930-19-6] mitomycin C [CAS č. 50-07-7]

S vnější metabolickou aktivací

Hprt

3-methylcholanthren [CAS č. 56-49-5] 7,12-dimethylbenzoanthracen [CAS č. 57-97-6] Benzo[e]pyren [CAS č. 50-32-8]

 

xprt

Benzo[e]pyren [CAS č. 50-32-8]

POSTUP

Expozice zkoušené chemické látce

25.

Proliferující buňky se vystaví zkoušené chemické látce jak za přítomnosti metabolického aktivačního systému, tak bez něho. Expozice by měla trvat vhodnou dobu (obvykle je postačující doba 3 až 6 hodin).

26.

Minimální počet buněk použitých pro každou zkušební (kontrolní a exponovanou) kulturu v každém stádiu zkoušky by měl vycházet z četnosti spontánních mutací. Obecným pravidlem je exponovat a pasážovat dostatečný počet buněk, aby bylo v každé kultuře uchováno v každé fázi zkoušky 10 spontánních mutantů (17). Četnost spontánních mutací obvykle činí 5 až 20 × 10-6. Aby byl při četnosti spontánních mutací 5 × 10-6 uchován dostatečný počet spontánních mutantů (10 nebo více) i v kulturách exponovaných při koncentracích, které vyvolávají při expozici 90 % cytotoxicitu (10 % relativní přežití), bylo by nutné exponovat alespoň 20 × 106 buněk. Kromě toho musí být v období exprese kultivován a umístěn na destičky pro výběr mutantů dostatečný počet buněk (nikdy však méně než 2 miliony) (17).

Doba exprese fenotypu a měření četnosti mutací

27.

Na konci doby expozice se buňky kultivují za účelem umožnění exprese fenotypu mutanta. Obecně postačí minimálně 7 až 9 dnů, aby došlo k přibližně optimální fenotypové expresi nově indukovaných mutantů Hprt a xprt (43) (44). Během této doby jsou buňky pravidelně subkultivovány, aby se udržely ve fázi exponenciálního růstu. Po fenotypové expresi jsou buňky opět kultivovány v médiu se selekčním činidlem (6-thioguanin) a bez něj za účelem stanovení počtu mutantů, respektive účinnosti klonování v době selekce. Tato kultivace může být provedena pomocí misek u kultur v monovrstvách nebo pomocí mikrotitračních destiček u buněk v suspenzi. Pro selekci mutantů je třeba buňky kultivovat v takové hustotě, aby byla zajištěna optimální obnova mutací (tj. aby nedošlo k metabolické kooperaci) (17). Destičky se inkubují po dobu vhodnou pro optimální růst kolonii (např. 7–12 dnů) a kolonie se spočítají. Četnost mutantů se vypočítá podle počtu mutantních kolonií korigovaného účinností klonování v době selekce mutantů (viz dodatek 2, kde jsou uvedeny vzorce).

Způsobilost laboratoře

28.

Aby bylo možné před zahájením rutinního zkoušení zjistit, zda laboratoř má s danou zkouškou dostatečné zkušenosti, měla by provést sérii experimentů s referenčními pozitivními látkami, jež působí prostřednictvím různých mechanismů (alespoň s jednou látkou účinnou s metabolickou aktivací a jednou účinnou bez metabolické aktivace, které se vyberou ze seznamu látek uvedeného v tabulce 1), a s různými negativními kontrolami (s použitím různých rozpouštědel/vehikul). Odezvy těchto pozitivních a negativních kontrol by měly být v souladu s odbornou literaturou. Tento požadavek neplatí pro laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají k dispozici databázi historických údajů, jak je definována v odstavcích 30 až 33.

29.

Výběr z látek pro pozitivní kontroly (viz tabulka 1 v odstavci 25) by měl být zkoumán bez metabolické aktivace a s metabolickou aktivací, aby byla prokázána způsobilost pro detekci mutagenních chemických látek, stanovení účinnosti systému metabolické aktivace a prokázání vhodnosti podmínek pro růst buněk v průběhu expozice, fenotypovou expresi a selekci mutantů a postupů hodnocení. Rozsah koncentrací by u vybraných látek měl být zvolen tak, aby poskytl opakovatelná zvýšení účinku v závislosti na dávce nad úroveň pozadí, aby se tak prokázala citlivost a dynamické rozpětí testovacího systému.

Historické kontrolní údaje

30.

Laboratoř by měla stanovit:

historické rozmezí a distribuci pozitivních kontrol,

historické rozmezí a distribuci negativních kontrol (neexponovaných, s rozpouštědlem).

31.

Při prvním získávání údajů o historické distribuci negativních kontrol by měly být výsledky souběžných negativních kontrol v souladu s publikovanými kontrolními údaji (22). S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by být souběžné negativní kontroly v ideálním případě uvnitř 95 % kontrolních limitů této distribuce (17) (45) (46).

32.

Nejprve by měla být vybudována historická databáze negativních kontrol dané laboratoře na základě nejméně 10 experimentů, avšak raději by měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek. V laboratořích by měly být uplatňovány metody kontroly kvality, jako např. regulační diagramy (např. C-diagramy nebo diagramy X s pruhem (47)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje o pozitivních a negativních kontrolách a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“ (46). Další doporučení, jak získat a používat historické údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (45).

33.

Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat četnost mutací z jedné kultury nebo raději z replikovaných kultur, jak je popsáno v odstavci 23. Výsledky souběžných negativních kontrol by v ideálním případě měly spadat mezi 95 % kontrolních limitů distribuce v historické databázi negativních kontrol laboratoře (17) (45) (46). Pokud jsou údaje ze souběžných negativních kontrol mimo 95 % rozmezí, může být přijatelné je zahrnout do dosavadní distribuce kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existují důkazy o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz výše), a důkazy o tom, že nedošlo k technické nebo lidské chybě.

34.

Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich souladu se stávající historickou kontrolní databází laboratoře. Jakýkoli větší rozdíl ve zkušebním protokolu by měl vést k zavedení nové historické kontrolní databáze.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Vyjádření výsledků

35.

Předložené výsledky by měly zahrnovat všechny údaje potřebné k výpočtu cytotoxicity (vyjádřené jako relativní přežití). Údaje za exponované i kontrolní kultury by měly zahrnovat počet buněk na konci expozice, počet buněk umístěných na destičky okamžitě po expozici a počet kolonií (nebo počet jamek bez kolonií u mikrotitrační metody). Relativní přežití u každé kultury by mělo být vyjádřeno jako procento ve vztahu k souběžné kontrole s rozpouštědlem (viz dodatek 1, kde jsou uvedeny definice).

36.

Předložené výsledky by měly zahrnovat také všechny údaje potřebné k výpočtu četnosti mutací. Údaje za exponované i kontrolní kultury by měly zahrnovat: 1) počet buněk umístěných na destičky se selekčním činidlem a bez něj (v době, kdy jsou buňky umístěny na destičky pro selekci mutantů) a 2) počet spočtených kolonií (nebo počet jamek bez kolonií u mikrotitrační metody) z destiček se selekčním činitelem a bez něj. Četnost mutací se vypočítá podle počtu mutantních kolonií (na destičkách se selekčním činidlem) korigovaného účinností klonování (z destiček bez selekčního činidla). Četnost mutací by měla být vyjádřena jako počet mutantů na milion životaschopných buněk (viz dodatek 1, kde jsou uvedeny definice).

37.

Měly by se uvést údaje za jednotlivé kultury. Kromě toho se všechny údaje shrnou do tabulky.

Kritéria přijatelnosti

38.

Přijetí zkoušky je založeno na následujících kritériích:

souběžná negativní kontrola je považována za přijatelnou pro přidání do historické databáze negativních kontrol laboratoře, jak je popsáno v odstavci 33,

souběžné pozitivní kontroly (viz odstavec 24) by měly vyvolat odezvy, které jsou slučitelné s odezvami uvedenými v historické databázi pozitivních kontrol, a měly by vyvolat statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou,

test se provede při dvou experimentálních uspořádáních (tj. s metabolickou aktivací a bez ní), pokud jedno z nich nevedlo k pozitivním výsledkům (viz odstavec 25),

analyzovatelný je adekvátní počet buněk a koncentrací (odstavce 25, 26 a 19),

kritéria pro výběr nejvyšší koncentrace jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 20, 21 a 22.

Hodnocení a interpretace výsledků

39.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud v některé ze zkoumaných experimentálních uspořádání:

alespoň jedna ze zkušebních koncentrací vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou,

hodnocení pomocí vhodného trend-testu ukáže závislost tohoto nárůstu na koncentraci,

všechny výsledky jsou mimo distribuci historických údajů o negativních kontrolách (např. mimo 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení, viz odstavec 33).

Jsou-li splněna všechna tato kritéria, má se za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat mutace genů v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze najít v literatuře (46) (48).

40.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, je zkoušená chemická látka považována za jasně negativní, pokud ve všech zkoumaných zkušebních podmínkách:

žádná ze zkušebních koncentrací nevykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou,

hodnocení pomocí vhodného trend-testu ukáže, že nedochází k nárůstu účinku v závislosti na koncentraci,

všechny výsledky spadají do rámce distribuce historických údajů o negativních kontrolách (např. 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení, viz odstavec 33).

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat mutace genů v kultivovaných savčích buňkách v tomto testovacím systému.

41.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odezvy není nutné.

42.

V případech, kdy odezva není ani jasně negativní, ani jasně pozitivní, jak je popsáno výše, nebo s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku, by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším šetřením. Užitečné by mohlo být provedení opakovaného experimentu, případně za použití upravených zkušebních podmínek (např. rozsah koncentrací, jiné podmínky metabolické aktivace (např. koncentrace S9 nebo původ S9).

43.

Ve vzácných případech ani po dalším šetření nebude možné na základě daného souboru údajů dospět k závěru o pozitivitě či negativitě výsledku. Proto by měl být učiněn závěr, že odezva na zkoumanou chemickou látku je neurčitá (interpretováno jako stejná pravděpodobnost pozitivní nebo negativní odezvy).

Závěrečná Zpráva

44.

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

 

Zkoušená chemická látka:

zdroj, číslo šarže a je-li k dispozici, datum použitelnosti,

stabilita zkoušené chemické látky samotné, je-li známa,

rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle, jsou-li známy,

měření pH, případně osmolality a sraženiny v kultivačním médiu, do něhož byla přidána zkoušená chemická látka.

 

Jednosložková látka:

fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.

 

Vícesložková látka, látka s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkt nebo biologický materiál a směsi:

charakterizované v co možná nejvyšší míře chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.

 

Rozpouštědlo:

zdůvodnění volby rozpouštědla,

procentuální podíl rozpouštědla v konečném kultivačním médiu.

 

Buňky:

 

Pro základní laboratorní kultury:

druh a zdroj buněčných linií,

počet pasáží, je-li k dispozici, a historie v laboratoři,

vlastnosti karyotypu a/nebo modální hodnota počtu chromozomů,

metody udržování buněčných kultur,

nepřítomnost mykoplasmat,

doby zdvojnásobení buněk.

 

Zkušební podmínky:

odůvodnění výběru koncentrací a počtu kultur, včetně např. údajů o cytotoxicitě a mezích rozpustnosti,

složení média, koncentrace CO2, vlhkost,

koncentrace zkoušené chemické látky vyjádřená jako konečná koncentrace v kultivačním médiu (např. v ?g nebo mg/ml nebo mM kultivačního média),

koncentrace (a/nebo objem) rozpouštědla a zkoušené chemické látky přidaných do kultivačního média,

inkubační teplota,

inkubační doba,

trvání expozice,

hustota buněk během expozice,

typ a složení použitého metabolického aktivačního systému (zdroj S9, metoda přípravy

směsi S9, koncentrace nebo objem směsi S9 a S9 v konečném kultivačním médiu, kontroly jakosti S9),

látky použité v pozitivních a negativních kontrolách, konečné koncentrace pro jednotlivé podmínky expozice,

délka doby exprese (případně včetně počtu nasazených buněk, subkultur a výměny média),

identifikace selekčního činidla a jeho koncentrace,

kritéria přijatelnosti zkoušek,

metody použité k počítání životaschopných a mutantních buněk;

metody použité pro měření cytotoxicity,

jakékoli doplňkové informace týkající se cytotoxicity a použité metody,

délka inkubace po umístění na destičky;

kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo neurčitou;

metody použité ke stanovení pH, osmolality a sraženiny.

 

Výsledky:

počet exponovaných buněk a počet subkultivovaných buněk v každé kultuře,

měření cytotoxicity, případně další pozorování,

známky srážení a čas jejich stanovení,

počet buněk kultivovaných v selektivním a neselektivním médiu;

počet kolonií v neselektivním médiu a počet rezistentních kolonií v selektivním médiu a související četnosti mutací,

závislost účinku na koncentraci, pokud je to možné,

údaje o souběžných negativních kontrolách (rozpouštědlo) a pozitivních kontrolách (koncentrace a rozpouštědla),

historické údaje o negativních (rozpouštědlo) a pozitivních kontrolách s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami a interval spolehlivosti (např. 95 %) a rovněž počet údajů,

statistické analýzy (pro jednotlivé kultury, případně spojené repliky) a případné p hodnoty.

 

Diskuse o výsledcích.

 

Závěr

LITERATURA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)

Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci. Sci., USA, 61, 1306-1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)

Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24):9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)

UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Dostupné na internetových stránkách: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina C? Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91–103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen. 5, 795-801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). K dispozici na požádání u Organizace pro hospodářskou spolupráci a rozvoj.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Dostupné na internetových stránkách: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Dodatek 1

DEFINICE

Mutageny substituce párů bází: chemické látky, které způsobují substituci párů bází v DNA.

Chemická látka: látka nebo směs.

Účinnost klonování: procento buněk kultivovaných v nízké hustotě, které jsou schopny se rozrůst do kolonií, jež mohou být spočítány.

Koncentrace: odkazuje na konečné koncentrace zkoušené chemické látky v kultivačním médiu.

Cytotoxicita: u zkoušek prováděných podle této zkušební metody se cytotoxicita vyjadřuje jako snížení relativního přežití exponovaných buněk v porovnání s negativní kontrolou (viz zvláštní odstavec).

Přímá mutace: genová mutace výchozího typu mutované formy, která způsobuje změnu nebo ztrátu enzymatické aktivity kódovaných bílkovin.

Posunové mutageny: chemické látky, které způsobují adici nebo deleci jednoho nebo více párů bází v molekule DNA.

Genotoxický: obecný termín zahrnující všechny typy poškození DNA nebo chromozomů včetně jejich rozlámání, aduktů, přestavby, mutací, chromozomálních aberací a aneuploidie. Ne všechny druhy genotoxických účinků způsobují mutace nebo stálé poškození chromozomů.

HAT médium: médium obsahující hypoxanthin, aminopterin a thymidin, které se používá na čištění mutantů Hprt.

Mitotická rekombinace: rekombinace mezi homologními chromatidami v průběhu mitózy, v jejímž důsledku může dojít k vyvolání zlomů dvojvláken DNA nebo ke ztrátě heterozygotnosti.

MPA médium: médium obsahující xanthin, adenin, thymidin, aminopterin a kyselinu mykofenolovou, které se používá na čištění mutantů Xprt.

Mutagenní: produkující dědičné změny sekvence (sekvencí) párů bází DNA v genech nebo struktury chromozomů (chromozomové aberace).

Četnost mutací: počet pozorovaných kolonií mutací dělený počtem buněk kultivovaných v selektivním médiu, korigovaný účinností klonování (nebo životaschopností) v době selekce.

Doba exprese fenotypu: doba po expozici, během níž v genomu vznikne genetická změna a všechny dříve existující genové produkty vymizí do té míry, že se změní fenotypová vlastnost.

Relativní přežití: relativní přežití se používá jako míra cytotoxicity související s expozicí. Relativní přežití je účinnost klonování buněk umístěných na destičky okamžitě po expozici, upravené podle případné ztráty buněk v průběhu expozice v porovnání s upravenou účinností klonování u negativních kontrol (s přiřazeným přežitím 100 %).

Jaterní frakce S9: supernatant homogenátu jater po odstředění při 9 000 g, tj. surový jaterní extrakt.

Směs S9: směs jaterní frakce S9 a kofaktorů nezbytných pro metabolickou aktivaci enzymů.

Kontrola s rozpouštědlem: obecný termín k označení kontrolních kultur, ke kterým se přidává pouze rozpouštědlo používané k rozpuštění zkoušené chemické látky.

Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

Neexponovaná kontrola: kultury, které se neexponují (tj. ani chemické látce, ani rozpouštědlu), ale zpracovávají se souběžně stejným způsobem jako kultury, k nimž se přidává zkoušená chemická látka.

UVCB: Chemické látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologický materiál.

Dodatek 2

VZORCE PRO STANOVENÍ CYTOTOXICITY A ČETNOSTI MUTACÍ

Cytotoxicita se hodnotí podle relativního přežití, tj. podle účinnosti klonování (CE) buněk umístěných na destičky okamžitě po expozici, upravené podle případné ztráty buněk v průběhu expozice v porovnání s upravenou účinností klonování u negativních kontrol (s přiřazeným přežitím 100 %) (viz vzorec pro relativní přežití níže).

Upravená účinnost klonování u kultury exponované zkoušené chemické látce se vypočítá jako:

Formula

Relativní přežití (RS) u kultury exponované zkoušené chemické látce se vypočítá jako:

Formula

Četnost mutací je účinnost klonování kolonií mutací v selektivním médiu děleno účinností klonování v neselektivním médiu, měřená u stejné kultury v době selekce.

Formula

Když se pro účinnost klonování používají destičky:

CE = počet kolonií / počet buněk umístěných na destičky.

Když se pro účinnost klonování používají mikrotitrační destičky:

Počet kolonií na jamku v mikrotitračních destičkách odpovídá Poissonovu rozdělení.

Účinnost klonování = –ln P(0) / počet buněk na jamku,

kde –ln P(0) je pravděpodobný počet prázdných jamek z počtu jamek s nasazenými buňkami a popisuje se tímto vzorcem:

ln P(0)= –ln (počet prázdných jamek / počet jamek s buňkami)

(3)

V části B se kapitola B.22 nahrazuje tímto:

„B.22   DOMINANTNÍ LETÁLNÍ ZKOUŠKA NA HLODAVCÍCH

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 478 (2016). Zkušební metody se pravidelně přezkoumávají s ohledem na vědecký pokrok, měnící se potřeby regulace a dobré životní podmínky zvířat. Tato upravená verze zkušební metody odráží více než třicet let zkušeností s touto zkouškou a možnost integrovat nebo sloučit tuto zkoušku s jinými zkouškami toxicity, jako jsou studie vývojové toxicity, studie reprodukční toxicity nebo studie genotoxicity; avšak vzhledem k omezením této zkoušky a používání velkého počtu zvířat není zkouška určena pro použití jako hlavní metoda, ale spíše jako doplňková zkušební metoda, kterou lze použít pouze v případě, že regulatorní požadavky nelze splnit alternativním způsobem. Kombinování zkoušek toxicity může ušetřit použití velkého počtu zvířat na zkoušky toxicity. OECD vypracovala dokument, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které OECD provedla ve svých pokynech ke zkoušení genotoxicity (1).

2.

Účelem zkoušky dominantní letality (DL) je zkoumat, zda chemické látky vytvářejí mutace vznikající z chromozomových aberací v zárodečných buňkách. Zkouška dominantní letality je dále zvláště významná k posouzení genotoxicity, neboť zde probíhají procesy aktivního metabolismu in vivo, farmakokinetiky a reparace DNA, které přispívají k účinku testované látky, jakkoli mohou být různé u různých druhů. Indukce dominantních letálních mutací po expozici zkoušené chemické látce naznačuje, že tato chemická látka poškozuje zárodečné tkáně zkušebního zvířete.

3.

Dominantní letální mutace způsobují embryonální nebo fetální smrt. Indukce dominantních letálních mutací po expozici zkoušené chemické látce naznačuje, že tato chemická látka poškozuje zárodečné buňky zkušebního zvířete.

4.

Zkouška dominantní letality je užitečná pro potvrzení pozitivních výsledků zkoušek používajících somatické sledované vlastnosti in vivo a je významnou sledovanou vlastností pro predikci nebezpečnosti pro člověka a rizika genetických onemocnění přenášených prostřednictvím zárodečných buněk. Tato zkouška však vyžaduje velký počet zvířat a je velmi pracná; proto je velmi nákladná a časově náročná na provedení. Protože je spontánní četnost dominantních letálních mutací celkem vysoká, je citlivost zkoušky na detekci malých nárůstů četnosti mutací obvykle omezená.

5.

Definice nejdůležitějších termínů jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

6.

Zkouška se nejčastěji provádí na myších (2) (3) (4), avšak v některých případech, je-li to vědecky zdůvodněno, mohou být vhodné i jiné druhy, například potkani (5) (6) (7) (8). Dominantní letalita je obecně výsledkem velkých chromozomových aberací (strukturálních a numerických abnormalit) (9) (10) (11), ale nelze vyloučit ani genové mutace. Dominantní letální mutace je mutace vyskytující se v zárodečné buňce jako taková nebo vzniká po oplodnění v raném embryu, nepůsobí dysfunkci gamety, ale je letální pro oplodněné vajíčko nebo vyvíjející se embryo.

7.

Jednotliví samci jsou ve vhodných intervalech opakovaně kříženi s dosud nepřipuštěnými samicemi. Počet páření po expozici závisí na konečném účelu studie dominantní letality (odstavec 23) a měl by zajišťovat, aby byla dominantní letalita hodnocena ve všech stádiích zrání samčích zárodečných buněk (12).

8.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená chemická látka nebo její metabolit (metabolity) nedostanou do varlat, není vhodné tuto zkoušku použít.

PRINCIP ZKOUŠKY

9.

Samci jsou zpravidla vhodnou cestou exponováni zkoušené chemické látce a pářeni s neexponovanými, dosud nepřipuštěnými samicemi. Různé druhy zárodečných buněk mohou být testovány použitím po sobě jdoucích intervalů páření. Po páření se samice po uplynutí vhodné doby utratí a obsah dělohy se vyšetří za účelem určení počtu implantací a živých a mrtvých embryí. Dominantní letalita zkoušené chemické látky se stanoví porovnáním počtu živých implantací na samici v exponované skupině s počtem živých implantací na samici v kontrolní skupině vehikulum/rozpouštědlo. Nárůst mrtvých implantací na samici v exponované skupině nad počet mrtvých implantací na samici v kontrolní skupině odpovídá postimplantačním ztrátám indukovaným zkoušenou chemickou látkou. Postimplantační ztráty se vypočítají stanovením poměru mrtvých implantací k celkovým implantacím v exponované skupině v porovnání s poměrem mrtvých implantací k celkovým implantacím v kontrolní skupině. Preimplantační ztráty lze odhadnout porovnáním počtu žlutých tělísek minus celkový počet implantací nebo porovnáním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupině.

OVĚŘENÍ ODBORNÉ ZPŮSOBILOSTI LABORATOŘE

10.

Způsobilost pro tuto zkoušku by měla být stanovena na základě doložení schopnosti reprodukovat četnost dominantní letality ze zveřejněných údajů (např. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) s látkami pozitivní kontroly (včetně slabých reakcí), např. s látkami uvedenými v tabulce 1, a kontrolami vehikula a získáním četností negativní kontroly, které odpovídají přijatelnému rozpětí údajů (viz výše uvedené odkazy) nebo dosavadní distribuci kontrol v laboratoři, je-li k dispozici.

POPIS METODY

Příprava

Výběr zvířecích druhů

11.

Měly by být použity běžně používané laboratorní kmeny zdravých pohlavně dospělých zvířat. Běžně se používá myš, ale vhodný může být také potkan. Použit může být i jakýkoli jiný vhodný druh savce, je-li ve zprávě poskytnuto vědecké zdůvodnění.

Podmínky chovu a krmení zvířat

12.

Teplota v místnosti pro zvířata by u hlodavců měla být 22 oC (± 3 oC). Relativní vlhkost vzduchu by v ideálním případě měla být 50–60 %, ale minimálně 40 %, a neměla by pokud možno přesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr druhu potravy může být ovlivněn její dostatečnou mísitelností se zkoušenou chemickou látkou, je-li látka podávána tímto způsobem. Před expozicí nebo pářením by hlodavci měli být chováni v malých skupinách (nejvýše po pěti) téhož pohlaví, pokud se nepředpokládá nebo není pozorováno agresivní chování, přednostně v pevných klecích s vhodnou úpravou prostředí. Je-li to z vědeckého hlediska důvodné, mohou být zvířata v klecích individuálně.

Příprava zvířat

13.

Zdraví a pohlavně zralí samci a dospělé samice se náhodným výběrem rozdělí na kontrolní skupinu a skupinu, která se exponuje. Jednotlivá zvířata se jednoznačně identifikují humánní, co nejméně invazivní metodou (např. kroužkováním, označením štítkem, pomocí mikročipu nebo biometrické identifikace, avšak nikoli nastřihnutím prstu dolní končetiny nebo ucha) a nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Mělo by se zabránit vzájemné kontaminaci pozitivní kontroly a zkoušené chemické látky. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by u obou pohlaví překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti.

Příprava dávek

14.

Pevné zkoušené chemické látky by se měly rozpustit nebo suspendovat ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech nebo by měly být přimíchány do potravy nebo pitné vody před podáním dávky zvířatům. Kapalné zkoušené chemické látky mohou být podávány přímo nebo se před podáním zředí. Pro účely expozice inhalací lze zkoušené chemické látky v závislosti na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech podávat jako plyn, páru nebo pevný/kapalný aerosol. Používat by se měla čerstvě připravená zkoušená chemická látka, pokud údaje o stabilitě neprokazují možnost skladování a nestanoví vhodné podmínky pro skladování.

Zkušební podmínky

Rozpouštědlo/vehikulum

15.

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých objemech dávek toxické účinky a mělo by být vyloučeno podezření, že reaguje se zkoušenou chemickou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného rozpouštědla/vehikula. Jako příklad běžně používaných kompatibilních rozpouštědel/vehikul lze uvést vodu, fyziologický roztok, roztok methylcelulózy, roztok sodné soli karboxymethylcelulózy, olivový olej a kukuřičný olej.

Pozitivní kontroly

16.

Pokud laboratoř neprokáže způsobilost k provádění zkoušky a nepoužívala zkoušku rutinně v nedávné minulosti (např. v posledních 5 letech), měla by být vždy používána zvířata pro souběžné pozitivní kontroly. Zvířata v pozitivní kontrolní skupině však nemusí být exponována stejným způsobem jako zvířata, kterým je podávána zkoušená chemická látka, a vzorky u nich nemusí být odebírány při všech intervalech páření. Látky používané pro pozitivní kontrolu by měly prokazatelně vyvolávat dominantní letalitu za podmínek používaných pro tuto zkoušku. S výjimkou expozice by měla zvířata kontrolní skupiny podstoupit identický proces jako zvířata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.

17.

Dávky pozitivních kontrolních látek by měly být vybrány tak, aby vyvolaly slabé nebo mírné účinky, které nejlépe dokládají správné provedení a citlivost zkoušky, ale které soustavně vyvolávají pozitivní dominantní letální účinky. Příklady pozitivních kontrolních látek a vhodných dávek jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Příklady látek pro pozitivní kontroly

Látka [č. CAS]

(referenční č.)

Rozpětí efektivní dávky (mg/kg)

(druhy hlodavců)

Délka podávání (dny)

triethylenmelamin [51-18-3] (15)

0,25 (myš)

1

cyklofosfamid [50-18-0] (19)

50–150 (myš)

5

cyklofosfamid [50-18-0] (5)

25–100 (potkan)

1

ethyl-methansulfonát [62-50-0] (13)

100–300 (myš)

5

monomer akrylamidu [79-06-1] (17)

50 (myš)

5

chlorambucil [305-03-3] (14)

25 (myš)

1

Negativní kontroly

18.

Součástí každého odběru vzorků by měla být negativní kontrolní zvířata, jimž je aplikováno pouze rozpouštědlo nebo vehikulum, ale jinak se s nimi zachází stejně jako s experimentálními skupinami (20). Nejsou-li k dispozici historické nebo zveřejněné kontrolní údaje, které by ukazovaly, že vybrané rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné dominantní letální nebo jiné zhoubné účinky, měla by být do každého odběru vzorků zahrnuta neexponovaná kontrolní zvířata pro posouzení účinku vehikula.

POSTUP

Počet zvířat

19.

Jednotliví samci jsou ve vhodně stanovených intervalech (např. týdenní intervaly, odstavce 21 a 23) opakovaně kříženi nejlépe s jednou dosud nepřipuštěnou samicí. Počet samců ve skupině by měl být stanoven předem tak, aby stačil (v kombinaci s počtem připuštěných samic v každém intervalu páření) k dosažení statistické síly nezbytné pro zjištění nejméně zdvojnásobení četnosti dominantní letality (odstavec 44).

20.

Také počet samic na jeden interval páření by měl být podle výpočtů statistické síly stanoven předem tak, aby umožnil zjištění nejméně dvojnásobné četnosti dominantní letality (tj. dostatečný počet březích samic, aby bylo možné získat alespoň 400 implantací celkem) (20) (21) (22) (23) a aby bylo možné očekávat alespoň jeden mrtvý zárodek na jednu jednotku analýzy (tj. skupina páření na jednu dávku) (24).

Doba podávání a intervaly páření

21.

Počet intervalů páření po expozici se řídí plánem expozice a je třeba zajistit, aby byla hodnocena indukce dominantní letality ve všech fázích dozrávání samčích zárodečných buněk (12) (25). U jednorázového podání maximálně 5 denních dávek je třeba, aby došlo k 8 (myš) nebo 10 (potkan) páření v týdenních intervalech po poslední expozici. U podání většího počtu dávek se může počet intervalů páření snížit poměrně k delší době podávání, je však třeba zachovat cíl hodnocení všech fází spermatogeneze (např. po 28denní expozici postačí pouze 4 páření jednou týdně, aby bylo možné vyhodnotit všechny fáze spermatogeneze u myší). Všechny plány expozice a páření by měly být vědecky zdůvodněny.

22.

Samice musí být u samců ponechány nejméně po dobu trvání jednoho estrálního cyklu (např. jeden týden zahrnuje jeden estrální cyklus u myší i potkanů). Samice, které se nepářily v týdenním intervalu, lze použít pro následující interval páření. Nebo dokud nedojde ke spáření prokázanému spermiemi ve vagíně nebo přítomností vaginální zátky.

23.

Použitý režim expozice a páření závisí na konečném účelu studie dominantní letality. Jestliže je cílem stanovit, zda daná chemická látka indukuje dominantní letální mutace jako takové, vhodnou metodou je expozice po celý cyklus spermatogeneze (např. 7 týdnů u myší, 5–7 expozicí týdně) a jedno páření na konci. Jestliže je však cílem identifikovat citlivý typ zárodečných buněk pro indukci dominantní letality, je lepší jednorázová nebo 5denní expozice, po níž následuje jedno páření týdně.

Dávkování

24.

Jestliže se provádí předběžná studie pro stanovení rozsahu dávek, poněvadž nejsou k dispozici vhodné údaje, jež by mohly při stanovení dávek pomoci, pak by měla být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, které se použijí v hlavní studii (26). Cílem studie by mělo být zjistit maximální tolerovanou dávku, která je definována jako nejvyšší dávka, která bude po dobu trvání zkoušky tolerována bez příznaků toxicity omezující studii (např. abnormální chování nebo reakce, menší pokles tělesné hmotnosti nebo cytotoxicity hematopoetického systému), avšak nikoli smrti nebo příznaků bolesti, utrpení nebo strádání, kdy je nezbytné zvířata humánně utratit (27).

25.

Maximální tolerovaná dávka dále nesmí negativně ovlivnit úspěch páření (21).

26.

Zkoušené chemické látky se specifickým biologickým působením při nízkých netoxických dávkách (jako jsou hormony a mitogeny) a chemické látky, které vykazují saturaci toxikokinetických vlastností, mohou představovat výjimky z kritérií stanovení dávek a každý případ by měl být hodnocen individuálně.

27.

Aby bylo možné získat informace o odezvě na dávku, měla by úplná studie zahrnovat negativní kontrolní skupinu a minimálně tři úrovně dávek, které jsou zpravidla odstupňovány faktorem 2, avšak nepřevyšujícím 4. Pokud ve studii ke stanovení rozsahu dávek nebo na základě stávajících údajů zkoušená chemická látka nevyvolává toxicitu, měla by nejvyšší dávka při jednorázovém podávání odpovídat 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti. Pokud však zkoušená chemická látka způsobuje toxicitu, měla by být největší podávanou dávkou maximální tolerovaná dávka a úrovně dávek by měly přednostně pokrývat rozmezí od maximální dávky až po dávku vyvolávající malou toxicitu nebo nevyvolávající žádnou toxicitu. U netoxických chemických látek je limitní dávka 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při době podávání 14 dní nebo delší, nebo 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při dobách podávání kratších než 14 dní.

Podávání dávek

28.

Při plánování zkoušky by měl být zvážen předpokládaný způsob expozice člověka. Proto lze zvolit odůvodněné způsoby expozice např. potravou, v pitné vodě, subkutánně, nitrožilně, lokálně, inhalací, orálně (pomocí žaludeční sondy) nebo implantací. Způsob podávání by měl být v každém případě zvolen tak, aby zajistil odpovídající expozici cílové tkáně (tkání). Intraperitoneální injekce se obvykle nedoporučují, protože se nejedná o předpokládanou cestu expozice člověka, a měly by být použity pouze s konkrétním vědeckým zdůvodněním. Je-li zkoušená chemická látka přimíchána do potravy nebo pitné vody, zejména v případě jednorázové dávky, mělo by se dbát na to, že prodleva mezi příjmem krmiva a vody a pářením by měla být dostatečná, aby umožnila detekci účinků (odstavec 31). Maximální objem kapaliny, který lze najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by obvykle nemělo překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít maximálně 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití větších objemů, než jsou tyto (pokud je povolují právní předpisy o šetrném zacházení se zvířaty), je třeba odůvodnit. Kolísání objemu zkoušené chemické látky by se mělo omezit nastavením koncentrace tak, aby se na všech úrovních dávek zajistil konstantní objem v závislosti na tělesné hmotnosti.

Pozorování

29.

Všeobecné klinické pozorování a záznam klinických příznaků by se měly provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maximálního účinku po podání látky. Nejméně dvakrát denně po dobu podávání dávek by měla být provedena prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Všechna zvířata by měla být zvážena na počátku studie a nejméně jednou týdně během studií s opakovanou dávkou a při utracení. Měření spotřeby potravy by se mělo provádět nejméně jednou týdně. Pokud je zkoušená chemická látka podávána v pitné vodě, měla by se spotřeba vody měřit při každé výměně vody a alespoň jednou týdně. Zvířata, která vykazují neletální indikátory nadměrné toxicity, by měla být utracena před uplynutím doby zkoušky (27).

Odběr a zpracování tkání

30.

Samice se utratí v druhé polovině březosti, v 13. den gestace u myší a v 14.–15. den gestace u potkanů. Dělohy se vyšetří za účelem stanovení dominantních letálních účinků a určí se počet implantací, živých a mrtvých embryí a žlutých tělísek.

31.

Obnaží se děložní rohy a vaječníky za účelem spočítání žlutých tělísek a plody se vyjmou, spočítají a zváží. Dělohy je třeba pečlivě vyšetřit, aby se nepřehlédly resorpce zakryté živými plody a aby bylo zajištěno, že budou všechny resorpce vyčísleny. Zaznamená se fetální mortalita. Dále se zaznamená počet úspěšně oplodněných samic a počet celkových implantací, preimplantačních ztrát a postimplantační mortalita (včetně časných a pozdních resorpcí). Kromě toho mohou být viditelné plody uchovány v Bouinově fixačním roztoku po dobu alespoň 2 týdnů, po nichž se prohlédnou, zda nevykazují větší vnější malformace (28), což poskytne další informace o reprodukčních a vývojových účincích zkoušené látky.

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Zpracování výsledků

32.

Údaje se zpracují v tabulkové formě a uvede se počet připuštěných samců, počet březích samic a počet nezabřezlých samic. Samostatně se uvedou výsledky každého páření, včetně identifikace každého samce a samice. Pro každou samici se uvede interval páření, dávka, kterou obdržel samec, a počet živých a mrtvých implantací.

33.

Postimplantační ztráty se vypočítají stanovením poměru mrtvých implantací k celkovým implantacím z exponované skupiny v porovnání s poměrem mrtvých implantací k celkovým implantacím z kontrolní skupiny vehikulum/rozpouštědlo.

34.

Preimplantační ztráty se vypočítají jako rozdíl mezi počtem žlutých tělísek a počtem implantací nebo jako snížení průměrného počtu implantací na samici ve srovnání s kontrolou. Odhadují-li se také preimplantační ztráty, uvedou se.

35.

Dominantní letální faktor se odhadne jako: (postimplantační úhyn / celkové implantace na samici) × 100.

36.

Měly by být uvedeny údaje o toxicitě a klinických příznacích (podle odstavce 29).

Kritéria přijatelnosti

37.

Přijatelnost zkoušky určují tato kritéria.

Souběžná negativní kontrola odpovídá publikovaným normám pro historické údaje o negativní kontrole a historickým kontrolním údajům laboratoře, jsou-li k dispozici (viz odstavce 10 a 18).

Souběžné pozitivní kontroly vyvolávají odezvy, které jsou v souladu s publikovanými normami pro historické údaje o pozitivní kontrole nebo historickými pozitivními kontrolními údaji laboratoře, jsou-li k dispozici, a vyvolávají statisticky významný nárůst v porovnání s negativní kontrolou (viz odstavce 17 a 18).

Byl analyzován přiměřený počet celkových implantací a dávek (odstavec 20).

Kritéria pro výběr nejvyšší dávky jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 24 a 27.

Hodnocení a interpretace výsledků

38.

Aby byly k dispozici dostatečné údaje pro analýzu vztahu dávky a odezvy, měly by být analyzovány nejméně tři exponované skupiny.

39.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud:

alespoň jedna ze zkoušených dávek vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou,

při hodnocení pomocí vhodného testu je tento nárůst alespoň pro jedno experimentální uspořádání závislý na dávce (např. interval páření jednou týdně), a

všechny výsledky jsou mimo přijatelné rozpětí negativních kontrolních údajů nebo distribuci historických údajů laboratoře o negativních kontrolách (např. mimo 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení), pokud jsou k dispozici.

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat dominantní letální mutace v zárodečných buňkách pokusných zvířat. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod jsou popsána v odstavci 44; v literatuře lze nalézt také další doporučené statistické přístupy (20) (21) (22) (24) (29). Použité statistické testy by měly brát v úvahu zvíře jako experimentální jednotku.

40.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně negativní, pokud:

žádná ze zkušebních dávek nevykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou,

v žádném experimentálním uspořádání neexistuje nárůst v závislosti na dávce, a

všechny výsledky jsou v přijatelném rozpětí negativních kontrolních údajů nebo distribuci historických údajů laboratoře o negativních kontrolách (např. v 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení), pokud jsou k dispozici.

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat dominantní letální mutace v zárodečných buňkách pokusných zvířat.

41.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odezvy se nepožaduje.

42.

Jestliže odezva není jasně negativní nebo pozitivní a s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku (např. slabý nebo okrajový nárůst), údaje by měly být vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším vyšetřením s využitím stávajících experimentálních údajů, jako je skutečnost, zda je pozitivní výsledek mimo přijatelné rozpětí negativních kontrolních údajů nebo historických negativních kontrolních údajů laboratoře (30).

43.

Ve vzácných případech ani po dalším šetření nebude možné na základě daného souboru údajů dospět k závěru o pozitivitě či negativitě výsledku, a bude proto učiněn závěr, že výsledek je neurčitý.

44.

Použité statistické testy by měly brát v úvahu samce jako experimentální jednotku. I když je možné, že údaje o počtech (např. počet implantací na samici) mohou vykazovat Poissonovo rozdělení anebo podíly (např. podíl mrtvých implantací) mohou mít binomické rozdělení, často se stává, že jsou tyto údaje příliš rozptýlené (31). Podobně při statistické analýze by měl být nejprve použit test na nadměrný/nedostatečný rozptyl pomocí takových testů rozptylu, jako je Cochranův binomický test rozptylu (32) nebo Taroneho C(?) test nadměrného binomického rozptylu (31) (33). Není-li zjištěna žádná odchylka od binomického rozptylu, mohou být testovány trendy podílů jednotlivých úrovní dávky pomocí Cochranova-Armitageova trend-testu (34) a párová porovnání s kontrolní skupinou mohou být otestována pomocí Fisherova exaktního testu (35). Podobně, není-li zjištěna žádná odchylka od Poissonova rozptylu, mohou být trendy počtů testovány pomocí Poissonovy regrese (36) a párová porovnání s kontrolní skupinou mohou být otestována v rámci Poissonova modelu s využitím párových kontrastů (36). Je-li zjištěn významný nadměrný nebo nedostatečný rozptyl, doporučují se neparametrické metody (23) (31). Zahrnují pořadové testy, jako jsou Jonckheerův-Terpstrův test trendů (37) a Mannovy-Whitneyovy testy (38) pro párová porovnání s kontrolní skupinou vehikulum/rozpouštědlo, jakož i permutační testy, převzorkování nebo bootstrap testy trendů a párová porovnání s kontrolní skupinou (31) (39).

45.

Pozitivní zkouška dominantní letality poskytuje průkaz genotoxicity zkoušené chemické látky v zárodečných buňkách exponovaného samce pokusného druhu.

46.

Při hodnocení biologického významu odezvy může být vodítkem posouzení, zda jsou zjištěné hodnoty uvnitř nebo vně rozsahu historických kontrolních hodnot (40).

ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

47.

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace.

Shrnutí.

 

Zkoušená chemická látka:

zdroj, číslo šarže, a je-li k dispozici, datum použitelnosti,

stabilita zkoušené chemické látky samotné, je-li známa,

rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle, jsou-li známy,

měření pH, případně osmolality a sraženiny v kultivačním médiu, do něhož byla přidána zkoušená chemická látka.

 

Jednosložková látka:

fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.

 

Vícesložková látka, látka s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkt nebo biologický materiál a směsi:

charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.

 

Příprava zkoušené chemické látky:

zdůvodnění volby vehikula,

rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle/vehikulu, jsou-li známy,

příprava potravy, pitné vody nebo inhalačních aplikačních forem,

analytická stanovení aplikační formy (např. stabilita, homogenita, nominální koncentrace), jsou-li prováděna.

 

Pokusná zvířata:

použitý druh/kmen a odůvodnění výběru,

počet, věk a stáří zvířat,

původ, podmínky chovu, strava atd.,

metoda jednoznačného označení zvířat,

u krátkodobých studií: hmotnost jednotlivých samců na začátku a na konci zkoušky, u studií trvajících déle než jeden týden: hmotnosti jednotlivých zvířat během studie a spotřeba potravy. Mělo by být uvedeno rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnota a směrodatná odchylka pro každou skupinu.

 

Zkušební podmínky:

údaje o pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontrole,

údaje ze studie pro stanovení rozmezí dávek,

zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

podrobnosti o přípravě zkoušené chemické látky,

podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,

zdůvodnění způsobu podávání,

metody zjišťování toxicity, včetně případně histopatologických nebo hematologických analýz a četnosti, s jakou jsou prováděna pozorování zvířat, a četnosti vážení,

metody ověřování, zda se zkoušená chemická látka dostala k cílové tkáni, nebo ověřování obecné cirkulace, pokud byly získány negativní výsledky,

skutečná dávka (v mg na kg tělesné hmotnosti za den) vypočtená z koncentrace zkoušené chemické látky v potravě / pitné vodě (v ppm) a případně ze spotřeby;

podrobnosti o jakosti krmení a vody,

podrobnosti o úpravě klecového prostředí,

podrobný popis harmonogramů expozice a odběru vzorků a odůvodnění výběru konkrétního schématu,

metoda analgeze,

způsob utracení,

postupy izolace a uchovávání tkání,

zdroje a čísla šarží všech sad a chemických činidel (je-li to relevantní),

metody počítání dominantních letálních účinků,

plán páření,

metody průkazu spáření,

doba utracení,

kritéria hodnocení dominantních letálních účinků, včetně žlutých tělísek, implantací, resorpcí a preimplantačních ztrát, živých implantací, mrtvých implantací.

 

Výsledky:

stav zvířat před zkouškou a během zkoušky, včetně známek toxicity,

hmotnosti jednotlivých samců během expozice a období páření,

počet připuštěných samic,

podle možnosti závislost odezvy na dávce,

souběžné a historické údaje o negativní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

údaje o souběžné pozitivní kontrole,

údaje ve formě tabulky o každé samici včetně: počet žlutých tělísek na samici, počet implantací na samici, počet resorpcí a preimplantačních ztrát na samici, počet živých implantací na samici, počet mrtvých implantací na samici, hmotnosti plodů,

výše uvedené údaje shrnuté pro každé období páření a dávku s četností dominantní letality,

použité statistické analýzy a metody.

 

Diskuse o výsledcích.

 

Závěr.

LITERATURA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group „Dominant“ lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11)

Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

(16)

James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, s. 129-156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23)

Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data“, Mutation. Res., 723:87-90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common ?2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. v Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Edss.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Dodatek 1

DEFINICE

Chemická látka: látka nebo směs.

Žluté tělísko: struktura hormonální sekrece vytvořená na vaječníku v místě folikulu, z nějž se uvolnilo vajíčko. Počet žlutých tělísek ve vaječnících odpovídá počtu vajíček, které byly uvolněny z vaječníku.

Dominantní letální mutace: mutace, k níž došlo v zárodečné buňce nebo která vznikla po oplodnění a která působí úmrtí embrya nebo plodu.

Plodnost: počet připuštěných březích samic z počtu připuštěných samic.

Interval páření: doba mezi koncem expozice a pářením exponovaných samců. Kontrolováním tohoto intervalu lze hodnotit účinky chemické látky na různé druhy zárodečných buněk. U myší pářících se v průběhu týdne 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8 po ukončení expozice se měří účinky na sperma, kondenzované spermatidy, kulaté spermatidy, pachyténní spermatocyty, rané spermatocyty, diferencované spermatogonie, diferencující se spermatogonie a spermatogoniální kmenové buňky.

Preimplantační ztráty: rozdíl mezi počtem implantací a počtem žlutých tělísek. Lze je také odhadnout porovnáním všech implantací na samici v exponované a kontrolní skupině.

Postimplantační ztráty: poměr mrtvých implantací v exponované skupině v porovnání s poměrem mrtvých implantací k celkovým implantacím v kontrolní skupině.

Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

UVCB: chemická látka s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkt nebo biologický materiál.

Dodatek 2

NAČASOVÁNÍ SPERMATOGENEZE U SAVCŮ

Image 1

Obr. 1: Srovnání délky (ve dnech) vývoje samčích zárodečných buněk u myší, potkanů a člověka. V průběhu dob vyznačených stínováním nedochází k opravě DNA.

Výše je znázorněno schéma spermatogeneze u myší, potkanů a u člověka (převzato z Adler, 1996). Nediferencované spermatogonie zahrnují: spermatogonie As (single), spermatogonie Ap (paired), a spermatogonie Aal (aligned) (Hess and de Franca, 2008). Spermatogonie As se považují za pravé kmenové buňky, aby tedy bylo možné posoudit účinky na kmenové buňky, musí uplynout alespoň 49 dnů (u myší) mezi poslední injekcí zkoušené chemické látky a pářením.

Odkazy

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

(4)

V části B se kapitola B.23 nahrazuje tímto:

„B.23   ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ ABERACE VE SPERMATOGONIÍCH SAVCŮ

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 483 (2016). Zkušební metody se pravidelně přezkoumávají s ohledem na vědecký pokrok, měnící se potřeby regulace a dobré životní podmínky zvířat. Tato upravená verze zkušební metody odráží mnoho let zkušeností s touto zkouškou a možnost integrovat nebo sloučit tuto zkoušku s jinými studiemi toxicity nebo genotoxicity. Kombinování studií toxicity může snížit počty zvířat používaných na zkoušky toxicity. Tato zkušební metoda je součástí série zkušebních metod genetické toxikologie. OECD vypracovala dokument, který obsahuje stručné informace o zkoušení v oblasti genetické toxikologie a přehled posledních změn, které OECD provedla ve svých pokynech ke zkoušení genotoxicity (1).

2.

Účelem zkoušky na chromozomové aberace ve spermatogoniích savců in vivo je identifikovat takové chemické látky, které způsobují strukturní chromozomové aberace ve spermatogoniích savců (2) (3) (4). Zkouška je dále zvláště významná k posouzení genotoxicity, neboť zde probíhá aktivní metabolismus in vivo, farmakokinetika a procesy reparace DNA, které přispívají k účinku testované látky, jakkoli mohou být různé u různých druhů. Tato zkušební metoda není určena k měření numerických abnormalit; k tomuto účelu se tato zkouška nepoužívá rutinně.

3.

Touto zkouškou se stanovují strukturní chromozomové aberace (chromozomového i chromatidového typu) v dělících se spermatogoniálních zárodečných buňkách a předpokládá se tedy, že tato zkouška poskytne předpověď indukce dědičných mutací v těchto zárodečných buňkách.

4.

Definice nejdůležitějších výrazů jsou uvedeny v dodatku.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

5.

Při této zkoušce jsou běžně používáni hlodavci, avšak v některých případech, je-li to vědecky zdůvodněno, mohou být vhodné i jiné druhy. Standardní cytogenetické preparáty z varlat hlodavců generují mitotické (spermatogonie) a meiotické (spermatocyt) metafáze. Mitotické a meiotické metafáze se identifikují podle morfologie chromozomů (4). Touto cytogenetickou zkouškou in vivo se detekují strukturní chromozomové aberace při mitóze spermatogonií. Jiné cílové buňky nejsou předmětem této zkušební metody.

6.

Pro detekci aberací chromatidového typu ve spermatogoniích by mělo být vyšetřeno první mitotické buněčné dělení, které následuje po expozici, než se tyto aberace přemění při dalším buněčném dělení na aberace chromozomového typu. Další informace z exponovaných spermatocytů lze získat meiotickou chromozomovou analýzou strukturních aberací chromozomového typu v diakinese-metafázi I a metafázi II.

7.

Ve varlatech je přítomna řada generací spermatogonií (5), přičemž tyto různé druhy zárodečných buněk mohou mít různou citlivost na expozici chemické látce. Detekované aberace tedy představují souhrnnou odezvu exponovaných populací spermatogonií. Většinu mitotických buněk v preparátech z varlat tvoří spermatogonie B, které mají buněčný cyklus přibližně 26 hodin (3).

8.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená chemická látka nebo její metabolit (metabolity) nedostanou do varlat, není vhodné tuto zkoušku použít.

PRINCIP ZKUŠEBNÍ METODY

9.

Zvířata jsou obvykle vhodným způsobem exponována zkoušené chemické látce a po vhodné době po expozici utracena. Před utracením se zvířatům podá látka zastavující metafázi (např. kolchicin nebo Colcemid®). Ze zárodečných buněk se poté připraví preparáty chromozomů, obarví se a analyzují se chromozomové aberace metafázujících buněk.

OVĚŘENÍ ODBORNÉ ZPŮSOBILOSTI LABORATOŘE

10.

Způsobilost pro tuto zkoušku by měla být stanovena na základě doložení schopnosti reprodukovat očekávané výsledky četností strukturních chromozomálních aberací ve spermatogoniích s látkami pozitivní kontroly (včetně slabých reakcí), např. s látkami uvedenými v tabulce 1, a získáním četností negativní kontroly, které odpovídají přijatelnému rozpětí kontrolních údajů v publikované literatuře (např. (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) nebo dosavadní distribuci kontrol v laboratoři, je-li k dispozici.

POPIS METODY

Příprava

Výběr zvířecích druhů

11.

Měly by být použity běžně používané laboratorní kmeny zdravých mladých pohlavně dospělých zvířat. Obvykle se používají myší samci; mohou však být použiti i samci jiných vhodných savců, je-li to vědecky zdůvodněno a jestliže to umožňuje provedení této zkoušky ve spojení s jinou zkušební metodou. Vědecké zdůvodnění použití jiných druhů než hlodavců by mělo být uvedeno ve zprávě.

Podmínky chovu a krmení zvířat

12.

Teplota v místnosti pro zvířata by u hlodavců měla být 22 oC (± 3 oC). Relativní vlhkost vzduchu by v ideálním případě měla být 50–60 %, ale minimálně 40 %, a neměla by pokud možno přesáhnout 70 % kromě doby úklidu místnosti. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 hodin světla a 12 hodin tmy. Ke krmení lze použít konvenční laboratorní krmivo s neomezeným přísunem pitné vody. Výběr druhu potravy může být ovlivněn její dostatečnou mísitelností se zkoušenou chemickou látkou, je-li látka podávána tímto způsobem. Hlodavci by měli být chováni v malých skupinách (nejvýše po pěti v každé kleci), pokud se nepředpokládá agresivní chování, přednostně v klecích s pevnou podlahou s vhodnou úpravou prostředí. Je-li to z vědeckého hlediska důvodné, mohou být zvířata v klecích individuálně.

Příprava zvířat

13.

Obvykle se používají zdraví mladí dospělí samci (ve stáří 8–12 týdnů na začátku expozice), kteří se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Jednotlivá zvířata se jednoznačně identifikují humánní, co nejméně invazivní metodou (např. kroužkováním, označením štítkem, pomocí mikročipu nebo biometrické identifikace, avšak nikoli nastřihnutím ucha nebo prstu dolní končetiny) a nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Mělo by se zabránit vzájemné kontaminaci pozitivní kontroly a zkoušené chemické látky. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by překročit ± 20 %.

Příprava dávek

14.

Pevné zkoušené chemické látky by se měly rozpustit nebo suspendovat ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech nebo by měly být přimíchány do potravy nebo pitné vody před podáním dávky zvířatům. Kapalné zkoušené chemické látky mohou být podávány přímo nebo se před podáním zředí. Pro účely expozice inhalací lze zkoušené chemické látky v závislosti na jejich fyzikálně-chemických vlastnostech podávat jako plyn, páru nebo pevný/kapalný aerosol. Používat by se měla čerstvě připravená zkoušená chemická látka, pokud údaje o stabilitě neprokazují možnost skladování a nestanoví vhodné podmínky pro skladování.

Zkušební podmínky - rozpouštědlo/vehikulum

15.

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých úrovních dávek toxické účinky a nemělo by být schopno chemické reakce se zkoušenými chemickými látkami. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodného rozpouštědla nebo vehikula. Jako příklad běžně používaných kompatibilních rozpouštědel/vehikul lze uvést vodu, fyziologický roztok, roztok methylcelulózy, roztok sodné soli karboxymethylcelulózy, olivový olej a kukuřičný olej. Neexistují-li historické nebo publikované kontrolní údaje prokazující, že zvolené atypické rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné strukturní chromozomové aberace a jiné zhoubné účinky, měla by být provedena počáteční studie za účelem stanovení přijatelnosti kontroly s tímto rozpouštědlem/vehikulem.

Pozitivní kontroly

16.

Pokud laboratoř neprokáže způsobilost k provádění zkoušky a nepoužívala zkoušku rutinně v nedávné minulosti (např. v posledních 5 letech), měla by být vždy používána zvířata pro souběžné pozitivní kontroly. Není-li zařazena souběžná pozitivní kontrolní skupina, měly by být v každém experimentu zařazeny hodnotící kontroly (fixované a neobarvené preparáty). Tyto hodnotící kontroly lze získat tak, že se do hodnocení studie zařadí vhodné referenční vzorky, které byly získány a uchovány ze samostatného experimentu s pozitivními kontrolami prováděného pravidelně (např. každých 6–18 měsíců) v laboratoři, kde se provádí daná zkouška; například během testování způsobilosti a poté pravidelně podle potřeby.

17.

Látky pro pozitivní kontrolu by měly spolehlivě vyvolat pozorovatelné zvýšení výskytů buněk se strukturními chromozomovými aberacemi nad spontánní úrovně. Dávky pozitivní kontroly by měly být zvoleny tak, aby byly účinky zřetelné, ale aby hodnotitel okamžitě nezjistil identitu kódovaného preparátu. Příklady pozitivních kontrolních látek jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Příklady látek pro pozitivní kontroly

Látky [č. CAS] (referenční číslo)

cyklofosfamid (cyklofosfamid monohydrát) [CAS č. 50-18-0 (CAS č. 6055-19-2)] (9)

cyklohexylamin [CAS č. 108-91-8] (7)

mitomycin C [CAS č. 50-07-7] (6)

monomer akrylamidu [CAS 79-06-1] (10)

triethylenmelamin [CAS 51-18-3] (8)

Negativní kontroly

18.

Součástí každého odběru vzorků by měla být negativní kontrolní zvířata, jimž je aplikováno pouze rozpouštědlo nebo vehikulum, ale jinak se s nimi zachází stejně jako s experimentálními skupinami. Nejsou-li k dispozici historické nebo zveřejněné kontrolní údaje, které by ukazovaly, že vybrané rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné chromozomové aberace nebo jiné zhoubné účinky, měla by být do každého odběru vzorků zahrnuta neexponovaná kontrolní zvířata pro posouzení účinku vehikula.

POSTUP

Počet zvířat

19.

Velikost skupin při zahájení studie by měla být stanovena tak, aby poskytla minimálně pět samců na skupinu. Tento počet zvířat na skupinu se považuje za dostatečný k dosažení adekvátní statistické síly (tj. obvykle takové, aby bylo možno zjistit nejméně zdvojnásobení četnosti chromozomových aberací, když je úroveň negativní kontroly 1,0 % nebo více, s 80 % pravděpodobností na hladině spolehlivosti 0,05) (3) (11). Určitým vodítkem pro typické maximální požadavky na počet zvířat může být, že studie při dvou odběrech se třemi skupinami exponovanými dávce a s jednou souběžnou negativní kontrolní skupinou plus jednou pozitivní kontrolní skupinou (každá složena z pěti zvířat na skupinu) by vyžadovala 45 zvířat.

Plán expozice

20.

Zkoušené chemické látky jsou zpravidla podávány jednorázově (tj. při jedné expozici); mohou být použity i jiné režimy dávkování za předpokladu, že jsou vědecky odůvodněné.

21.

Ve skupině s nejvyšší dávkou by měly být po expozici provedeny dva odběry. Poněvadž doba nezbytná pro příjem a metabolismus zkoušené chemické látky (látek) a rovněž pro účinky na kinetiku buněčného cyklu může mít vliv na optimální časový interval pro detekci chromozomových aberací, provede se jeden časný odběr a jeden pozdější odběr přibližně 24 hodin a 48 hodin po expozici. V případě jiné než nejvyšší dávky by měl být časný odběr proveden po 24 hodinách (v době kratší nebo rovnající se buněčnému cyklu spermatogonie B, což umožňuje optimalizovat pravděpodobnost hodnocení prvních metafází po expozici) po expozici, pokud není známa a odůvodněna jiná vhodnější doba.

22.

Odběry mohou být provedeny také v jiné době. Například v případě chemických látek, které mohou způsobovat S-nezávislé účinky, mohou být vhodnější časnější odběry (tj. po méně než 24 hodinách).

23.

Může být použit režim opakované aplikace dávky, například ve spojení se zkouškou jiné sledované vlastnosti, který používá podávání po dobu 28 dnů (např. zkušební metoda B.58); bylo by však potřeba použít další skupiny zvířat, aby vyhovovaly různým dobám odběru vzorků. Vhodnost takového plánu pak musí být vědecky odůvodněna případ od případu.

24.

Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně podá vhodná dávka chemické látky zastavující metafázi (např. Colcemid® nebo kolchicin). Poté se po vhodné době provede u zvířat odběr. U myší a potkanů je tato doba přibližně 3–5 h.

Dávkování

25.

Provádí-li se předběžná studie ke stanovení rozsahu dávek, poněvadž ještě nejsou k dispozici vhodné údaje, které by mohly pomoci při stanovení dávek, měla by podle doporučení k provádění studií ke stanovení rozsahu dávek být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem a za stejného režimu expozice, které se použijí v hlavní studii (12). Cílem této studie by mělo být zjistit maximální tolerovanou dávku (MTD), která je definována jako dávka vyvolávající slabé toxické účinky po dobu trvání zkoušky (například nenormální chování nebo reakce, menší pokles tělesné hmotnosti nebo cytotoxicita hematopoetického systému), nikoli však smrt nebo důkazy o bolesti, utrpení nebo strádání vyžadující utracení zvířat (13).

26.

Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka vyvolávající ve spermatogoniích některé známky toxicity (např. snížení počtu spermatogonií v mitóze vzhledem k první a druhé meiotické metafázi). Toto snížení by nemělo překročit 50 %.

27.

Zkoušené chemické látky se specifickým biologickým působením při nízkých netoxických dávkách (jako jsou hormony a mitogeny) a chemické látky, které vykazují saturaci toxikokinetických vlastností, mohou představovat výjimky z kritérií stanovení dávek a každý případ by měl být hodnocen individuálně.

28.

Aby bylo možné získat informace o odezvě na dávku, měla by úplná studie zahrnovat negativní kontrolní skupinu (odstavec 18) a minimálně tři úrovně dávek, které jsou zpravidla odstupňovány faktorem 2, avšak nepřevyšujícím 4. Pokud ve studii ke stanovení rozsahu dávek nebo na základě stávajících údajů zkoušená chemická látka nevyvolává toxicitu, měla by nejvyšší dávka při jednorázovém podávání odpovídat 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti. Pokud však zkoušená chemická látka způsobuje toxicitu, měla by být největší podávanou dávkou maximální tolerovaná dávka a úrovně dávek by měly přednostně pokrývat rozmezí od maximální dávky až po dávku vyvolávající malou toxicitu nebo nevyvolávající žádnou toxicitu. Je-li toxicita pro cílovou tkáň (tj. varlata) pozorována na všech testovaných úrovních dávek, doporučuje se další studie s netoxickými dávkami. Studie, jejichž cílem je úplnější charakteristika kvantitativních informací o dávce a odezvě, mohou vyžadovat zařazení doplňkových skupin zvířat exponovaných dalším dávkám. Pro některé typy zkoušených chemických látek (např. humánních léčivých přípravků), na něž se vztahují specifické požadavky, se tyto limity mohou lišit. Pokud zkoušená chemická látka vyvolává toxicitu, měla by být zvolena limitní dávka plus dvě nižší dávky (jak je popsáno výše). Limitní dávka je 1 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při době podávání 14 dní, nebo delší nebo 2 000 mg/kg tělesné hmotnosti/den při dobách podávání kratších než 14 dní.

Podávání dávek

29.

Při plánování zkoušky by měl být zvážen předpokládaný způsob expozice člověka. Proto lze zvolit odůvodněné způsoby expozice např. potravou, v pitné vodě, lokálně, subkutánně, nitrožilně, orálně (pomocí žaludeční sondy), inhalací nebo implantací. Způsob podávání by měl být v každém případě zvolen tak, aby zajistil odpovídající expozici cílové tkáně. Intraperitoneální aplikace se většinou nedoporučuje, pokud to není vědecky odůvodněno, protože to obvykle není fyziologicky relevantní způsob expozice člověka. Je-li zkoušená chemická látka přimíchána do potravy nebo pitné vody, zejména v případě jednorázové dávky, mělo by se dbát na to, že prodleva mezi příjmem krmiva a vody a odběrem vzorku by měla být dostatečná, aby umožnila detekci účinků (viz odstavec 33). Maximální objem kapaliny, který lze najednou podat žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti pokusného zvířete. Toto množství by obvykle nemělo překročit 1 ml/100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kde lze použít maximálně 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití větších objemů, než jsou tyto (pokud je povolují právní předpisy o šetrném zacházení se zvířaty), je třeba odůvodnit. Kolísání objemu zkoušené chemické látky by se mělo omezit nastavením koncentrace tak, aby se zajistil konstantní objem v závislosti na tělesné hmotnosti na všech úrovních dávek.

Pozorování

30.

Všeobecné klinické pozorování pokusných zvířat a záznam klinických příznaků by se měly provádět nejméně jednou denně, přednostně ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maximálního účinku po podání látky. Nejméně dvakrát denně by měla být provedena prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Všechna zvířata by měla být zvážena na počátku studie, nejméně jednou týdně během studií s opakovanou dávkou a při utracení. Při studiích s alespoň týdenním trváním by se alespoň jednou týdně měla změřit spotřeba krmiva. Pokud je zkoušená chemická látka podávána v pitné vodě, měla by se spotřeba vody měřit při každé výměně vody a alespoň jednou týdně. Zvířata, která vykazují neletální indikátory nadměrné toxicity, by měla být utracena před uplynutím doby zkoušky (13).

Příprava preparátů pro analýzu chromosomů

31.

Ihned po usmrcení se z jednoho nebo obou varlat získá suspenze zárodečných buněk, hypotonizuje se a fixuje podle stanovených protokolů (např. (2) (14) (15)). Poté se nanese na podložní sklíčka a obarví se (16) (17). Všechna sklíčka by měla být zakódována, aby hodnotitel neznal jejich identifikaci.

Analýza

32.

U každého zvířete by mělo být posouzeno alespoň 200 buněk v dobře rozprostřené metafázi (3) (11). Jestliže je historická četnost negativních kontrol < 1 %, mělo by být posouzeno více než 200 buněk / zvíře, aby se zvýšila statistická síla (3). Používat by se měly takové metody barvení, které umožňují identifikaci centromery.

33.

Chromozomové a chromatidové aberace by měly být zaznamenávány odděleně a klasifikovány podle podtypů (zlomy, výměny). Při stanovení, zda chemická látka indukuje významné navýšení výskytu buněk s chromozomovými aberacemi, se zaznamenají gapy, ale neberou se v úvahu. Postupy používané v laboratoři by měly zajistit, aby analýzu chromozomových aberací prováděli dobře odborně připravení hodnotitelé. Vzhledem k tomu, že při přípravě preparátů často dochází k poškození části buněk v metafázi s následnou ztrátou chromozomů, měly by vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu nejméně 2n± 2, kde n je haploidní počet chromozomů pro daný druh.

34.

I když je účelem zkoušky detekovat strukturní chromozomové aberace, je důležité zaznamenat četnost polyploidních buněk a buněk s endoreduplikovanými chromozomy, pokud jsou tyto jevy pozorovány (viz odstavec 44).

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Zpracování výsledků

35.

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. Pro každé zvíře by měl být vyhodnocen počet buněk se strukturními chromozomovými aberacemi a počet chromozomových aberací na buňku. Chromatidové a chromozomové aberace klasifikované podle podtypů (zlomy, výměny) by měly být uvedeny odděleně spolu s jejich počty a četností v experimentálních a kontrolních skupinách. Gapy se zaznamenávají zvlášť. Četnost výskytu gapů se zaznamenává, ale do analýzy celkové četnosti strukturních chromozomových aberací se nezahrnuje. Zaznamená se procentuální podíl polyploidie a/nebo endoreduplikovaných chromozomů, pokud jsou pozorovány.

36.

Měly by být uvedeny údaje o toxicitě a klinických příznacích (podle odstavce 30).

Kritéria přijatelnosti

37.

Přijatelnost zkoušky určují tato kritéria.

Souběžná negativní kontrola odpovídá publikovaným normám pro historické údaje o negativní kontrole, které by obvykle měly být > 0 % a ? 1,5 % buněk s chromozomovými aberacemi, a historickým kontrolním údajům laboratoře, jsou-li k dispozici (viz odstavce 10 a 18).

Souběžné pozitivní kontroly vyvolávají odezvy, které odpovídají publikovaným normám pro historické údaje o pozitivní kontrole a historickým pozitivním kontrolním údajům laboratoře, jsou-li k dispozici, a vyvolávají statisticky významný nárůst v porovnání s negativní kontrolou (viz odstavce 17, 18).

Byl analyzován přiměřený počet buněk a dávek (viz odstavce 28 a 32).

Kritéria pro výběr nejvyšší dávky jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 25 a 26.

38.

Je-li pozorována mitóza i meióza, měl by být jako míra cytotoxicity stanoven u všech exponovaných zvířat a zvířat sloužících jako negativní kontrola poměr spermatogonií v mitóze vzhledem k první a druhé meiotické metafázi, a to v celkovém vzorku 100 dělících se buněk na jedno zvíře. Pokud je sledována pouze mitóza, nejméně v 1 000 buňkách na zvíře by měl být stanoven mitotický index.

Hodnocení a interpretace výsledků

39.

Aby byly k dispozici dostatečné údaje pro analýzu vztahu dávky a odezvy, měly by být analyzovány nejméně tři exponované skupiny.

40.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud:

alespoň jedna ze zkoušených dávek vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou,

nárůst je závislý na dávce alespoň při jednom odběru vzorků, a

všechny výsledky jsou mimo přijatelné rozpětí negativních kontrolních údajů nebo distribuci historických údajů laboratoře o negativních kontrolách (např. mimo 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení), pokud jsou k dispozici.

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat chromozomové aberace ve spermatogoniích pokusných zvířat. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze též najít v literatuře (11) (18). Použité statistické testy by měly brát v úvahu zvíře jako experimentální jednotku.

41.

Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně negativní, pokud:

žádná ze zkušebních dávek nevykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou,

v žádném experimentálním uspořádání neexistuje nárůst v závislosti na dávce, a dále

všechny výsledky jsou v přijatelném rozpětí negativních kontrolních údajů nebo distribuci historických údajů laboratoře o negativních kontrolách (např. v 95 % rozmezí dle Poissonova rozdělení), pokud jsou k dispozici.

Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat chromozomové aberace ve spermatogoniích pokusných zvířat. Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze též najít v literatuře (11) (18). Negativní výsledek nevylučuje možnost, že chemická látka může indukovat chromozomální aberace v pozdějších fázích vývoje, které nejsou studovány, nebo genové mutace.

42.

Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odezvy se nepožaduje.

43.

Jestliže odezva není jasně negativní nebo pozitivní, a s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku (např. slabý nebo okrajový nárůst), by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším vyšetřením s využitím stávajících experimentálních údajů, jako je skutečnost, zda je pozitivní výsledek mimo přijatelné rozpětí negativních kontrolních údajů nebo historických negativních kontrolních údajů laboratoře (19).

44.

Ve vzácných případech ani po dalším šetření nebude možné na základě daného souboru údajů dospět k závěru o pozitivitě či negativitě výsledku, a bude proto učiněn závěr, že výsledek je neurčitý.

45.

Nárůst počtu polyploidních buněk může znamenat, že zkoušená chemická látka má schopnost potlačit mitotické procesy a indukovat numerické chromozomové aberace (20). Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozomy může znamenat, že zkoušená chemická látka má schopnost potlačit progresi buněčného cyklu (21) (22), což je jiný mechanismus indukování numerických chromozomových změn než inhibice mitotických procesů (viz odstavec 2). Výskyt polyploidních buněk a buněk s endoreduplikovanými chromozomy by se proto měl zaznamenat odděleně.

ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

46.

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

 

Shrnutí.

 

Zkoušená chemická látka:

zdroj, číslo šarže, a je-li k dispozici, datum použitelnosti,

stabilita zkoušené chemické látky samotné, je-li známa,

rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle, jsou-li známy,

měření pH, případně osmolality a sraženiny v kultivačním médiu, do něhož byla přidána zkoušená chemická látka.

 

Jednosložková látka:

fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.

 

Vícesložková látka, látka s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkt nebo biologický materiál a směsi:

charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek.

 

Příprava zkoušené chemické látky:

zdůvodnění volby vehikula,

rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle/vehikulu,

příprava potravy, pitné vody nebo inhalačních aplikačních forem,

analytická stanovení aplikační formy (např. stabilita, homogenita, nominální koncentrace), pokud se provádí.

 

Pokusná zvířata:

použitý druh/kmen a odůvodnění jeho použití,

počet a věk zvířat,

původ, podmínky chovu, strava atd.,

metoda jednoznačného označení zvířat,

u krátkodobých studií: hmotnost jednotlivých zvířat na začátku a na konci zkoušky, u studií trvajících déle než jeden týden: hmotnosti jednotlivých zvířat během studie a spotřeba potravy. Mělo by být uvedeno rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnota a směrodatná odchylka pro každou skupinu.

 

Zkušební podmínky:

údaje o pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontrole,

údaje ze studie pro zjištění rozsahu dávek, pokud byla provedena,

zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

zdůvodnění způsobu podávání,

podrobnosti o přípravě zkoušené chemické látky,

podrobné údaje o podávání zkoušené chemické látky,

zdůvodnění dob usmrcení,

metody zjišťování toxicity, včetně případně histopatologických nebo hematologických analýz a četnosti, s jakou jsou prováděna pozorování zvířat, a četnosti vážení,

metody ověřování, zda se zkoušená chemická látka dostala k cílové tkáni, nebo ověřování obecné cirkulace, pokud byly získány negativní výsledky,

skutečná dávka (v mg na kg tělesné hmotnosti za den) vypočtená z koncentrace zkoušené chemické látky v potravě / pitné vodě (v ppm) a případně ze spotřeby,

podrobnosti o jakosti krmení a vody,

podrobný popis harmonogramů aplikace a odběru vzorků a odůvodnění výběru konkrétního schématu,

způsob utracení,

způsob analgezie (pokud se používá),

postupy izolace tkání,

identifikace chemické látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka aplikace,

metody přípravy preparátů,

kritéria hodnocení aberací,

počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,

kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou.

 

Výsledky:

stav zvířat před zkouškou a během zkoušky, včetně známek toxicity,

tělesná hmotnost a hmotnost orgánů při utracení (pokud se používá více režimů expozice, tělesná hmotnost stanovená v průběhu režimu aplikace),

známky toxicity,

mitotický index,

poměr spermatogonií v mitóze vzhledem k první a druhé metafázi meiózy nebo jiný průkaz expozice cílové tkáni,

typ a počet aberací uvedený samostatně pro každé zvíře,

celkový počet aberací ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

počet buněk s aberacemi ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami.

podle možnosti závislost odezvy na dávce,

použité statistické analýzy a metody,

údaje o souběžné negativní kontrole,

historické údaje o negativních kontrolách s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami a 95 % interval spolehlivosti (je-li k dispozici), nebo publikované historické údaje o negativních kontrolách použité pro přijatelnost výsledků zkoušky,

údaje o souběžné pozitivní kontrole,

změny ploidie, byly-li pozorovány, včetně četností polyploidie a/nebo endoreduplikovaných buněk.

 

Diskuse o výsledcích

 

Závěr

LITERATURA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313–324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(14)

Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Dodatek

DEFINICE

Aneuploidie: jakákoli odchylka od normálního diploidního (nebo haploidního) počtu chromozomů o jeden nebo více chromozomů, avšak nikoli o celou sadu (nebo více sad) chromozomů (polyploidie).

Centromera: oblast (oblasti) chromozomu, k níž (k nimž) se během dělení buněk připojí dělicí vřeténko umožňující uspořádaný pohyb dceřiných chromozomů k pólům dceřiných buněk.

Chemická látka: látka nebo směs.

Rozmanitost chromozomů: rozmanitost tvarů (např. metacentrické, akrocentrické atd.) a velikostí chromozomů.

Chromatidová aberace: strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu jedné chromatidy nebo zlomu a opětného spojení chromatid.

Chromozomová aberace: strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž místě.

Klastogen: jakákoli chemická látka, která způsobuje strukturní chromozomové aberace v populacích buněk nebo organismů.

Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním přerušením chromatid.

Genotoxický: obecný termín zahrnující všechny typy poškození DNA nebo chromozomů včetně jejich rozlámání, delecí, aduktů, modifikací a propojení nukleotidů, přestavby, mutací, chromozomových aberací a aneuploidie. Ne všechny druhy genotoxických účinků způsobují mutace nebo stálé poškození chromozomů.

Mitotický index (MI): poměr buněk v metafázi vydělený celkovým počtem buněk zjištěných v populaci buněk; udává stupeň proliferace této populace.

Mitóza: proces dělení buněčného jádra, který se obvykle člení na profázi, prometafázi, metafázi, anafázi a telofázi.

Mutagenní: produkující dědičné změny sekvence (sekvencí) párů bází DNA v genech nebo struktury chromozomů (chromozomové aberace).

Numerická abnormalita: odchylka počtu chromozomů od normálního počtu obvyklého u použitých zvířat.

Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozomových sad (n) jiný než diploidní (tj. 3n, 4n atd.).

Strukturní aberace: mikroskopicky pozorovatelné změny struktury chromozomů při buněčném dělení ve stadiu metafáze; jeví se jako delece a fragmenty, výměny.

Zkoušená chemická látka: jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

UVCB: chemické látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologický materiál.

(5)

V části B se kapitola B.40 nahrazuje tímto:

„B.40   LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI IN VITRO: ZKUŠEBNÍ METODA TRANSKUTÁNNÍHO ELEKTRICKÉHO ODPORU (TER)

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 430 (2015). Leptavými účinky na kůži se označuje vyvolání nevratného poškození kůže, které se projevuje jako viditelná, do koria zasahující nekróza pokožky, po aplikaci zkoušené chemické látky [jak ji definuje globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů (GHS OSN) (1) a nařízení Evropské unie (EU) č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí (dále jen „nařízení CLP“) (1)]. Tato aktualizovaná zkušební metoda B.40 stanoví postup in vitro, který umožňuje určení nežíravých a žíravých látek a směsí podle systému GHS OSN a nařízení CLP.

2.

Posuzování leptavých účinků na kůži obvykle zahrnovalo používání laboratorních zvířat (zkušební metoda B.4 ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 404 původně vydanému v roce 1981 a revidovanému v letech 1992, 2002 a 2015) (2). Kromě stávající zkušební metody B.40 byly validovány další zkušební metody in vitro pro zkoušení potenciálních leptavých účinků chemických látek na kůži, které byly přijaty jako zkušební metoda B.40a (ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 431) (3) a zkušební metoda B.65 (ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 435) (4), jež rovněž dokážou v případě potřeby určit podkategorie žíravých chemických látek. Několik validovaných zkušebních metod in vitro bylo přijato jako zkušební metoda B.46 (ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 439) (5) pro použití ke zkoušení dráždivosti pro kůži. Pokyny OECD k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování (IATA) dráždivých/leptavých účinků na kůži popisují několik modulů obsahujících různé informační zdroje a analytické nástroje a poskytují návod (i) na integraci a používání stávajících údajů ze zkoušek i jiných údajů pro posouzení potenciálu dráždivých a leptavých účinků chemických látek na kůži a (ii) a navrhují přístup, když je nutné další zkoušení (6).

3.

Tato zkušební metoda se týká sledovaných vlastností leptavých účinků na kůži z hlediska lidského zdraví. Vychází ze zkušební metody transkutánního elektrického odporu kůže potkana (TER), která využívá terčíky kůže k určení žíravých látek podle jejich schopnosti zapříčinit ztrátu normální integrity a bariérové funkce rohovité vrstvy (stratum corneum). Odpovídající pokyn OECD pro zkoušení byl původně přijat v roce 2004 a v roce 2015 byl aktualizován o odkazy na pokyny IATA.

4.

Aby mohly být vyhodnoceny zkoušky leptavých účinků na kůži in vitro pro účely regulace, byly provedeny předběžné validační studie (7) a poté formální validační studie zkušební metody TER s využitím kůže potkana pro posouzení leptavých účinků na kůži (8) (9) (10) (11). Výsledek těchto studií vedl k doporučení, že by zkušební metoda TER (určená jako validovaná referenční metoda – VRM) mohla být používána pro účely regulace pro posouzení leptavých účinků na kůži in vivo (12) (13) (14).

5.

Nežli lze pro regulační účely použít pro leptavé účinky na kůži navrhovanou podobnou nebo modifikovanou zkušební metodu TER in vitro jinou než VRM, je zapotřebí stanovit její spolehlivost, relevantnost (přesnost) a omezení týkající se jejího navrhovaného použití, aby se zajistila její podobnost s VRM v souladu s požadavky standardů funkčnosti (15). Vzájemné uznávání údajů bude v rámci OECD zaručeno až poté, co bude každá navrhovaná nebo aktualizovaná zkušební metoda podle standardů funkčnosti podrobena revizi a zahrnuta do odpovídajícího pokynu OECD ke zkoušení.

DEFINICE

6.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

7.

Validační studie (10) a další zveřejněné studie (16) (17) ukazují, že zkušební metoda TER dokáže rozlišit známé látky s leptavými účinky na kůži od látek, které na kůži nemají leptavé účinky, při celkové citlivosti 94 % (51/54) a specifičnosti 71 % (48/68) u databáze 122 látek.

8.

Tato zkušební metoda řeší leptavé účinky na kůži in vitro. Umožňuje určení nežíravých a žíravých zkoušených chemických látek podle systému GHS OSN a nařízení CLP. Jak prokazují validační studie (8) (9) (10) (11), omezením této zkušební metody je to, že neumožňuje klasifikaci žíravých látek a směsí do podkategorií podle systému GHS OSN / CLP. Platný právní rámec určí, jak bude tato zkušební metoda používána. I když tato zkušební metoda neposkytuje odpovídající informace o dráždivosti pro kůži, je třeba poznamenat, že zkušební metoda B.46 řeší konkrétně zdravotní účinky dráždivosti pro kůži in vitro (5). Pro úplné vyhodnocení lokálních účinků na kůži po jednotlivých kožních expozicích je třeba postupovat podle pokynů OECD k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování dráždivých/leptavých účinků na kůži (6).

9.

Při validaci této zkušební metody byla testována široká škála chemikálií (především chemických látek) a empirická databáze validační studie obsahovala celkem 60 látek z nejrůznějších chemických tříd (8) (9). Podle všech dostupných údajů je tato zkušební metoda použitelná pro širokou škálu chemických tříd a skupenství, včetně kapalin, polotuhých látek, pevných látek a vosků. Protože však pro některá skupenství nejsou okamžitě k dispozici zkušební položky s vhodnými referenčními údaji, je třeba poznamenat, že při validaci byl posuzován srovnatelně malý počet vosků a žíravých pevných látek. Kapaliny mohou být vodné či nevodné; pevné látky mohou být ve vodě rozpustné či nerozpustné. V případech, kdy mohou být předloženy důkazy prokazující nepoužitelnost této zkušební metody ke zkoušení specifické kategorie látek, neměla by se tato zkušební metoda na tuto specifickou kategorii látek používat. Dále se předpokládá, že tato zkušební metoda je použitelná i pro směsi jako rozšíření její použitelnosti pro látky. Avšak vzhledem ke skutečnosti, že směsi zahrnují širokou škálu kategorií a složení a že v současné době jsou k dispozici pouze omezené údaje o zkoušení směsí, v případech, kdy lze prokázat nepoužitelnost této zkušební metody pro konkrétní kategorii směsí (např. podle strategie navržené v Eskes et al., 2012) (18), by se tato zkušební metoda neměla pro tuto konkrétní kategorii směsí používat. Před použitím této zkušební metody ke zkoušení směsi s cílem získat údaje pro zamýšlené regulační účely by mělo být zváženo, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč tomu tak je. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi. Plyny a aerosoly dosud nebyly ve validačních studiích hodnoceny (8) (9). Ačkoli není jejich zkoušení pomocí zkušební metody TER teoreticky vyloučeno, současná zkušební metoda zkoušení plynů a aerosolů neumožňuje.

PRINCIP ZKOUŠKY

10.

Zkoušená chemická látka je aplikována až 24 hodin na epidermální stranu terčíků kůže ve dvoukomorovém zkušebním systému, ve kterém terčíky kůže oddělují obě komory. Terčíky kůže jsou odebrány z humánně usmrcených potkanů starých 28–30 dní. Chemické látky s leptavými účinky jsou identifikovány schopností způsobit ztrátu normální integrity a bariérové funkce rohovité vrstvy (stratum corneum), která je měřena jako snížení vlastního TER pod určitou prahovou úroveň (16) (viz odstavec 32). Jako hraniční hodnota TER pro pokožku potkanů byla vybrána hodnota 5 k? a to na základě rozsáhlých údajů pro široké spektrum látek, pro něž hodnota TER v převážné většině případů byla buď značně nad (často > 10 k?), nebo značně pod (často < 3 k?) touto hraniční hodnotou (16). Všeobecně platí, že zkoušené chemické látky, které nejsou žíravé pro zvířata, ale jsou dráždivé nebo nedráždivé, nesnižují TER pod tuto hraniční hodnotu. Použití jiných kožních přípravků nebo jiného přístroje může změnit volbu hraniční hodnoty a vyžadovat její další validaci.

11.

Do zkušebního postupu je pro potvrzující zkoušku pozitivních výsledků včetně hodnot TER okolo 5 k? zařazen stupeň pro stanovení vázání barviva. Tento stupeň pro stanovení vázání barviva určuje, zda zvýšení permeability iontů je důsledkem fyzikálního porušení rohovité vrstvy (stratum corneum). Ukázalo se, že metoda TER s využitím kůže potkana umožňuje předvídat výsledky zjišťování leptavých účinků in vivo s králíky podle zkušební metody B.4 (2).

PROKÁZÁNÍ ZPŮSOBILOSTI

12.

Dříve než začnou laboratoře rutinně používat zkušební metodu TER s využitím kůže potkana, která dodržuje tuto zkušební metodu, měly by prokázat svou odbornou způsobilost správným určením klasifikace dvanácti vhodných látek doporučených v tabulce 1. V situacích, kdy některá z uvedených látek není k dispozici, lze v odůvodněných případech použít jinou látku, u níž jsou k dispozici odpovídající referenční údaje o použití in vivo a in vitro (např. ze seznamu referenčních chemických látek (16)), pokud budou použita stejná kritéria výběru jako kritéria popsaná v tabulce 1.

Tabulka 1

Seznam vhodných látek  (2)

Látka

č. CAS

Třída chemických látek (3)

Kategorie GHS OSN/CLP na základě výsledků in vivo  (4)

Kategorie VRM na základě výsledků in vitro

Skupenství

pH (5)

Látky žíravé in vivo

N,N’-dimethyl dipropylentriamin

10563-29-8

organická zásada

1A

6 × C

K

8,3

propan-1,2-diamin

78-90-0

organická zásada

1A

6 × C

K

8,3

kyselina sírová (10 %)

7664-93-9

anorganická kyselina

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

K

1,2

hydroxid draselný (10 % aq)

1310-58-3

anorganická zásada

(1A/)1B/1C

6 × C

K

13,2

kyselina oktanová (kaprylová)

124-07-2

organická kyselina

1B/1C

4 × C 2 × NC

K

3,6

2-terc-butylfenol

88-18-6

fenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

K

3,9

Látky nežíravé in vivo

kyselina isostearová

2724-58-5

organická kyselina

NC

6 × NC

K

3,6

4-amino-1H-1,2,4-triazol

584-13-4

organická zásada

NC

6 × NC

P

5,5

fenethylbromid

103-63-9

elektrofilní

NC

6 × NC

K

3,6

4-(methylthio)benzaldehyd

3446-89-7

elektrofilní

NC

6 × NC

K

6,8

1,9-dekadien

1647-16-1

neutrální organická látka

NC

6 × NC

K

3,9

tetrachlorethen

127-18-4

neutrální organická látka

NC

6 × NC

K

4,5

Zkratky: aq = vodný; č. CAS = Chemical Abstracts Service Registry Number (registrační číslo CAS); VRM = validovaná referenční metoda; C = žíravý; NC = nežíravý.

POSTUP

13.

K dispozici jsou standardní prováděcí postupy pro zkušební metodu TER s využitím kůže potkana pro zjišťování leptavých účinků na kůži (19). Zkušební metody TER s využitím kůže potkana zahrnuté v této zkušební metodě musí splňovat následující podmínky:

Zvířata

14.

Měli by být použiti potkani, protože citlivost jejich kůže k látkám v této zkušební metodě již byla prokázána (12) a jsou jediným zdrojem kůže, který je formálně validován (8) (9). Stáří (v době odběru kůže) a kmen potkanů jsou zvláště důležité pro zajištění toho, aby folikuly chlupů byly v latentní fázi, před začátkem růstu zralé srsti.

15.

Hřbetní a boční srst mladých, přibližně 22denních samců nebo samic potkanů (z kmene příbuzného Wistaru nebo srovnatelného kmene) se opatrně odstraní holicím strojkem. Zvířata se poté umyjí opatrným otíráním, přičemž se oholená oblast ponoří do roztoku antibiotik (obsahujícího např. streptomycin, penicilin, chloramfenikol a amfotericin o koncentracích zastavujících růst bakterií). Zvířata se třetí nebo čtvrtý den po prvním omytí znovu omyjí roztokem antibiotik a použijí se do 3 dnů po druhém omytí, kdy jejich stratum corneum po odstranění srsti zregeneruje.

Příprava terčíků kůže

16.

Zvířata se humánně usmrtí ve stáří 28–30 dní; toto stáří je zásadně důležité. Z každého zvířete se poté odstraní hřbetní a boční kůže a nadbytečný tuk se z kůže opatrně seškrábne. Odeberou se terčíky kůže o průměru přibližně 20 mm. Kůže může být před použitím terčíků uchovávána, je-li prokázáno, že pozitivní a negativní kontrolní údaje jsou ekvivalentní údajům získaným s kůží čerstvou.

17.

Každý terčík kůže se přeloží přes jeden z konců teflonové (PTFE) trubičky tak, aby epidermis byla v kontaktu s trubičkou. Přes konec trubičky se těsně přetáhne pryžový O-kroužek, aby byla kůže upevněna, a přebytek tkáně se ořízne. Pryžový O-kroužek na teflonové trubičce se poté pečlivě utěsní ke konci teflonové trubičky vrstvou vazelíny. Trubička držená pomocí pružinové svorky se umístí do receptorové komory obsahující roztok síranu hořečnatého MgSO4 (154 mM) (obrázek 1). Terčík kůže musí být úplně ponořen do roztoku MgSO4. Z jedné kůže potkana může být získáno 10 až 15 terčíků kůže. Rozměry trubičky a O-kroužku jsou uvedeny na obrázku 2.

18.

Pro každou zvířecí kůži je před započetím zkoušky změřena hodnota TER dvou terčíků kůže jako postup kontroly jakosti. Pro oba terčíky by měla být naměřena hodnota elektrického odporu větší než 10 k?, mají-li být pro tuto zkušební metodu použity ostatní terčíky. Pokud je hodnota odporu nižší než 10 k?, musí být ostatní terčíky z dotyčné kůže ze zkoušek vyřazeny.

Aplikace zkoušené chemické látky a kontrolních látek

19.

Pro každou zkoušku (experiment) by měly být provedeny souběžné pozitivní a negativní kontroly k zajištění dostatečné účinnosti daného experimentálního modelu. V každé zkoušce (experimentu) by měly být použity terčíky kůže z téhož zvířete. Navrženými zkoušenými chemickými látkami pro pozitivní kontrolu je 10M kyselina chlorovodíková a pro negativní kontrolu destilovaná voda.

20.

Kapalné zkoušené chemické látky (150 ?l) se aplikují stejnoměrně na epidermis uvnitř trubičky. Při zkoušení pevných materiálů se použije dostatečné množství tak, aby byla rovnoměrně pokryta celá epidermis. Poté se na povrch pevné látky přidá deionizovaná voda (150 ?l) a trubička se lehce protřepe. K zajištění maximálního styku látky s kůží může být nutné zahřát pevnou látku až na 30 oC, aby se zkoušená chemická látka roztavila či změkla, nebo ji rozemlít na zrnitý materiál či prášek.

21.

Pro každou zkoušenou a kontrolní chemickou látku se použijí tři terčíky kůže pro každou zkoušku (experiment). Zkoušené chemické látky se aplikují po dobu 24 hodin při 20–23 oC. Zkoušená chemická látka se zcela odstraní proudem tekoucí vody o nejvýše pokojové teplotě.

Měření TER

22.

Impedance kůže se měří jako TER nízkonapěťovým impedančním Wheatstoneovým můstkem pro střídavý proud (18). Všeobecné specifikace můstku: provozní napětí 1 až 3 V, sinusový nebo pravoúhlý tvar kmitů střídavého proudu frekvence 50–1 000 Hz a rozsah měření nejméně 0,1–30 k?. Můstek použitý ve validační studii měří induktanci, kapacitanci a odpor až do hodnot 2 000 H, 2 000 ?F, a 2 M? při frekvencích 100 Hz nebo 1 kHz za použití sériových nebo paralelních hodnot. Pro účely měření TER v rámci zkoušky leptavých účinků se zaznamenávají hodnoty odporu při frekvenci 100 Hz a za použití sériových hodnot. Před měřením elektrického odporu se povrchové napětí kůže sníží přidáním dostatečného objemu 70 % ethanolu tak, aby byla epidermis zakryta. Po několika sekundách se ethanol z trubice vylije a tkáň se zvlhčí přidáním 3 ml roztoku MgSO4 (154 mM). Elektrody můstku se umístí na obě strany terčíku kůže za účelem odečtu odporu v k?/terčík kůže (obrázek 1). Rozměry elektrod a délky exponovaných částí elektrod pod krokosvorkou jsou uvedeny na obrázku 2. Svorka vnitřní elektrody je během měření odporu opřena o horní konec teflonové trubičky, aby bylo zajištěno, že se délka části elektrody ponořené v roztoku MgSO4 nemění. Vnější elektroda je umístěna uvnitř receptorové komory tak, aby spočívala na dně komory. Vzdálenost mezi pružinovou svorkou a dnem teflonové trubičky se udržuje konstantní (obrázek 2), neboť tato vzdálenost má vliv na naměřené hodnoty odporu. Proto by vzdálenost mezi vnitřní elektrodou a terčíkem kůže měla být konstantní a minimální (1–2 mm).

23.

Je-li naměřená hodnota vyšší než 20 k?, může to být způsobeno zbytky vrstvy zkoušené látky na epidermální straně terčíku kůže. O odstranění této vrstvy se lze pokusit např. tím, že se teflonová trubička zakryje palcem v rukavici a přibližně 10 sekund se protřepává; roztok MgSO4 se odstraní a měření se opakuje s čerstvým MgSO4.

24.

Vlastnosti a rozměry zkušebního přístroje a použitý experimentální postup mohou ovlivnit naměřené hodnoty TER. Prahová hodnota 5 k? pro leptavé účinky byla odvozena na základě údajů zjištěných se specifickým přístrojem a postupem popsanými v této zkušební metodě. Pokud se změní podmínky zkoušky nebo je použit jiný přístroj, mohou platit jiné prahové a kontrolní hodnoty. Proto je nutné kalibrovat metodu a prahové hodnoty odporu zkoušením řady vhodných látek vybraných z látek použitých ve validační studii (8) (9) nebo z tříd chemických látek podobných zkoušeným látkám. Soubor vhodných látek je uveden v tabulce 1.

Metody stanovení vázání barviva

25.

Expozice kůže některým nežíravým materiálům může snížit odpor pod hraniční hodnotu 5 k?, v důsledku čehož je umožněn průnik iontů přes stratum corneum a snižuje se elektrický odpor (9). Např. neutrální organické látky a povrchově aktivní látky (včetně detergentů, emulgátorů a jiných povrchově aktivních látek) mohou vést k odstranění kožních lipidů, čímž se bariéra stane pro ionty průchodnější. Proto pokud jsou při absenci viditelného poškození terčíků kůže hodnoty TER vyvolané těmito chemickými látkami okolo 5 k?, nebo jsou nižší než 5 k?, mělo by být na kontrolních a upravených tkáních provedeno posouzení průniku barviva ke zjištění, zda jsou naměřené hodnoty TER výsledkem zvýšené permeability kůže, nebo poleptání kůže (7) (9). V případě poleptání kůže, kdy stratum corneum je porušeno, barvivo sulforhodamin B při aplikaci na kůži rychle proniká a zbarvuje podložní tkáň. Toto konkrétní barvivo je stabilní v prostředí širokého rozsahu látek a nemá na něj vliv níže popsaný extrakční postup.

Aplikace a odstranění barviva sulforhodaminu B

26.

Po měření TER se roztok síranu hořečnatého vylije z trubičky a kůže se pečlivě přezkoumá, zda není zjevně poškozena. Pokud není patrné žádné zjevné větší poškození (např. perforace), aplikuje se na epidermální stranu každého terčíku kůže po dobu 2 hodin 150 ?l 10 % roztoku (m/V) barviva sulforhodaminu B (Acid Red 52; C.I. 45100; č. CAS 3520-42-1) v destilované vodě. Terčíky kůže se poté přibližně 10 sekund omývají tekoucí vodou o nejvýše pokojové teplotě, aby se odstranilo veškeré volné barvivo. Všechny terčíky kůže se opatrně sejmou z teflonové trubičky a umístí se do lahvičky (např. 20 ml skleněné lahvičky pro scintilační spektrometrii) obsahující deionizovanou vodu (8 ml). Lahvičky se lehce 5 minut protřepávají, aby se odstranilo další volné barvivo. Tato metoda oplachování se poté zopakuje a pak se terčíky kůže vyjmou a vloží do lahviček obsahujících 5 ml 30 % roztoku (m/V) natrium-dodecyl-sulfátu (SDS) v destilované vodě a inkubují se přes noc při 60 oC.

27.

Po inkubaci se všechny terčíky kůže vyjmou a zlikvidují a zbylý roztok se odstředí 8 minut při 21 oC (při relativní odstředivé síle ~175 × g). 1 ml vzorku supernatantu se poté zředí 4 ml 30 % (m/V) roztoku SDS v destilované vodě. Absorbance (A) roztoku se měří přibližně při 565 nm.

Výpočet obsahu barviva

28.

Obsah barviva sulforhodaminu B na terčík kůže se vypočte z hodnot absorbance A (9) (molární absorpční koeficient sulforhodaminu B při 565 nm = 8,7 × l04; molekulová hmotnost = 580). Obsah barviva sulforhodaminu B se vypočte pro každý terčík kůže využitím vhodné kalibrační křivky a poté se vypočte jeho střední hodnota.

Kritéria přijatelnosti

29.

Střední hodnoty výsledků TER jsou přijatelné, pokud hodnoty pro paralelní pozitivní a negativní kontroly spadají do přijatelného rozmezí dané metody v dotyčné zkušební laboratoři. Pro popsanou metodiku a přístroje jsou přijatelné hodnoty rozmezí odporu uvedeny v následující tabulce:

Kontrola

Látka

Rozmezí odporu (k?)

Pozitivní

10M kyselina chlorovodíková

0,5–1,0

Negativní

destilovaná voda

10–25

30.

Střední hodnoty výsledků vázání barviva jsou přijatelné, pokud hodnoty pro paralelní kontroly spadají do přijatelného rozmezí metody. Doporučené přijatelné hodnoty rozmezí obsahu barviva pro kontrolní látky pro popsanou metodiku a přístroje jsou uvedeny v následující tabulce:

Kontrola

Látka

Rozmezí obsahu barviva (?g/terčík kůže)

Pozitivní

10M kyselina chlorovodíková

40–100

Negativní

destilovaná voda

15–35

Interpretace výsledků

31.

Hraniční hodnota TER odlišující žíravé zkoušené chemické látky od nežíravých byla stanovena během optimalizace zkušební metody, testována během předvalidační fáze a potvrzena ve formální validační studii.

32.

Predikční model pro zkušební metodu TER s využitím kůže potkana (9) (19), související se systémem klasifikace GHS OSN/CLP, je uveden níže:

Zkoušená chemická látka je pokládána za látku, která nemá na kůži leptavé účinky (nežíravá látka):

i)

je-li střední hodnota TER změřená pro tuto zkoušenou chemickou látku větší než 5 k?; nebo

ii)

je-li střední hodnota TER naměřená u zkoušené chemické látky menší nebo rovna (?) 5 k? a

terčíky kůže nevykazují žádné zjevné poškození (např. perforaci), a

střední obsah barviva v terčíku kůže je nižší než (<) střední obsah barviva v terčíku kůže získaný souběžně při použití 10M HCl jako pozitivní kontroly (viz odstavec 30, kde jsou uvedeny hodnoty pozitivní kontroly).

Zkoušená chemická látka je pokládána za látku, která má na kůži leptavé účinky (žíravá látka):

i)

je-li střední hodnota TER naměřená u zkoušené chemické látky menší nebo rovna (?) 5 k? a terčíky kůže jsou zjevně poškozeny (např. perforovány); nebo

ii)

je-li střední hodnota TER naměřená u zkoušené chemické látky menší nebo rovna (?) 5 k? a

terčíky kůže nejsou zjevně poškozeny (např. perforovány), ale

střední obsah barviva v terčíku kůže je větší nebo roven (?) střednímu obsahu barviva v terčíku kůže získanému souběžně při použití 10M HCl jako pozitivní kontroly (viz odstavec 30, kde jsou uvedeny hodnoty pozitivní kontroly).

33.

U zkoušené látky s jednoznačnou klasifikací by mělo stačit jedno provedení zkoušky (experiment) za použití alespoň tří replikátů terčíků kůže. Avšak v případě hraničních výsledků, jako jsou například nesouhlasné výsledky opakovaných měření a/nebo střední hodnota TER rovnající se 5 ± 0,5 k?, by se mělo zvážit provedení druhé nezávislé zkoušky (experimentu), jakož i třetí zkoušky v případě nesouhlasných výsledků mezi prvními dvěma provedenými zkouškami (experimenty).

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Údaje

34.

Hodnoty odporu (k?) a případně hodnoty obsahu barviva (?g/terčík) pro zkoušenou chemickou látku a také pro pozitivní a negativní kontroly by měly být uvedeny ve formě tabulky, včetně údajů za jednotlivé replikované terčíky z jednotlivých zkoušek (experimentů) a jejich střední hodnoty spolu s jejich ± směrodatnou odchylkou. Uvádějí se všechny opakované experimenty. Pozorované poškození terčíků kůže je nutno uvádět za každou zkoušenou chemickou látku.

ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

35.

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

 

Zkoušené chemické látky a kontrolní látky

jednosložková látka: chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.,

vícesložková látka, UVCB a směs: charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek,

fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

zdroj, číslo šarže, jsou-li k dispozici,

případně ošetření zkoušených látek chemických/kontrolních látek před zkoušením (např. zahřátí, mletí),

stabilita zkoušené chemické látky, datum použitelnosti nebo datum opětovné analýzy, je-li známo,

podmínky skladování.

 

Pokusná zvířata:

použitý kmen a pohlaví,

stáří zvířat použitých jako dárcovská zvířata,

zdroj, podmínky chovu, potrava atd.,

podrobnosti přípravy kůže.

 

Zkušební podmínky:

kalibrační křivky zkušebního přístroje,

kalibrační křivky pro zkoušku účinnosti vázání barviva, pásmová propustnost použitá pro měření hodnot optické hustoty, případně rozsah linearity přístroje měřícího optické hustoty (např. spektrofotometru),

podrobnosti zkušebního postupu pro měření TER,

případně podrobnosti zkušebního postupu pro stanovení vázání barviva,

použité zkušební dávky, doba (doby) expozice a teplota (teploty) expozice,

informace o použitém postupu vymývání po expozici,

počet replik terčíků kůže použitých na jednu zkoušenou chemickou látku a kontroly (pozitivní a negativní kontrola),

popis jakýchkoli úprav zkušebního postupu,

odkaz na historické údaje modelu. Ty by měly zejména zahrnovat:

i)

přijatelnost hodnot TER pozitivních a negativních kontrol (v k?) s odkazem na rozsahy odporu pozitivních a negativních kontrol;

ii)

přijatelnost hodnot obsahu barviva u pozitivních a negativních kontrol (v ?g/terčík) s odkazem na rozpětí obsahu barviva u pozitivních a negativních kontrol;

iii)

přijatelnost výsledků zkoušek s odkazem na historickou variabilitu mezi replikami terčíků kůže,

popis použitých kritérií rozhodování / predikčního modelu.

 

Výsledky:

údaje změřených hodnot TER a případně obsahu vázaného barviva pro jednotlivé zkoušené chemické látky a kontroly, pro každé provedení zkoušky (experiment) a každou repliku terčíků kůže (jednotlivá zvířata a jednotlivé vzorky kůže), střední hodnoty, směrodatné odchylky a variační koeficienty zpracované ve formě tabulky,

popis jakýchkoli pozorovaných účinků,

odvozená klasifikace s odkazem na použitý predikční model / kritéria rozhodování.

 

Diskuse o výsledcích

 

Závěry

LITERATURA

(1)

United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Dostupné na webových stránkách: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Kapitola B.4 této přílohy, Akutní dráždivé/leptavé účinky na kůži.

(3)

Kapitola B.40a této přílohy, Kožní model in vitro.

(4)

Kapitola B.65 této přílohy, Zkušební metoda s využitím membránové bariéry in vitro.

(5)

Kapitola B.46 této přílohy, Dráždivost pro kůži in vitro: Zkušební metoda za použití rekonstruované lidské epidermis.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. Publikace NIH č. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. Publikace NIH č. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol.24, 507-512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris.

Obrázek 1

Přístroj Pro Zkoušku Ter Na Kůži Potkana

Image 2

Obrázek 2

Rozměry Teflonové a Receptorové Trubičky a Použitých Elektrod

Image 3

Kritické faktory přístroje uvedeného výše:

vnitřní průměr teflonové trubičky,

taková délka elektrod vzhledem k teflonové trubičce a receptorové trubičce, aby se elektrody nedotýkaly terčíku kůže a aby standardní délka elektrody byla ve styku s roztokem MgSO4,

objem roztoku MgSO4 v receptorové trubičce musí vzhledem k hladině v teflonové trubičce dávat takovou výšku kapaliny, jak je znázorněno na obrázku 1,

terčík kůže musí být k teflonové trubičce připevněn tak, aby elektrický odpor představoval skutečnou míru vlastností kůže.

Dodatek

DEFINICE

Přesnost : přesnost shody mezi výsledky zkušební metody a přijatými referenčními hodnotami. Je to míra funkčnosti zkušební metody a jeden z aspektů její relevantnosti. Tento pojem se často používá místo pojmu „soulad“ a rozumí se jím podíl správných výsledků zkušební metody (20).

C(„corrosive:“): žíravá látka.

Chemická látka : látka nebo směs.

Soulad : je měřítkem funkčnosti u zkušebních metod poskytujících kategorické výsledky a je jedním z aspektů její relevantnosti. Tento pojem se někdy používá místo pojmu „přesnost“ a je definován jako podíl všech zkoušených chemických látek, které jsou správně klasifikovány jako pozitivní nebo negativní. Soulad závisí do velké míry na prevalenci pozitivních výsledků u druhů studovaných zkoušených chemických látek (20).

GHS (Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek (OSN)) : systém navrhující klasifikaci chemických látek a směsí podle standardizovaných typů a úrovní fyzikální, zdravotní a environmentální nebezpečnosti a zabývající se příslušnými komunikačními prvky, jako jsou piktogramy, signální slova, výroky o nebezpečí, výroky o bezpečnostních opatřeních a bezpečnostní datové listy, které obsahují informace o jejich nežádoucích účincích s ohledem na ochranu lidí (včetně zaměstnavatelů, pracovníků, přepravců, spotřebitelů a osob reagujících na nouzové situace) a životního prostředí (1).

IATA : integrovaný přístup ke zkoušení a posuzování.

Směs : směs nebo roztok složený ze dvou nebo více látek.

Jednosložková látka : látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna jedna hlavní složka v míře alespoň 80 % hmot.

Vícesložková látka : látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna více než jedna hlavní složka v koncentraci ? 10 % hmot. a < 80 % hmot. Vícesložková látka je výsledkem výrobního procesu. Rozdíl mezi směsí a vícesložkovou látkou spočívá v tom, že směs se získá smísením dvou nebo více látek bez chemické reakce. Vícesložková látka je výsledkem chemické reakce.

NC („non-corrosive“): nežíravá látka.

OD („optical density“): optická hustota (absorbance).

Pozitivní kontrola : replika obsahující všechny složky zkušebního systému a látku, o níž je známo, že způsobuje pozitivní reakci. Aby se zajistilo, že proměnlivost v reakci na pozitivní kontrolu bude možné časem vyhodnotit, rozsah pozitivní reakce by neměl být nadměrný.

Standardy funkčnosti : standardy založené na validované referenční metodě, které slouží jako základ pro hodnocení srovnatelnosti navrhované zkušební metody, která je mechanicky a funkčně podobná. Patří mezi ně: i) zásadní složky zkušební metody; ii) minimální seznam srovnávacích látek vybraných z chemických látek používaných k prokázání přijatelné funkčnosti validované referenční metody; a iii) srovnatelné hladiny spolehlivosti a přesnosti založené na hodnotách získaných u validované referenční metody, jež by navrhovaná zkušební metoda měla prokázat při vyhodnocení za použití minimálního seznamu srovnávacích látek.

Relevantnost : popis vztahu zkoušky k účinku, který je předmětem zájmu, a také toho, zda je zkouška smysluplná a použitelná pro konkrétní účel. Vyjadřuje, do jaké míry zkušební metoda správně měří nebo predikuje biologický účinek, který je předmětem zájmu. Relevantnost zahrnuje také posouzení přesnosti (shody) zkušební metody (20).

Spolehlivost : měření rozsahu, v jakém může být zkušební metoda časem reprodukovatelná v laboratořích a mezi laboratořemi, když se provádí s použitím stejného protokolu. Hodnotí se na základě výpočtu vnitrolaboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti (20).

Citlivost : podíl všech pozitivních/aktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně klasifikovány. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (20).

Leptavé účinky na kůži:in vivo : vyvolání nevratného poškození kůže; zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky do čtyř hodin po aplikaci zkoušené chemické látky. Reakce po poleptání se projevují vředy, krvácením, krvavými strupy a v závěru čtrnáctidenního pozorování ztrátou barvy v důsledku vyblednutí kůže, úplnými ložisky alopecie a jizvami. K vyhodnocení sporných lézí by se měla uvážit histopatologie.

Specifičnost : podíl všech negativních/neaktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně klasifikovány. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (20).

Látka : chemický prvek a jeho sloučeniny v přírodním stavu nebo získané výrobním postupem, včetně jakýchkoliv aditiv potřebných pro zachování stability výrobku a všech nečistot pocházejících z použitého postupu, ale s vyloučením všech rozpouštědel, která je možno oddělit bez ovlivnění stability dané látky nebo změny jejího složení.

(Provedení) zkoušky : jedna zkoušená chemická látka, která byla souběžně zkoušena na minimálně třech replikách terčíků kůže.

Zkoušená chemická látka : jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

Transkutánní elektrický odpor (TER) : je mírou elektrické impedance kůže, vyjádřenou hodnotou elektrického odporu v kiloohmech. Jednoduchá a robustní metoda posouzení bariérové funkce, která spočívá ve sledování průchodu iontů kůží užitím Wheatstoneova můstku.

UVCB : látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologický materiál.

(6)

V části B se kapitola B.40a nahrazuje tímto:

„B.40a   LEPTAVÉ ÚČINKY NA KŮŽI IN VITRO: ZKUŠEBNÍ METODA ZA POUŽITÍ REKONSTRUOVANÉ LIDSKÉ EPIDERMIS (RhE)

ÚVOD

1.

Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení (TG) č. 431 (2016). Leptavými účinky na kůži se označuje vyvolání nevratného poškození kůže, které se projevuje jako viditelná, do koria zasahující nekróza pokožky, po aplikaci zkoušené chemické látky [jak ji definuje globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů (GHS OSN) (1) a nařízení Evropské unie (EU) č. 1272/2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí (dále jen „nařízení CLP“) (6)]. Tato aktualizovaná zkušební metoda B.40a stanovuje postup in vitro, který umožňuje určení nežíravých a žíravých látek a směsí podle systému GHS OSN a nařízení CLP. Umožňuje také částečnou klasifikaci žíravých látek do podkategorií.

2.

Posuzování potenciálu leptavých účinků chemických látek na kůži bylo obvykle prováděno na pokusných zvířatech (zkušební metoda B.4 ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 404; původně vydané v roce 1981 a revidované v letech 1992, 2002 a 2015) (2). Kromě stávající zkušební metody B.40a byly validovány další zkušební metody in vitro pro zkoušení potenciálních leptavých účinků chemických látek na kůži, které byly přijaty jako zkušební metoda B.40 (ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 430) (3) a zkušební metoda B.65 (ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 435) (4). Dále byla přijata zkušební metoda B.46 in vitro (ekvivalentní Pokynu OECD pro zkoušení č. 439) (5) pro zkoušení potenciálu dráždivosti pro kůži. Pokyny OECD k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování (IATA) dráždivých/leptavých účinků na kůži popisují několik modulů obsahujících informační zdroje a analytické nástroje a poskytují návod (i) na integraci a používání stávajících údajů ze zkoušek i jiných údajů pro posouzení potenciálu dráždivých a leptavých účinků chemických látek na kůži a (ii) a navrhují přístup, když je nutné další zkoušení (6).

3.

Tato zkušební metoda se týká sledovaných vlastností leptavých účinků na kůži z hlediska lidského zdraví. Využívá rekonstruované lidské epidermis (RhE) (získané z netransformovaných keratinocytů lidské epidermis), která věrně napodobuje histologické, morfologické, biochemické a fyziologické vlastnosti svrchních částí lidské kůže, tj. epidermis. Odpovídající pokyn OECD pro zkoušení byl původně přijat v roce 2004 a v roce 2013 byl aktualizován o další zkušební metody používající model s rekonstruovanou lidskou epidermis a možnost používat metody na podporu klasifikace žíravých chemických látek do podkategorií, dále byl aktualizován v roce 2015 o odkazy na pokyny IATA a bylo zavedeno použití alternativního postupu k měření životaschopnosti.

4.

Tato zkušební metoda zahrnuje čtyři validované komerčně dostupné modely RhE. Pro dva z těchto komerčně dostupných zkušebních modelů, EpiSkin™ Standard Model (SM) a EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200), byly provedeny (11) (12) předvalidační studie (7) (v dalším textu jen validované referenční metody - VRM) s následnou formální validační studií pro posouzení leptavých účinků na kůži (8)(9)(10). Závěr z těchto studií vedl k doporučení, že pro rozlišení žíravých (C) a nežíravých látek (NC) pro regulační účely by mohly být použity tyto dvě validované referenční metody a že model EpiSkin™ by navíc mohl být používán na podporu třídění žíravých látek do podkategorií (13)(14)(15). Dva další komerčně dostupné modely in vitro pro zkoušení leptavých účinků na kůži za použití rekonstruované lidské epidermis vykazují podle validace na základě standardů funkčnosti podobné výsledky jako EpiDerm™ VRM (16) (17) (18). Jedná se o metody SkinEthic™ RHE (7) a epiCS® (dřívější název EST1000), které mohou být také použity pro regulační účely pro rozlišení žíravých a nežíravých látek (19) (20). Validační studie provedené výrobci modelu RhE v letech 2012 až 2014 s vylepšeným protokolem korigujícím interference nespecifické redukce MTT zkoušenými chemickými látkami zlepšily funkční způsobilost pro rozlišení C/NC i podpůrnou klasifikaci žíravých látek do podkategorií (21) (22). Byly provedeny další statistické analýzy povalidačních údajů generovaných modely EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE a EpiCS® s cílem nalézt alternativní predikční modely, které by zlepšily prediktivní schopnost klasifikace do podkategorií (23).

5.

Nežli lze pro regulační účely použít pro leptavé účinky na kůži navrhovanou podobnou nebo modifikovanou zkušební metodu RhE in vitro jinou než VRM, je zapotřebí stanovit její spolehlivost, relevantnost (přesnost) a omezení týkající se jejího navrhovaného použití, aby se zajistila její podobnost s VRM v souladu s požadavky standardů funkčnosti (24) stanovenými v souladu se zásadami uvedenými v pokynu OECD č. 34 (25). Vzájemné uznávání údajů bude zaručeno až poté, co bude každá navrhovaná nebo aktualizovaná zkušební metoda podle standardů funkčnosti podrobena revizi a zahrnuta do odpovídajícího pokynu ke zkoušení. Zkušební modely zahrnuté do tohoto pokynu ke zkoušení mohou být použity pro účely požadavků jednotlivých zemí na výsledky zkoušek u zkušební metody pro leptavé účinky na kůži in vitro, přičemž může být využito vzájemné uznávání údajů.

DEFINICE

6.

Použité definice jsou uvedeny v dodatku 1.

VÝCHOZÍ ÚVAHY

7.

Tato zkušební metoda umožňuje určení nežíravých a žíravých látek a směsí podle systému GHS OSN a nařízení CLP. Dále tato zkušební metoda podporuje klasifikaci žíravých látek a směsí do podkategorií, a to na doplňkovou podkategorii 1A podle GHS OSN (1), jakož i kombinaci podkategorií 1B a 1C (21)(22)(23). Omezení této zkušební metody spočívá v tom, že neumožňuje rozlišení mezi leptavými účinky na kůži podkategorie 1B a podkategorie 1C podle systému GHS OSN a nařízení CLP vzhledem k omezenému množství dobře známých žíravých chemických látek in vivo podkategorie 1C. Zkušební modely EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE a epiCS® dokážou rozdělovat na podkategorie (tj. 1A proti 1B-a-1C proti NC).

8.

Při validaci zkušebních modelů, které jsou zahrnuty v této zkušební metodě a používají se pro určení nežíravých a žíravých látek, byla testována široká škála chemických látek představujících zejména jednotlivé látky; empirická databáze validační studie obsahovala 60 chemických látek z nejrůznějších chemických tříd (8) (9) (10). Vývojáři zkušební metody provedli zkoušení za účelem prokázání citlivosti, specifičnosti, přesnosti a vnitrolaboratorní reprodukovatelnosti analýzy pro klasifikaci do podkategorií a výsledky kontrolovala OECD (21) (22) (23). Podle všech dostupných údajů je tato zkušební metoda použitelná pro širokou škálu chemických tříd a skupenství, včetně kapalin, polotuhých látek, pevných látek a vosků. Kapaliny mohou být vodné či nevodné; pevné látky mohou být ve vodě rozpustné či nerozpustné. Pevné látky by měly být pokud možno před aplikací rozemlety na jemný prášek; žádná další úprava vzorku není vyžadována. V případech, kdy mohou být předloženy důkazy prokazující nepoužitelnost modelů zařazených do této zkušební metody pro specifickou kategorii zkoušených chemických látek, neměly by se pro tuto specifickou kategorii zkoušených chemických látek používat. Dále se předpokládá, že je tato zkušební metoda jako doplnění použitelnosti pro látky použitelná pro směsi. Avšak vzhledem ke skutečnosti, že směsi zahrnují širokou škálu kategorií a složení a že v současné době jsou k dispozici pouze omezené údaje o zkoušení směsí, v případech, kdy lze prokázat nepoužitelnost této zkušební metody pro konkrétní kategorii směsí (např. podle strategie navržené v (26)), by se tato zkušební metoda neměla používat pro tuto konkrétní kategorii směsí. Před použitím této zkušební metody ke zkoušení směsi s cílem získat údaje pro zamýšlené regulační účely by mělo být zváženo, zda tato metoda může pro tento účel poskytnout přiměřené výsledky, a pokud ano, proč tomu tak je. Takové úvahy nejsou nutné, pokud existuje právní požadavek na zkoušení dané směsi. Plyny a aerosoly dosud nebyly ve validačních studiích hodnoceny (8) (9) (10). Ačkoli není jejich zkoušení postupem za použití rekonstruované lidské epidermis teoreticky vyloučeno, současná zkušební metoda zkoušení plynů a aerosolů neumožňuje.

9.

Zkoušené chemické látky absorbující světlo ve stejném pásmu jako formazan MTT a zkoušené chemické látky schopné přímé redukce vitálního barviva MTT (na formazan MTT) mohou interferovat s měřením životaschopnosti tkání, proto je třeba pro korekce použít upravené kontroly. Druh upravených kontrol, které mohou být potřebné, se bude lišit v závislosti na druhu interference vyvolané zkoušenou chemickou látkou a na postupu použitém pro měření formazanu MTT (viz odstavce 25-31).

10.

I když tato zkušební metoda neposkytuje odpovídající informace o dráždivosti pro kůži, je třeba poznamenat, že zkušební metoda B.46 řeší konkrétně zdravotní účinky dráždivosti pro kůži in vitro a je založena na tomtéž zkušebním systému RhE, i když podle jiného protokolu (5). Pro úplné vyhodnocení lokálních účinků na kůži po jednotlivých kožních expozicích je třeba postupovat podle pokynů OECD k integrovanému přístupu ke zkouškám a posuzování dráždivých/leptavých účinků na kůži (6). Tento integrovaný přístup ke zkouškám a posuzování zahrnuje provádění zkoušek leptavých účinků na kůži (jak je uvedeno v této zkušební metodě) a dráždivých účinků na kůži in vitro před zvažováním zkoušek na živých zvířatech. Je známo, že použití lidské kůže je předmětem vnitrostátních a mezinárodních etických úvah a podmínek.

PRINCIP ZKOUŠKY

11.

Zkoušená látka se místně nanese na trojrozměrný model rekonstruované lidské epidermis tvořené netransformovanými keratinocyty získanými z lidské epidermis, které byly kultivovány tak, aby vytvořily vícevrstvý, vysoce diferenciovaný model lidské epidermis. Skládá se z uspořádaných bazálních, výběžkovitých a granulárních vrstev a vícevrstevného stratum corneum, jež obsahuje mezibuněčné lamelární lipidové vrstvy představující hlavní třídy lipidů analogické těm, které se nacházejí in vivo.

12.

Zkušební metoda RhE je založena na předpokladu, že chemické látky s leptavými účinky jsou ty, jež jsou schopny proniknout rohovitou vrstvou (stratum corneum) difuzí nebo erozí a jsou cytotoxické pro buňky v hlubších buněčných vrstvách. Životaschopnost buněk se měří enzymatickou přeměnou vitálního barviva MTT [3–(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-bromid, thiazolylová modř, tetrazolium-bromid; číslo CAS 298–93-1] na sůl modrého formazanu, jehož množství se změří po extrakci z tkání (27). Žíravé chemické látky se zjišťují na základě jejich schopnosti snižovat životaschopnost buněk pod definované prahové úrovně (viz odstavce 35 a 36). Ukázalo se, že zkušební metoda leptavých účinků na kůži na bázi RhE umožňuje předvídat leptavé účinky na kůži in vivo u králíků podle zkušební metody B.4 (2).

PROKÁZÁNÍ ZPŮSOBILOSTI

13.

Dříve než začnou laboratoře rutinně používat kterýkoli ze čtyř validovaných zkušebních modelů RhE, který dodržuje tuto zkušební metodu, měly by prokázat svou odbornou způsobilost správným určením klasifikace dvanácti vhodných látek uvedených v tabulce 1. V případě použití metody pro podrobnou klasifikaci je třeba prokázat také správné zařazení do podkategorií. V situacích, kdy některá z uvedených látek není k dispozici, lze v odůvodněných případech použít jinou látku, u níž jsou k dispozici odpovídající referenční údaje o použití in vivo a in vitro (např. ze seznamu referenčních chemických látek (24)), pokud budou použita stejná kritéria výběru jako kritéria popsaná v tabulce 1.

Tabulka 1

Seznam vhodných látek  (8)

Látka

č. CAS

Třída chemických látek (9)

Kat. GHS OSN/CLP na základě výsledků in vivo  (10)

Kategorie VRM na základě výsledků in vitro  (11)

MTT redukční činidlo (12)

Skupenství látky

Podkategorie 1A Žíravé látky in vivo

Bromoctová kyselina

79-08-3

organická kyselina

1A

(3) 1A

P

Dihydrát fluoridu boritého

13319-75-0

anorganická kyselina

1A

(3) 1A

K

Fenol

108-95-2 Org.

Fenol

1A

(3) 1A

P

Dichloroacetyl chlorid

79-36-7 Org.

elektrofil

1A

(3) 1A

K

Kombinace podkategorií 1B a 1C Žíravé látky in vivo

Monohydrát kyseliny glyoxylové

563-96-2

organická kyselina

1B a 1C

(3) 1B a 1C

P

Kyselina mléčná

598-82-3

organická kyselina

1B a 1C

(3) 1B a 1C

K

Ethanolamin

141-43-5

organická zásada

1B

(3) 1B a 1C

A

viskózní

Kyselina chlorovodíková (14,4 %)

7647-01-0

anorganická kyselina

1B a 1C

(3) 1B a 1C

K

Nežíravé látky in vivo

Fenethylbromid

103-63-9

elektrofil

NC

(3) NC

A

K

4-amino-1H-1,2,4-triazol

584-13-4

organická zásada

NC

(3) NC

P

4-(methylthio)-benzaldehyd

3446-89-7

elektrofil

NC

(3) NC

A

K

Kyselina laurová

143-07-7

organická kyselina

NC

(3) NC

P

Zkratky: č. CAS = Chemical Abstracts Service Registry Number (registrační číslo CAS) VRM = validovaná referenční metoda NC = nežíravý; A = ano; P = pevné; K = kapalné.

14.

V rámci prokazování způsobilosti se doporučuje, aby uživatel po obdržení modelu rekonstruované lidské epidermis ověřil bariérové vlastnosti tkání uvedené jeho výrobcem. To je zvláště důležité v případě, že se tkáně zasílají na dlouhé vzdálenosti nebo že jejich přeprava trvá dlouhou dobu. Pokud je zkušební metoda úspěšně zavedena a je prokázána způsobilost tuto metodu správně používat, není nutno takové ověřování běžně provádět. Při běžném používání zkušební metody se však doporučuje i nadále v pravidelných intervalech bariérové vlastnosti posuzovat.

POSTUP

15.

Následuje obecný popis složek a postupů zkušebních modelů s použitím rekonstruované lidské epidermis při hodnocení leptavých účinků na kůži, kterých se týká tato zkušební metoda. Modely RhE schválené jako vědecky validní pro použití v rámci této zkušební metody, tj. modely EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE a epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), lze získat z komerčních zdrojů. K dispozici jsou standardní pracovní postupy pro tyto čtyři modely RhE (34)(35)(36)(37), hlavní složky zkušebních metod jsou shrnuty v dodatku 2. Při provádění a používání jednoho z těchto modelů v laboratoři se doporučuje použít příslušný standardní pracovní postup. Zkoušení pomocí čtyř zkušebních modelů RhE zahrnutých v této zkušební metodě musí splňovat následující podmínky:

SLOŽKY ZKUŠEBNÍ METODY S POUŽITÍM REKONSTRUOVANÉ LIDSKÉ EPIDERMIS

Všeobecné podmínky

16.

K rekonstrukci epitelu je zapotřebí použít netransformované lidské keratinocyty. Pod funkční svrchní vrstvou epidermis nazývanou stratum corneum by mělo být přítomno několik vrstev životaschopných epitelových buněk (bazální vrstva, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum by mělo být vícevrstevné a obsahovat profil esenciálních lipidů k vytvoření funkční bariéry robustní natolik, aby vzdorovala rychlému průniku cytotoxických referenčních chemických látek, např. dodecylsulfátu sodného (SDS) nebo přípravku Triton X-100. Bariérová funkce by měla být prokázána a lze ji hodnotit buď určením koncentrace, při níž referenční chemická látka snižuje životaschopnost tkání o 50 % (IC50) po pevně stanovené expoziční době, nebo stanovením expoziční doby potřebné ke snížení životaschopnosti buněk o 50 % (ET50) po aplikaci referenční chemické látky v pevně stanovené koncentraci (viz odstavec 18). Zadržovací vlastnosti modelu rekonstruované lidské epidermis by měly zabránit průchodu materiálu v oblasti stratum corneum do životaschopné tkáně, což by vedlo k nesprávnému modelování expozice kůže. Model rekonstruované lidské epidermis by neměl být kontaminován bakteriemi, viry, mykoplazmaty ani houbovými mikroorganismy.

Funkční podmínky

Životaschopnost

17.

K určení míry životaschopnosti tkání se používá zkouška MTT (27). Vitální buňky tkáňového modelu redukují vitální barvivo MTT na modrou sraženinu formazanu, která je poté z tkáně extrahována pomocí isopropylalkoholu (nebo podobného rozpouštědla). Optická hustota samotného extrakčního rozpouštědla by měla být dostatečně malá, tzn. OD < 0,1. Extrahovaný formazan MTT může být kvantifikován pomocí standardního měření absorbance (OD) nebo spektrofotometrickým postupem HPLC/UPLC (38). Uživatelé modelu rekonstruované lidské epidermis by měli zajistit, aby každá použitá šarže modelu rekonstruované lidské epidermis splňovala stanovená kritéria pro negativní kontrolu. Rozsah přijatelnosti (horní a dolní mez) hodnot OD negativní kontroly je zapotřebí zjistit u subjektu, který model rekonstruované lidské epidermis vyvinul nebo dodává. Rozsahy přijatelnosti hodnot OD negativní kontroly pro čtyři validované zkušební modely RhE zařazené do této zkušební metody jsou uvedeny v tabulce 2. Uživatel spektrofotometrie HPLC/UPLC by měl jako kritérium přijatelnosti pro negativní kontrolu používat rozsahy OD negativní kontroly uvedené v tabulce 2. Je třeba doložit, že tkáně ošetřené negativní kontrolou jsou stabilně kultivovány (poskytují podobné naměřené hodnoty OD) po dobu trvání expozice.

Tabulka 2

Rozsahy přijatelnosti pro hodnoty OD negativní kontroly pro kontrolu kvality šarže

 

Dolní mez přijatelnosti

Horní mez přijatelnosti

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Bariérová funkce

18.

Stratum corneum a jeho lipidové složení by mělo dostačovat na to, aby odolávalo rychlému průniku určitých cytotoxických referenčních chemických látek (např. SDS nebo Triton X-100) podle odhadu na základě hodnoty IC50 nebo ET50 (tabulka 3). Bariérovou funkci každé šarže použitého modelu RhE by měl prokázat vývojář/prodejce modelu RhE při dodávce tkání koncovému uživateli (viz odstavec 21).

Morfologie

19.

Je třeba provést histologické vyšetření modelu RhE prokazující vícevrstevnou strukturu podobnou lidské epidermis, která obsahuje stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum a stratum corneum a má lipidový profil podobný lipidovému profilu lidské epidermis. Histologické vyšetření každé šarže použitého modelu RhE prokazující vhodnou morfologii tkání by měl poskytnout vývojář/prodejce modelu RhE při dodávce tkání koncovému uživateli (viz odstavec 21).

Reprodukovatelnost

20.

Uživatelé zkušebních metod by měli prokázat jejich reprodukovatelnost v čase s pozitivními a negativními kontrolami. Kromě toho by zkušební metoda měla být používána pouze v případě, že vývojář/dodavatel modelu RhE poskytne údaje prokazující reprodukovatelnost v čase s žíravými a nežíravými chemickými látkami například ze seznamu vhodných látek (tabulka 1). V případě použití zkušební metody pro podrobnou kategorizaci je třeba prokázat také reprodukovatelnost s ohledem na zařazení do podkategorií.

Kontrola kvality

21.

Model rekonstruované lidské epidermis by měl být použit pouze v případě, že subjekt, který jej vyvinul nebo dodává, prokáže, že každá použitá šarže modelu RhE splňuje stanovená produkční kritéria pro uvolnění do oběhu, přičemž mezi nejvýznamnější z nich patří kritéria životaschopnosti (odstavec 17), bariérové funkce (odstavec 18) a morfologie (odstavec 19). Tyto údaje se poskytnou uživatelům metody, aby je mohli uvést v závěrečné zprávě. Pro spolehlivou predikci klasifikace zkoušené látky jako látky s leptavými účinky mohou být přijatelné pouze výsledky získané za použití tkáňových šarží, které prošly kontrolou kvality. Rozsah přijatelnosti (horní a dolní mez) pro IC50 nebo ET50 stanoví subjekt, který model rekonstruované lidské epidermis vyvinul nebo dodává. V tabulce 3 jsou uvedeny rozsahy přijatelnosti pro čtyři validované zkušební modely.

Tabulka 3

Kritéria kontroly kvality pro uvolnění šarže do oběhu

 

Dolní mez přijatelnosti

Horní mez přijatelnosti

EpiSkin™ (SM) (18 hodin expozice za použití SDS) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100)(34)

ET50 = 4,0 hodiny

ET50 = 8,7 hodiny

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100)(35)

ET50 = 4,0 hodiny

ET50 = 10,0 hodin

epiCS® (1 % Triton X-100)(36)

ET50 = 2,0 hodiny

ET50 = 7,0 hodin

Aplikace zkoušených a kontrolních chemických látek

22.

Pro každou zkoušenou chemickou látku a pro kontroly pro jednotlivé expozice by se měly použít alespoň dva tkáňové replikáty. V případě kapalných a pevných chemických látek je zapotřebí nanést dostatečné množství zkoušené látky, aby rovnoměrně pokryla povrch epidermis, a současně se vyhnout nekonečné dávce, tzn. že je třeba použít nejméně 70 ?l/cm2 nebo 30 mg/cm2. V závislosti na modelech je nutno povrch epidermis před nanesením pevných chemických látek zvlhčit deionizovanou nebo destilovanou vodou, aby se zlepšil kontakt zkoušené chemické látky s povrchem epidermis (34) (35) (36) (37). Pevné látky by se měly pokud možno zkoušet ve formě jemného prášku. Aplikační metoda by měla být pro zkoušenou chemickou látku vhodná (viz např. odkazy (34–37). Na konci expoziční doby je nutno zkoušenou látku pečlivě spláchnout z epidermis vodným pufrem nebo 0,9 % roztokem NaCl. Podle toho, který ze čtyř validovaných zkušebních modelů RhE se používá, použijí se dvě nebo tři doby expozice na jednu zkoušenou chemickou látku (pro všechny čtyři platné modely RhE: 3 min. a 1 hodina; pro model EpiSkin™ čtyři další hodiny expozice). V závislosti na použitém zkušebním modelu RhE a posuzované době expozice se může inkubační teplota v průběhu expozice pohybovat v rozsahu od pokojové teploty do 37 oC.

23.

Při každém provedení zkoušky by se měly používat souběžné negativní kontroly a pozitivní kontroly, aby se prokázalo, že životaschopnost (při použití negativních kontrol), bariérová funkce a výsledná tkáňová citlivost tkání (při použití pozitivní kontroly) jsou v rámci stanoveného rozpětí dosavadních hodnot přijatelnosti. Navrženými chemickými látkami pro pozitivní kontrolu jsou ledová kyselina octová nebo 8N KOH v závislosti na použitém modelu RhE. Je třeba poznamenat, že 8N KOH přímo redukuje MTT, což může vyžadovat upravené kontroly, jak je popsáno v odstavcích 25 a 26. Navrženými látkami pro negativní kontrolu jsou 0,9 % (m/V) roztok NaCl nebo voda.

Měření životaschopnosti buněk

24.

K měření životaschopnosti buněk podle této zkušební metody by se měla používat zkouška MTT, což je kvantitativní zkouška (27). Vzorek tkáně se na dobu tří hodin vloží do roztoku MTT o vhodné koncentraci (0,3 nebo 1 mg/ml). Vysrážený modrý formazan se poté extrahuje z tkáně pomocí rozpouštědla (např. isopropylalkoholu nebo kyselého isopropylalkoholu) a koncentrace formazanu se změří určením OD při vlnové délce 570 nm za použití filtru o pásmové propustnosti nejvýše ± 30 nm nebo spektrofotometrickým postupem HPLC/UPLC (viz odstavce 30 a 31) (38).

25.

Zkoušené chemické látky mohou interferovat se zkouškou MTT, a to přímou redukcí MTT na modrý formazan, anebo barevnou interferencí, jestliže zkoušená chemická látka absorbuje, přirozeně nebo v důsledku experimentálních postupů, ve stejném rozsahu OD jako formazan (570 ± 30 nm, zejména modré a fialové chemické látky). Měly by se používat i další kontroly za účelem zjištění a korigování případné interference těchto zkoušených chemických látek, jako je kontrola na nespecifickou redukci MTT (NSMTT) a kontrola na nespecifické zbarvení (NSC) (viz odstavce 26 až 30). To je zvláště důležité v případě, že se určitá zkoušená chemická látka opláchnutím z tkáně zcela neodstraní nebo že pronikne do epidermis, takže je přítomna v tkáních, když se provádí zkouška životaschopnosti MTT. Podrobný popis, jak korigovat přímou redukci MTT a interference způsobené barvivy, lze nalézt ve standardních prováděcích postupech zkušebních modelů (34) (35) (36) (37).

26.

Aby bylo možné identifikovat přímá redukční činidla MTT, je třeba každou zkoušenou chemickou látku přidávat do čerstvě připraveného média MTT (34) (35) (36) (37). Jestliže směs MTT obsahující zkoušenou chemickou látku zmodrá/zfialoví, je zkoušená chemická látka považována za přímé redukční činidlo MTT, přičemž je třeba provést další funkční kontrolu na neživotaschopné epidermis nezávisle na použití standardního měření absorbance (OD) nebo spektrofotometrického postupu HPLC/UPLC. Tato další funkční kontrola využívá neživé tkáně, které mají pouze zbytkovou metabolickou aktivitu, ale absorbují zkoušenou chemickou látku v podobném množství jako životaschopné tkáně. Každá chemická látka redukující MTT se aplikuje na nejméně dva neživé tkáňové replikáty na každou dobu expozice, které se podrobí celé zkoušce leptavých účinku na kůži. Skutečná životaschopnost tkáně se poté vypočítá jako procentuální životaschopnost tkáně získaná z živých tkání vystavených působení redukčního činidla MTT minus procentuální nespecifická redukce MTT získaná z neživých tkání vystavených stejnému redukčnímu činidlu MTT, počítáno ve vztahu k negativní kontrole prováděné souběžně s korigovanou zkouškou (% NSMTT).

27.

Aby bylo možné zjistit potenciální interferenci zabarvených zkoušených chemických látek nebo zkoušených chemických látek, které se zabarvily při kontaktu s vodou nebo isopropylalkoholem, a rozhodnout, zda je nutné provést další kontroly, je třeba provést spektrální analýzu zkoušené chemické látky ve vodě (prostředí v průběhu expozice) anebo v isopropylalkoholu (extrakční roztok). Jestliže zkoušená chemická látka ve vodě anebo isopropylalkoholu absorbuje světlo v pásmu 570 ± 30 nm, je třeba provést další kontroly s barvivy, případně použít spektrofotometrický postup HPLC/UPLC, přičemž v tomto případě nejsou tyto kontroly nutné (viz odstavce 30 a 31). Při provádění standardního měření absorbance (OD) se každá interferující zbarvená zkoušená chemická látka aplikuje na alespoň dva životaschopné tkáňové replikáty na jednu dobu expozice, které se podrobí celé zkoušce na leptavé účinky pro kůži, ale v průběhu inkubačního kroku MTT se inkubují v médiu místo roztoku MTT za účelem vytvoření kontroly nespecifického zbarvení (NSCliving). Vzhledem k inherentní biologické variabilitě živých tkání je třeba kontrolu NSCliving provádět souběžně na každou dobu expozice s každou zbarvenou zkoušenou chemickou látkou (při každém provedení zkoušky). Skutečná životaschopnost tkáně se poté vypočítá jako procentuální životaschopnost tkáně získaná z živých tkání vystavených působení interferující zkoušené chemické látky a inkubovaných v roztoku MTT minus procentuální nespecifické zbarvení získané z živých tkání vystavených působení interferující zkoušené chemické látky a inkubovaných v roztoku bez MTT, prováděno souběžně s korigovanou zkouškou (% NSCliving).

28.

Zkoušené chemické látky, u nichž se zjistí, že přímo redukují MTT (viz odstavec 26) a působí barevné interference (viz odstavec 27), budou při provádění standardního měření absorbance (OD) také vyžadovat třetí skupinu kontrol vedle kontrol NSMTT a NSCliving popsaných v předchozích odstavcích. Obvykle je tomu tak u tmavě zbarvených zkoušených chemických látek interferujících s analýzou MTT (např. modré, fialové, černé), protože jejich vlastní barva narušuje posouzení jejich schopnosti přímo redukovat MTT, jak je popsáno v odstavci 26. Tyto zkoušené chemické látky se mohou vázat na živé i neživé tkáně, a proto kontrola NSMTT musí nejen korigovat potenciální přímou redukci MTT způsobenou zkoušenou chemickou látkou, ale také barevnou interferenci vznikající z vazby zkoušené chemické látky na neživé tkáně. Mohlo by to vést k dvojí korekci barevné interference, protože kontrola NSCliving již koriguje barevnou interferenci vznikající z vazby zkoušené chemické látky na živé tkáně. Aby byla vyloučena možná dvojí korekce barevné interference, je třeba provést třetí kontrolu na nespecifické zbarvení u neživých tkání (NSCkilled). Při této další kontrole se zkoušená chemická látka aplikuje na alespoň dva neživé tkáňové replikáty na jednu dobu expozice, které se podrobí celé zkoušce, ale v průběhu inkubačního kroku MTT se inkubují v médiu místo roztoku MTT. Postačí jedna kontrola NSCkilled na zkoušenou chemickou látku bez ohledu na počet provedených nezávislých zkoušek/experimentů, ale tuto kontrolu je třeba provést souběžně s kontrolou NSMTT a pokud možno se stejnou šarží tkáně. Skutečná životaschopnost tkáně se poté vypočítá jako procentuální životaschopnost tkáně získaná z živých tkání vystavených působení zkoušené chemické látky minus % NSMTT minus % NSCliving plus procentuální nespecifické zbarvení získané z neživých tkání vystavených působení interferující zkoušené chemické látky a inkubovaných v roztoku bez MTT, počítáno ve vztahu k negativní kontrole prováděné souběžně s korigovanou zkouškou (% NSCkilled).

29.

Je důležité uvést, že nespecifická redukce MTT a nespecifické barevné interference mohou zvýšit odečty tkáňového extraktu nad rozsah linearity spektrofotometru. Z tohoto důvodu by měla každá laboratoř stanovit rozsah linearity svého spektrofotometru s použitím formazanu MTT (č. CAS 57360-69-7) z komerčního zdroje, než zahájí testování zkoušených chemických látek pro regulační účely. Pro posouzení zkoušených chemikálií, které přímo redukují MTT a působí barevné interference, když je optická hustota tkáňových extraktů zjištěná za použití zkoušené chemikálie bez korekce přímé redukce MTT anebo barevné interference v lineárním rozsahu spektrofotometru nebo když již byla zkoušená chemická látka definována jako látka s leptavými účinky podle zjištěné nekorigované procentuální životaschopnosti (viz odstavce 35 a 36), je vhodné zejména standardní měření absorbance (OD) pomocí spektrofotometru. Výsledky u zkoušených chemických látek, které dávají % NSMTT anebo % NSCliving > 50 % negativní kontroly, je třeba posuzovat opatrně.

30.

U barevných zkoušených chemických látek, které nejsou kompatibilní se standardním měřením absorbance (OD) vzhledem k příliš velké interferenci se zkouškou MTT, může být použit alternativní HPLC/UPLC spektrofotometrický postup měření formazanu MTT (viz odstavec 31) (37). Spektrofotometrický systém HPLC/UPLC umožňuje oddělit formazan MTT od zkoušené chemické látky před její kvantifikací (38). Z tohoto důvodu se při použití spektrofotometrie HPLC/UPLC nepožadují kontroly NSCliving ani NSCkilled, a to nezávisle na zkoušené chemické látce. Kontroly NSMTT by se však měly použít, pokud existuje podezření, že zkoušená chemická látka přímo redukuje MTT, nebo v případě, že má barvu, která znesnadňuje posouzení schopnosti přímé redukce MTT (jak je popsáno v odstavci 26). Při použití spektrofotometrie HPLC/UPLC na měření formazanu MTT se procentuální životaschopnost tkáně vypočítá jako procentuální plocha píku formazanu MTT získaná z živých tkání vystavených působení zkoušené chemické látky ve vztahu k píku formazanu MTT získanému při souběžné negativní kontrole. U zkoušených chemických látek, které dokážou přímo redukovat MTT, se skutečná životaschopnost tkáně vypočítá jako procentuální životaschopnost tkáně získaná z živých tkání vystavených působení zkoušené chemické látky minus % NSMTT. Konečně je třeba uvést, že přímá redukční činidla MTT, jež mohou být také barevně interferující a která zůstanou v tkáních po expozici a redukují MTT tak silně, že to vede k takovým hodnotám optické hustoty (při využití standardního měření OD) nebo plochám píků (při použití spektrofotometrie UPLC/HPLC) zkoušených tkáňových extraktů, které spadají mimo rozsah linearity spektrofotometrie, nelze posuzovat, i když lze očekávat, že k tomu dochází velmi vzácně.

31.

Spektrofotometrie HPLC/UPLC může být použita také u všech druhů zkoušených chemických látek (barevných, nebarevných, látek redukujících MTT i látek, které MTT neredukují) pro měření formazanu MTT (38). Vzhledem k různým spektrofotometrickým systémům HPLC/UPLC je třeba prokázat způsobilost spektrofotometrického systému HPLC/UPLC před jeho použitím pro kvantifikaci formazanu MTT z tkáňových extraktů splněním kritérií přijatelnosti pro skupinu standardních parametrů způsobilosti vycházejících z parametrů popsaných v pokynu amerického Úřadu pro potraviny a léčiva pro průmysl k validaci bioanalytických metod (38) (39). Tyto klíčové parametry a jejich kritéria přijatelnosti jsou uvedeny v dodatku 4. Po splnění kritérií přijatelnosti definovaných v dodatku 4 je spektrofotometrický systém HPLC/UPLC považován za způsobilý a připravený na měření formazanu MTT za experimentálních podmínek popsaných v této zkušební metodě.

Kritéria přijatelnosti

32.

U každé zkušební metody s použitím platných modelů rekonstruované lidské epidermis by tkáně ošetřené negativní kontrolou měly vykazovat hodnoty OD odrážející kvalitu tkání, jak je popsáno v tabulce 2, a neměly by být pod dosud zjištěnými dolními hranicemi. Tkáně ošetřené pozitivní kontrolou, tj. ledovou kyselinou octovou nebo 8N KOH, by měly odrážet schopnost tkání reagovat na žíravou chemickou látku v podmínkách zkušebního modelu (viz dodatek 2). Variabilita mezi tkáňovými replikáty u zkoušené chemické látky a/nebo kontrolních chemických látek by měla spadat do přijatelných limitů pro každý požadavek platného modelu RhE (viz dodatek 2) (např. rozdíl životaschopnosti mezi dvěma tkáňovými replikáty by neměl přesahovat 30 %). Jestliže se negativní nebo pozitivní kontrola zařazená do zkoušky nachází mimo přijatelné rozsahy, je toto provedení zkoušky považováno za nezpůsobilé a zkoušku je třeba opakovat. Jestliže se variabilita zkoušených chemických látek pohybuje mimo definovaný rozsah, je třeba jejich zkoušení opakovat.

Interpretace výsledků a predikční model

33.

Hodnoty absorbance OD dosažené pro každou zkoušenou chemickou látku by měly být použity k výpočtu životaschopnosti v procentech vzhledem k negativní kontrole, která je stanovena na úroveň 100 %. Při použití spektrofotometrie HPLC/UPLC se procentuální životaschopnost tkáně vypočítá jako procentuální plocha píku formazanu MTT získaná z živých tkání vystavených působení zkoušené chemické látky ve vztahu k píku formazanu MTT získanému při souběžné negativní kontrole. Hraniční procentuální hodnoty životaschopnosti buněk, kterými se rozlišují žíravé zkoušené chemické látky od nežíravých (nebo kterými se rozlišují různé podkategorie leptavých účinků), jsou definovány níže v odstavcích 35 a 36 pro jednotlivé modely zahrnuté do této zkušební metody a měly by se používat pro interpretaci výsledků.

34.

U zkoušené chemické látky s jednoznačnou výslednou klasifikací by mělo stačit jedno provedení zkoušky za použití alespoň dvou tkáňových replikátů. Avšak v případě hraničních výsledků, jako jsou například nesouhlasné výsledky opakovaných měření, lze zvážit druhé provedení zkoušky, jakož i třetí provedení zkoušky v případě nesouhlasných výsledků mezi prvními dvěma provedeními zkoušky.

35.

Predikční model pro zkušební model EpiSkin™ pro leptavé účinků na kůži (9) (34) (22), související se systémem klasifikace GHS OSN/CLP, je uveden v tabulce 4:

Tabulka 4

Predikční model EpiSkin™

Životaschopnost měřená po časových intervalech expozice (t=3, 60 a 240 minut)

Zvážit predikci

< 35 % po 3 minutách expozice

Žíravá:

Doplňková podkategorie 1A (*1)

? 35 % po 3 minutách expozice A

< 35 % po 60 minutách expozice

NEBO

? 35 % po 60 minutách expozice A

< 35 % po 240 minutách expozice

Žíravá:

Kombinace doplňkových podkategorií 1B a 1C

? 35 % po 240 minutách expozice

Nežíravá

36.

Predikční modely pro zkušební modely leptavých účinků na kůži EpiDerm™ SCT (10) (23) (35), SkinEthic™ RHE (17) (18) (23) (36) a epiCS® (16) (23) (37), související se systémem klasifikace GHS OSN/CLP, jsou uvedeny v tabulce 5:

Tabulka 5

EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE a epiCS®

Životaschopnost měřená po časových intervalech expozice (t = 3 a 60 minut)

Zvážit predikci

KROK 1 pro EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE a epiCS®

< 50 % po 3 minutách expozice

Žíravá

? 50 % po 3 minutách expozice A < 15 % po 60 minutách expozice

Žíravá

? 50 % po 3 minutách expozice A ? 15 % po 60 minutách expozice

Nežíravá

KROK 2 pro EpiDerm™ SCT - pro látky/směsi určené v kroku 1 jako žíravé

< 25 % po 3 minutách expozice

Doplňková podkategorie 1A*

? 25 % po 3 minutách expozice

Kombinace doplňkových podkategorií 1B a 1C

KROK 2 pro SkinEthic™ RHE - pro látky/směsi určené v kroku 1 jako žíravé

< 18 % po 3 minutách expozice

Doplňková podkategorie 1A*

? 18 % po 3 minutách expozice

Kombinace doplňkových podkategorií 1B a 1C

KROK 2 pro epiCS® - pro látky/směsi určené v kroku 1 jako žíravé

< 15 % po 3 minutách expozice

Doplňková podkategorie 1A*

? 15 % po 3 minutách expozice

Kombinace doplňkových podkategorií 1B a 1C

ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV

Údaje

37.

Za každou zkoušku by se údaje získané z jednotlivých tkáňových replikátů (např. hodnoty OD a vypočítaná životaschopnost buněk v procentech pro každou zkoušenou chemickou látku, a to včetně její klasifikace) měly vykazovat ve formě tabulky, popřípadě včetně údajů z opakovaných experimentů. Dále by měly být uvedeny střední hodnoty a rozsahy životaschopnosti a variační koeficienty mezi tkáňovými replikáty pro každou zkoušku. Pozorované interakce s činidlem MTT a látkami, které MTT přímo redukují, nebo barevnými zkoušenými chemickými látkami je nutno uvádět za každou zkoušenou chemickou látku.

ZÁVĚREČNÁ ZPRÁVA

38.

Závěrečná zpráva by měla obsahovat tyto informace:

 

Zkoušená chemická látka a kontrolní chemické látky:

jednosložková látka: chemická identifikace, např. název podle IUPAC nebo CAS, číslo CAS, kód SMILES nebo InChI, strukturní vzorec, čistota, případně chemická identita nečistot, je-li to prakticky možné, atd.

vícesložková látka, UVCB a směs: charakterizované pokud možno chemickou identitou (viz výše), kvantitativním výskytem a relevantními fyzikálně-chemickými vlastnostmi složek,

fyzický vzhled, rozpustnost ve vodě a další relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti,

zdroj, číslo šarže, jsou-li k dispozici,

případně ošetření zkoušené chemické látky / kontrolní látky před zkoušením (např. zahřátí, mletí),

stabilita zkoušené chemické látky, datum použitelnosti nebo datum opětovné analýzy, je-li známo,

podmínky skladování.

 

Použitý model RhE a protokol a jeho (případné) zdůvodnění

 

Zkušební podmínky:

použitý model rekonstruované lidské epidermis (včetně čísla šarže),

kalibrační údaje o měřicím zařízení (např. spektrofotometrie), (případně) vlnová délka a pásmová propustnost použitá pro kvantifikaci formazanu MTT a rozsah linearity měřicího zařízení,

popis metody použité pro kvantifikaci formazanu MTT,

případně popis způsobilosti spektrofotometrického systému HPLC/UPLC,

úplné podklady ke konkrétnímu použitému modelu rekonstruované lidské epidermis včetně jeho chování při zkoušce. Ty by měly zejména zahrnovat:

i)

životaschopnost;

ii)

bariérovou funkci;

iii)

morfologii;

iv)

reprodukovatelnost a prediktivní schopnost;

v)

kontroly kvality modelu;

odkaz na historické údaje modelu. Ten by měl zejména zahrnovat přijatelnost údajů QC s odkazem na historické údaje šarže,

prokázání způsobilosti při provádění zkušební metody před rutinním použitím při zkoušení látek pro prokázání způsobilosti.

 

Postup zkoušky:

podrobnosti použitého zkušebního postupu (včetně postupů vymývání použitých po expozici),

dávky zkoušené chemické látky a použitých kontrolních chemických látek,

délka doby (dob) expozice a teploty (teplot) expozice,

přehled kontrol použitých pro látky, které přímo redukují MTT, případně pro zbarvující zkoušené chemické látky,

počet tkáňových replikátů použitých na jednu zkoušenou chemickou látku a kontroly (pozitivní kontrola, negativní kontrola a NSMTT, případně NSCliving a NSCkilled) na každou dobu expozice,

popis použitých kritérií rozhodování / predikčního modelu podle použitého modelu RhE,

popis jakýchkoli změn zkušebního postupu (včetně postupů vymývání).

 

Kritéria přijatelnosti každého provedení zkoušky:

střední hodnoty pozitivních a negativních kontrol a rozpětí přijatelnosti založené na porovnání s historickými údaji,

přijatelná variabilita mezi tkáňovými replikáty pro pozitivní a negativní kontroly,

přijatelná variabilita mezi tkáňovými replikáty pro zkoušenou chemickou látku.

 

Výsledky:

tabulka s údaji o jednotlivých zkoušených chemických látkách a kontrolách pro každou dobu expozice, každé provedení zkoušky a každé měření replikátů včetně hodnot OD nebo plochy píku formazanu MTT, procentuální životaschopnosti tkáně, střední procentuální životaschopnosti tkáně, rozdílů mezi replikáty, případně běžných odchylek a variačních koeficientů,

případně výsledky kontrol použitých pro přímá redukční činidla MTT anebo zbarvující zkoušené chemické látky včetně hodnot OD nebo plochy píku formazanu MTT, %NSMTT, %NSCliving, %NSCkilled, rozdílů mezi tkáňovými replikáty, (případně) běžných odchylek a variačních koeficientů a konečná korigovaná procentuální životaschopnost tkáně,

výsledky získané u zkoušených chemických látek a kontrolních chemických látek ve vztahu k definovaným kritériím přijatelnosti každého provedení zkoušky,

popis ostatních pozorovaných účinků,

odvozená klasifikace s odkazem na použitý predikční model / kritéria rozhodování.

 

Diskuse o výsledcích

 

Závěry

LITERATURA

(1)

UN (2013). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS) (Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek Organizace spojených národů). Fifth Revised Edition, UN New York and Geneva. Dostupné na internetových stránkách: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html

(2)

Kapitola B.4 této přílohy, Akutní dráždivé/leptavé účinky na kůži.

(3)

Kapitola B.40 této přílohy, Leptavé účinky na kůži in vitro.

(4)

Kapitola B.65 této přílohy, Zkušební metoda s využitím membránové bariéry in vitro.

(5)

Kapitola B.46 této přílohy, Dráždivost pro kůži in vitro: Zkušební metoda za použití rekonstruované lidské epidermis.

(6)

OECD (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23:219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the Test Chemicals. Toxicol.In Vitro 12:471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhutter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol.in Vitro 12:483-524.

(10)

Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill, P., Wilkins S., Wiemann C., Kaufmann T., Remmele M. and Holzhütter H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371-401.

(11)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. et Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129-147.

(12)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. Publikace NIH č. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(13)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. Publikace NIH č. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(14)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(15)

EC-ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC14), 21 March 2000.

(16)

Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr H.J., Vohr H.W. and Fuchs H.W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol.In Vitro 19: 925-929.

(17)

Kandárová H., Liebsch M., Spielmann,H., Genschow E., Schmidt E., Traue D., Guest R., Whittingham A., Warren N, Gamer A.O., Remmele M., Kaufmann T., Wittmer E., De Wever B., and Rosdy M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol.In Vitro 20: 547-559.

(18)

Tornier C., Roquet M. and Fraissinette A.B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0,5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. Chem. In Vitro 24: 1379-1385.

(19)

EC-ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC25), 17 November 2006.

(20)

EC-ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 12 June 2009.

(21)

OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 190). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(22)

Alépée N., Grandidier M.H., and Cotovio J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. Chem. In Vitro 28:131-145.

(23)

Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N., and Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. Chem. In Vitro 29:2055-2080.

(24)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 219). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(25)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 34) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(26)

Eskes C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62:393-403.

(27)

Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55-63.

(28)

Tinois E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. In: In Vitro Skin Toxicology. Rougier A.,. Goldberg A.M and Maibach H.I. (Eds): 133-140.

(29)

Cannon C. L., Neal P.J., Southee J.A., Kubilus J. and Klausner M. (1994), New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol.in Vitro 8:889 - 891.

(30)

Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J and Mommaas M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211 - 225.

(31)

Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. and Thivolet J. (1991). In Vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310-319.

(32)

Parenteau N.L., Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS and Rosenberg M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9:163-171.

(33)

Wilkins L.M., Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF and Parenteau N.L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747-756.

(34)

EpiSkin™ SOP (December 2011). INVITTOX Protocol (No 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.

(35)

EpiDerm™ SOP (February 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation's Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.

(36)

SkinEthic™ RHE SOP (January 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.

(37)

EpiCS® SOP (January 2012). Version 4.1 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1000 (epiCS® ) CellSystems.

(38)

Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes K.R., Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M., and McNamee P. Use of HPLC/UPLC- spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)- based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. Chem. In Vitro 29: 741-761.

(39)

US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (May 2001). Dostupné na internetových stránkách: [http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].

Dodatek 1

DEFINICE

Přesnost: : přesnost shody mezi výsledky zkušební metody a přijatými referenčními hodnotami. Je to míra funkčnosti zkušební metody a jeden z aspektů její relevantnosti. Tento pojem se často používá místo pojmu „soulad“ a rozumí se jím podíl správných výsledků zkušební metody (25).

Životaschopnost buněk : parametr měřící celkovou aktivitu buněčné populace, např. jako schopnost buněčných mitochondriálních dehydrogenáz redukovat vitální barvivo MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid, thiazolylová modř), které v závislosti na naměřené sledované vlastnosti a koncepci použité zkoušky koreluje s celkovým počtem a/nebo vitalitou živých buněk.

Chemická látka : Látka nebo směs.

Soulad : je měřítkem funkčnosti u zkušebních metod poskytujících kategorické výsledky a je jedním z aspektů její relevantnosti. Tento pojem se někdy používá místo pojmu „přesnost“ a je definován jako podíl všech zkoušených chemických látek, které jsou správně klasifikovány jako pozitivní nebo negativní. Soulad závisí do velké míry na prevalenci pozitivních výsledků u druhů studovaných zkoušených chemických látek (25).

ET50 : tuto hodnotu lze odhadnout na základě určení doby expozice potřebné k tomu, aby se životaschopnost buněk snížila o 50 % po aplikaci referenční chemické látky v pevně stanovené koncentraci, viz rovněž IC50.

GHS (Globálně harmonizovaný systém klasifikace a označování chemických látek) : systém navrhující klasifikaci chemických látek a směsí podle standardizovaných typů a úrovní fyzikálních, zdravotních a environmentálních nebezpečí a zabývající se příslušnými komunikačními prvky, jako jsou piktogramy, signální slova, výroky o nebezpečí, výroky o bezpečnostních opatřeních a bezpečnostní datové listy, které obsahují informace o jejich nežádoucích účincích s ohledem na ochranu lidí (včetně zaměstnavatelů, pracovníků, přepravců, spotřebitelů a osob reagujících na nouzové situace) a životního prostředí (1).

HPLC : vysokoúčinná kapalinová chromatografie

IATA : integrovaný přístup ke zkoušení a posuzování.

IC50 : tuto hodnotu lze odhadnout na základě určení koncentrace, při níž referenční chemická látka snižuje životaschopnost tkání o 50 % (IC50) po pevně stanovené době expozice, viz rovněž ET50.

Nekonečná dávka : množství zkoušené látky nanesené na epidermis, které přesahuje množství potřebné k úplnému a rovnoměrnému pokrytí povrchu epidermis.

Směs : směs nebo roztok tvořený dvěma nebo více látkami, které v něm nereagují.

Jednosložková látka : látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna jedna hlavní složka v míře alespoň 80 % hmot.

MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid, thiazolylová modř.

Vícesložková látka : látka definovaná svým kvantitativním složením, v níž je přítomna více než jedna hlavní složka v koncentraci > 10 % hmot. a < 80 % hmot. Vícesložková látka je výsledkem výrobního procesu. Rozdíl mezi směsí a vícesložkovou látkou spočívá v tom, že směs se získá smísením dvou nebo více látek bez chemické reakce. Vícesložková látka je výsledkem chemické reakce.

NC („non-corrosive“):: nežíravá látka.

Kontrola NSCkilled : nespecifická barevná kontrola u neživých tkání.

Kontrola NSCliving: : nespecifická barevná kontrola u živých tkání.

NSMTT : nespecifická redukce MTT.

OD : optická hustota.

Pozitivní kontrola : replika obsahující všechny složky zkušebního systému a zkoušená s chemickou látkou, o níž je známo, že způsobuje pozitivní odezvu. Aby se zajistilo, že proměnlivost v odezvě na pozitivní kontrolu bude možné časem vyhodnotit, neměl by být rozsah pozitivní odezvy nadměrný.

Standardy funkčnosti : standardy založené na validované zkušební metodě, které slouží jako základ pro hodnocení srovnatelnosti navrhované zkušební metody, která je mechanicky a funkčně podobná. Patří mezi ně: i) zásadní složky zkušební metody; ii) minimální seznam srovnávacích látek vybraných z chemických látek používaných k prokázání přijatelné funkčnosti validované zkušební metody; a iii) srovnatelné úrovně spolehlivosti a přesnosti založené na hodnotách získaných u validované zkušební metody, jež by navrhovaná zkušební metoda měla prokázat při vyhodnocení za použití minimálního seznamu srovnávacích látek (25).

Relevantnost : popis vztahu zkušební metody k účinku, který je předmětem zájmu, a také toho, zda je zkušební metoda smysluplná a použitelná pro konkrétní účel. Vyjadřuje, do jaké míry zkušební metoda správně měří nebo predikuje biologický účinek, který je předmětem zájmu. Relevantnost zahrnuje také posouzení přesnosti (shody) zkušební metody (25).

Spolehlivost : měření rozsahu, v jakém může být zkušební metoda časem reprodukovatelná v laboratořích a mezi laboratořemi, když se provádí s použitím stejného protokolu. Hodnotí se na základě výpočtu vnitrolaboratorní a mezilaboratorní reprodukovatelnosti (25).

Provedení zkoušky : jedna či více zkoušených chemických látek se zkouší souběžně s negativní kontrolou a s pozitivní kontrolou.

Citlivost : podíl všech pozitivních/aktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně klasifikovány. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (25).

Leptavé účinky na kůži in vivo : vyvolání nevratného poškození kůže, zejména viditelné, do koria zasahující nekrózy pokožky, do čtyř hodin po aplikaci zkoušené chemické látky. Reakce po poleptání se projevují vředy, krvácením, krvavými strupy a v závěru čtrnáctidenního pozorování ztrátou barvy v důsledku vyblednutí kůže, úplnými ložisky alopecie a jizvami. K vyhodnocení sporných lézí by se měla uvážit histopatologie.

Specifičnost : podíl všech negativních/neaktivních chemických látek, které jsou na základě zkušební metody správně klasifikovány. Je měřítkem přesnosti zkušební metody, která poskytuje kategorické výsledky, a je důležitým prvkem při hodnocení relevantnosti zkušební metody (25).

Látka : chemický prvek a jeho sloučeniny v přírodním stavu nebo získané výrobním postupem, včetně jakýchkoliv aditiv potřebných pro zachování stability výrobku a všech nečistot pocházejících z použitého postupu, ale s vyloučením všech rozpouštědel, která je možno oddělit bez ovlivnění stability dané látky nebo změny jejího složení.

Zkoušená chemická látka : jakákoli látka nebo směs zkoušená touto zkušební metodou.

UPLC : ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie.

UVCB : látky s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexní reakční produkty nebo biologický materiál.

Dodatek 2

HLAVNÍ SLOŽKY ZKUŠEBNÍCH MODELŮ RHE VALIDOVANÝCH PRO ZKOUŠENÍ LEPTAVÝCH ÚČINKŮ NA KŮŽI

Složky zkušebních modelů

EpiSkinTM

EpiDermTM SCT

SkinEthicTM RHE

epiCS®

Povrch modelu

0,38 cm2

0,63 cm2

0,5 cm2

0,6 cm2

Počet tkáňových replikátů

Nejméně 2 na každou dobu expozice

2–3 na každou dobu expozice

Nejméně 2 na každou dobu expozice

Nejméně 2 na každou dobu expozice

Experimentální dávky a aplikace

Kapaliny a viskózní látky: 50 ?l ± 3 ?l (131,6 ?l/cm2)

Pevné látky: 20 ± 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 ?l ± 5?l roztoku NaCl (9 g/l)

Vosky/lepivé látky: 50 ± 2 mg (131,6 mg/cm2) s nylonovou síťkou

Kapaliny: 50 ?l (79,4 ?l/cm2) s nylonovou síťkou nebo bez ní

Kompatibilita zkoušené chemické látky s nylonovou síťkou před zkouškou

Polotuhé látky: 50 ?l (79,4 ?l/cm2)

Pevné látky: 25 ?l H2O (nebo více v případě potřeby) + 25 mg (39,7 mg/cm2)

Vosky: ploché „ kotouče“ o průměru přibližně 8 mm umístěné na tkáň zvlhčenou 15 ?l H2O.

Kapaliny a viskózní látky: 40 ?l ± 3?l (80 ?l/cm2) s použitím nylonové síťky

Kompatibilita zkoušené chemické látky s nylonovou síťkou před zkouškou

Pevné látky: 20 ?l ± 2?l H2O + 20 ± 3 mg (40 mg/cm2)

Vosky/lepivé látky: 20 ± 3 mg (40 mg/cm2) s použitím nylonové síťky

Kapaliny: 50 ?l (83,3 ?l/cm2) s použitím nylonové síťky

Kompatibilita zkoušené chemické látky s nylonovou síťkou před zkouškou

Polotuhé látky: 50 ?l (83,3 ?l/cm2)

Pevné látky: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 ?l H2O (nebo více v případě potřeby)

Vosky: ploché „ kotouče“ o průměru přibližně 8 mm umístěné na tkáň zvlhčenou 15 ?l H2O.

Předběžná kontrola na přímou redukci MTT

50 ?l (kapalina) nebo 20 mg (pevná látka)+ 2 ml MTT

roztoku 0,3 mg/ml po dobu 180 ± 5 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

? jestliže roztok zmodrá/zfialoví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na tkáni usmrcené vodou

50 ?l (kapalina) nebo 25 mg (pevná látka)+ 1 ml MTT

roztoku 1 mg/ml po dobu 60 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

? jestliže roztok zmodrá/zfialoví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na tkáni usmrcené zmrazením

40 ?l (kapalina) nebo 20 mg (pevná látka)+ 1 ml MTT

1 mg/ml roztoku po dobu 180 ± 15 min při teplotě 37 °C, 5 % CO2, 95 % RH

? jestliže roztok zmodrá/zfialoví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na tkáni usmrcené zmrazením

50 ?l (kapalina) nebo 25 mg (pevná látka)+ 1 ml MTT

roztoku 1 mg/ml po dobu 60 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

? jestliže roztok zmodrá/zfialoví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na tkáni usmrcené zmrazením

Předběžná kontrola na barevnou interferenci

10 ?l (kapalina) nebo 10 mg (pevná látka) + 90 ?l H2O mícháno po dobu 15 min při pokojové teplotě

? jestliže se roztok zbarví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na živé tkáni

50 ?l (kapalina) nebo 25 mg (pevná látka) + 300 ?l H2O po dobu 60 min při teplotě 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

? jestliže se roztok zbarví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na živé tkáni

40 ?l (kapalina) nebo 20 mg (pevná látka) + 300 ?l H2O mícháno po dobu 60 min při pokojové teplotě

? jestliže se zkoušená chemická látka zbarví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na živé tkáni

50 ?l (kapalina) nebo 25 mg (pevná látka) + 300 ?l H2O po dobu 60 min při teplotě 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

? jestliže se roztok zbarví, je třeba provést přizpůsobené kontroly na živé tkáni

Doba expozice a teplota

3 min, 60 min (± 5 min) a 240 min (± 10 min)

Ve ventilované skříni Pokojová teplota (RT, 18–28oC)

3 min při pokojové teplotě a 60 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

3 min při pokojové teplotě a 60 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

3 min při pokojové teplotě a 60 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

Oplachování

25 ml 1 x PBS (2 ml/na ponoření)

20krát stálým mírným proudem 1 x PBS

20krát stálým mírným proudem 1 x PBS

20krát stálým mírným proudem 1 x PBS

Negativní kontrola

50 ?l roztoku NaCl (9 g/l)

Zkoušeno u každé doby expozice

50 ?l H2O

Zkoušeno u každé doby expozice

40 ?l H2O

Zkoušeno u každé doby expozice

50 ?l H2O

Zkoušeno u každé doby expozice

Pozitivní kontrola

50 ?l ledové kyseliny octové

Zkoušeno pouze po dobu 4 hodin

50 ?l 8N KOH

Zkoušeno u každé doby expozice

40 ?l 8N KOH

Zkoušeno pouze po dobu 1 hodiny

50 ?l 8N KOH

Zkoušeno u každé doby expozice

Roztok MTT

2 ml 0,3 mg/ml

300 ?l 1 mg/ml

300 ?l 1 mg/ml

300 ?l 1 mg/ml

Doba inkubace MTT a teplota

180 min (± 15 min) při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

180 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

180 min (± 15 min) při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

180 min při 37 oC, 5 % CO2, 95 % RH

Extrakční rozpouštědlo

500 ?l acidifikovaného isopropylalkoholu

(0,04 N HCl v isopropylalkoholu)

(izolovaná tkáň plně ponořená)

2 ml isopropylalkoholu

(extrakce z horní a dolní části vložky)

1,5 ml isopropylalkoholu

(extrakce z horní a dolní části vložky)

2 ml isopropylalkoholu

(extrakce z horní a dolní části vložky)

Doba a teplota extrakce

Přes noc při pokojové teplotě, chráněno před světlem

Přes noc bez protřepávání při pokojové teplotě nebo 120 minut s protřepáváním (~120 rpm) při pokojové teplotě

Přes noc bez protřepávání při pokojové teplotě nebo 120 minut s protřepáváním (~120 rpm) při pokojové teplotě

Přes noc bez protřepávání při pokojové teplotě nebo 120 minut s protřepáváním (~120 rpm) při pokojové teplotě

Odečet OD

570 nm (545–595 nm) bez referenčního filtru

570 nm (nebo 540 nm) bez referenčního filtru

570 nm (540–600 nm) bez referenčního filtru

540–570 nm bez referenčního filtru

Kontrola kvality tkání

18 hodin expozice za použití SDS

1,0 mg/ml ? IC50 ? 3,0 mg/ml

Expozice za použití 1 % Tritonu X-100

4,08 hodiny ? ET50 ? 8,7 hodiny

Expozice za použití 1 % Tritonu X-100

4,0 hodiny ? ET50 ? 10,0 hodin

Expozice za použití 1 % Tritonu X-100

2,0 hodiny ? ET50 ? 7,0 hodin

Kritéria přijatelnosti

1.

Střední hodnota OD tkáňových replikátů vystavených působení negativní kontroly (NaCl) by měla být ? 0,6 a ? 1,5 pro každou dobu expozice

2.

Střední životaschopnost tkáňových replikátů vystavených působení pozitivní kontroly (ledová kyselina octová) po dobu 4 hodin, vyjádřeno jako % negativní kontroly, by měla být ? 20 %

3.

V rozsahu 20–100 % životaschopnosti a pro hodnoty OD ? 0,3 by rozdíl životaschopnosti mezi dvěma tkáňovými replikáty neměl přesahovat 30 %.

1.

Střední hodnota OD tkáňových replikátů vystavených působení negativní kontroly (H2O) by měla být ? 0,8 a ? 2,8 pro každou dobu expozice

2.

Střední životaschopnost tkáňových replikátů vystavených působení pozitivní kontroly (8N KOH) po dobu 1 hodiny, vyjádřeno jako % negativní kontroly, by měla být < 15 %

3.

V rozsahu 20–100 % životaschopnosti by variační koeficient (CV) mezi tkáňovými replikáty měl být ? 30 %

1.

Střední hodnota OD tkáňových replikátů vystavených působení negativní kontroly (H2O) by měla být ? 0,8 a ? 3,0 pro každou dobu expozice

2.

Střední životaschopnost tkáňových replikátů vystavených působení pozitivní kontroly (8N KOH) po dobu 1 hodiny (a případně 4 hodin), vyjádřeno jako % negativní kontroly, by měla být < 15 %

3.

V rozsahu 20–100 % životaschopnosti a pro hodnoty OD ? 0,3 by rozdíl životaschopnosti mezi dvěma tkáňovými replikáty neměl přesahovat 30 %

1.

Střední hodnota OD tkáňových replikátů vystavených působení negativní kontroly (H2O) by měla být ? 0,8 a ? 2,8 pro každou dobu expozice

2.

Střední životaschopnost tkáňových replikátů vystavených působení pozitivní kontroly (8N KOH) po dobu 1 hodiny, vyjádřeno jako % negativní kontroly, by měla být < 20 %

3.

V rozsahu 20–100 % životaschopnosti a pro hodnoty OD ? 0,3 by rozdíl životaschopnosti mezi dvěma tkáňovými replikáty neměl přesahovat 30 %

Dodatek 3

FUNKČNÍ ZPŮSOBILOST ZKUŠEBNÍCH MODELŮ PRO KLASIFIKACI DO PODKATEGORIÍ

V následující tabulce je uvedena funkční způsobilost čtyř zkušebních modelů vypočtená ze skupiny 80 chemických látek zkoušených čtyřmi dodavateli, kteří zkoušky vyvinuli. Výpočty provedl sekretariát OECD a zkontrolovala a schválila je podskupina odborníků (21) (23).

Zkušební modely EpiSkin™, EpiDerm™ , SkinEthic™ a epiCS® lze rozdělovat na podkategorie (tj. 1A proti 1B-a-1C proti NC)

Funkční způsobilost, podíly nadhodnocené klasifikace do podkategorií, podíly podhodnocené klasifikace do podkategorií a přesnost (prediktivní schopnost) čtyř zkušebních modelů podle skupiny 80 chemických látek, z nichž všechny byly zkoušeny každým zkušebním modelem ve 2 nebo 3 zkouškách:

STATISTIKA PREDIKCÍ ZÍSKANÝCH Z CELÉ SKUPINY CHEMICKÝCH LÁTEK

(n = 80 chemických látek zkoušených ve 2 nezávislých zkouškách u modelu epiCS® nebo ve 3 nezávislých zkouškách u modelů EpiDerm™ SCT, EpiSkin™ a SkinEthic™ RHE, tj. 159 (*2), respektive 240 klasifikací)