(ES) č. 900/2008Nařízení Komise (ES) č. 900/2008 ze dne 16. září 2008 , kterým se stanoví metody analýzy a jiná technická ustanovení nezbytná k provádění dovozního režimu pro určité zboží vzniklé zpracováním zemědělských produktů (kodifikované znění)

PŘÍLOHA I

Stanovení obsahu škrobu a jeho rozkladných produktů včetně glukózy

1.   ÚČEL A OBLAST POUŽITÍ

a)	Metoda umožňuje stanovení obsahu škrobu, jeho rozkladných produktů včetně glukózy, dále jen „škrob“.

b)	Obsah „škrobu“ uvedený v písmenu a) se rovná hodnotě E vypočítané v bodě 6 písm. a) této přílohy.

2.   PRINCIP

Vzorek se rozloží hydroxidem sodným a „škrob“ se rozštěpí na glukózové jednotky amyloglukosidázou. Stanovení glukózy se provádí enzymaticky.

3.   REAKČNÍ ČINIDLA

(Použijte redestilovanou vodu.)

3.1   0,5 N roztok hydroxidu sodného (0,5 mol/l).

3.2   Minimálně 96 % ledová kyselina octová.

3.3   Roztok amyloglukosidázy:

Bezprostředně před použitím rozpusťte přibližně 10 mg amyloglukosidázy (EC 3.2.1.3) (60 U/mg) v jednom mililitru vody (1).

3.4   Triethanolaminový tlumivý roztok:

Rozpusťte 14,0 g triethanolamin hydrochloridu [tris(2-hydroxyethyl)amonium chloridu] a 0,25 g síranu hořečnatého (MgSO47H2O) v 80 ml vody, přidejte přibližně 5 ml 5 N roztoku hydroxidu sodného (5 mol/l) a upravte pH na 7,6 pomocí 1 N roztoku hydroxidu sodného (1 mol/l).

Doplňte vodou na 100 ml. Tento tlumivý roztok může být uchováván při 4 °C nejméně čtyři týdny.

3.5   Roztok NADP (disodná sůl nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfátu):

Rozpusťte 60 mg NADP v 6 ml vody. Tento roztok může být uchováván při 4 °C nejméně čtyři týdny.

3.6   Roztok ATP (disodná sůl adenosin-5-trifosfátu):

Rozpusťte 300 mg ATP. 3H2O a 3 000 mg hydrouhličitanu sodného (NaHCO3) v 6 ml vody. Tento roztok může být uchováván při 4 °C nejméně čtyři týdny.

3.7   Suspenze HK/G6P-DH [hexokinázy (EC 2.7.1.1) a glukoso-6-fosfát-dehydrogenázy (EC 1.1.1.49)]:

Připravte suspenzi 280 U HK a 140 U G6P-DH v 1 ml 3,2 M roztoku síranu amonného. Tato suspenze může být uchovávána při 4 °C nejméně jeden rok.

4.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1   Magnetické míchadlo s vodní lázní o teplotě 60 °C.

4.2   Magnetická míchadla.

4.3   UV spektrofotometr s optickými kyvetami o tloušťce 1 cm.

4.4   Pipety pro enzymatickou analýzu.

5.   METODA

5.1   Vzorek se vytěsní v hydroxidu sodném a „škrob“ se podrobí enzymatické hydrolýze

5.1.1

Hmotnost vzorku zvolte podle předpokládaného obsahu „škrobu“ (obsah „škrobu“ nesmí překročit 0,4 g na vzorek) takto: Předpokládaný obsah „škrobu“ v g/100 g produktu Přibližná hmotnost vzorku v g (p) Objem odměrné baňky v ml Koeficient zředění do 1 litru (f) > 70 0,35–0,4 500 2 20–70 max. 0,5 500 2 5–20 max. 1 250 4 < 5 max. 2 200 5

5.1.2

Navažte vzorek s přesností 0,1 mg.

5.1.3

Přidejte 50 ml 0,5 N roztoku hydroxidu sodného (bod 3.1) a nepřetržitě míchejte 30 minut magnetickým míchadlem ve vodní lázni (bod 4.1) při 60 °C.

5.1.4

Přidejte několik mililitrů koncentrované kyseliny octové (bod 3.2) a upravte pH na hodnotu 4,6 až 4,8.

5.1.5

Vložte do vodní lázně s magnetickým míchadlem (bod 4.1) při 60 °C, přidejte 1,0 ml roztoku enzymu (bod 3.3) a nechte směs za stálého míchání reagovat po dobu 30 minut.

5.1.6

Po ochlazení přeneste kvantitativně do odměrné baňky (bod 5.1.1) a doplňte vodou po rysku.

5.1.7

V případě potřeby přefiltrujte přes skládaný filtr (viz poznámka č. 1).

5.2   Kvantitativní stanovení glukózy

5.2.1

Zkušební roztok musí obsahovat 100 až 1 000 mg glukózy na litr, což odpovídá hodnotě ΔΕ340 mezi 0,1 a 1,0. Absorbance zkušebního roztoku ve zředění 1 + 30 vodou nesmí překročit 0,4 (měřeno proti vzduchu) při 340 nm.

5.2.2

Vyrovnejte tlumivý roztok (bod 3.4) na pokojovou teplotu (20 °C).

5.2.3

Teplota reakčních činidel i vzorku musí být mezi 20 a 25 °C.

5.2.4

Změřte absorbanci při 340 nm proti vzduchu (tj. bez kyvety v referenční dráze).

5.2.5

Postupujte podle následující pipetovací tabulky: Do kyvet nalijte Slepý pokus (ml) Zkouška (ml) Tlumivý roztok (činidlo 3.4) 1,00 1,00 NADP (činidlo 3.5) 0,10 0,10 ATP (činidlo 3.6) 0,10 0,10 Zkušební roztok (5.1.6 nebo 5.1.7) — 0,10 Redestilovaná voda 2,00 1,90 Promíchejte a asi po třech minutách změřte absorbanci roztoků (E1). Zahajte reakci přidáním: HK/G6P-DH (činidlo 3.7) 0,02 0,02 Promíchejte a nechte reakci doběhnout do konce (přibližně 15 minut) a změřte absorbanci roztoků (E2). Jestliže se reakce po 15 minutách nezastaví, odečítejte absorbance v pětiminutových intervalech, dokud se tempo růstu neustálí. Poté extrapolujte nazpět do doby přidání suspenze podle bodu 3.7 (viz poznámka č. 2).

5.2.6

Vypočtěte rozdíly absorbancí pro slepý pokus a vzorek (E2 – E1). Odečtěte rozdíl absorbancí slepého pokusu (ΔΕ slepý) od rozdílu absorbancí vzorku (ΔΕ vzorek): ΔΕ = ΔΕ vzorek – ΔΕ slepý Tento rozdíl udává obsah glukózy ve zkušebním roztoku: Obsah glukózy ve zkušebním roztoku, g/l Gl = ((3,22 × 180,16)/(6,3 × 1 × 0,1 × 1 000)) × ΔΕ340 = 0,921 × ΔΕ340 (3,22 = objem měřeného roztoku; 1 = tloušťka kyvety; 0,1 = objem roztoku vzorku; molární hmotnost glukózy je 180,16 g/mol)

5.2.7

Jestliže není z jakýchkoli důvodů možné provést měření při 340 nm, lze měření provést při vlnové délce 365 nm nebo 334 nm a číslo 6,3 ve výše uvedeném vzorci pro Gl je třeba nahradit číslem 3,5 nebo 6,18.

6.   VÝPOČET A VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

a)	E = obsah „škrobu“ v g/100 g: E = ((100 × 0,9 × Gl)/(p × f))

b)	Z = obsah „glukózy“ v g/100 g: Z = ((100 × Gl)/(p × f))

kde:

Gl	=	glukóza v g/l (5.2.6);
f	=	koeficient zředění (5.1.1);
p	=	hmotnost vzorku v g;
0,9	=	koeficient pro přepočet glukózy na škrob.

Poznámky:

1.	Není-li možné zkušební roztok přefiltrovat podle bodu 5.1.7, je třeba použít jinou vhodnou metodu pro získání čirého roztoku.

2.	Dojde-li k inhibici enzymů, doporučuje se použít metodu, která zahrnuje přidání známých množství čistého škrobu.

---

(1)  U je mezinárodní jednotka aktivity enzymu.

PŘÍLOHA II

Stanovení obsahu škrobů nebo dextrinů či jiných modifikovaných škrobů ve zboží kódů KN 3505 20 10 až 3505 20 90 a obsahu škrobových látek ve zboží kódů KN 3809 10 10 až 3809 10 90

I.   PRINCIP

Škrob se kyselou hydrolýzou přemění na redukující cukry, které se objemově určují Fehlingovým roztokem.

II.   PŘÍSTROJE A ČINIDLA

1.	Baňka o objemu 250 ml;

2.	odměrná baňka o objemu 200 ml;

3.	odměrná byreta o objemu 25 ml;

4.	kyselina chlorovodíková o hustotě 1,19;

5.	roztok hydroxidu draselného;

6.	aktivní odbarvovací uhlí;

7.	Fehlingův roztok;

8.	roztok methylenové modři (1 %).

III.   METODA

Do baňky o objemu 250 ml vložte vzorek obsahující přibližně 1 g škrobu. Přidejte 100 ml destilované vody a 2 ml kyseliny chlorovodíkové. Uveďte obsah do varu a zahřívejte jej pod zpětným chladičem tři hodiny.

Přeneste obsah baňky a zbytky kapaliny do odměrné baňky o objemu 200 ml. Ochlaďte a téměř úplně zneutralizujte roztokem hydroxidu draselného. Doplňte destilovanou vodou do 200 ml a přefiltrujte přes malé množství aktivního odbarvovacího uhlí.

Potom roztok nalijte do odměrné byrety a zredukujte 10 ml Fehlingova roztoku takto:

Do baňky s rovným dnem o objemu asi 250 ml nalijte 10 ml Fehlingova roztoku (5 ml roztoku A a 5 ml roztoku B). Protřepejte do vyčeření a přidejte 40 ml destilované vody a malé množství křemene nebo pemzy.

Postavte baňku na čtvercovou azbestovou desku s kruhovým otvorem uprostřed o přibližném průměru 6 cm položenou na drátěné síťce. Baňku zahřívejte tak, aby kapalina přibližně po dvou minutách přešla do varu.

Do vroucí kapaliny přidávejte z byrety postupně roztok cukru, až se modré zabarvení Fehlingova roztoku stane téměř nepostřehnutelným. Potom přidejte 2 nebo 3 kapky roztoku methylenové modři jako indikátor a dokončete titraci přidáváním roztoku cukru po kapkách, dokud nezmizí modré zbarvení indikátoru.

Pro větší přesnost titraci zopakujte za stejných podmínek, ale přidejte téměř všechen roztok cukru potřebný k redukci Fehlingova roztoku bez přerušení. Při této druhé titraci má k redukci Fehlingova roztoku dojít do tří minut. Udržujte směs ve varu přesně po dobu dalších dvou minut a současně během první minuty přidávejte po kapkách činidlo, dokud nezmizí modré zabarvení.

Hmotnostní procento obsahu škrobu ve vzorku se stanoví podle tohoto vzorce:

% škrobu = ((T × 200 × 100)/(n × p)) × 0,95

kde:

T	:	je množství bezvodé dextrózy v gramech odpovídající 10 ml Fehlingova roztoku (5 ml roztoku A a 5 ml roztoku B). Toto množství odpovídá 0,04945 g bezvodé dextrózy, jestliže roztok A obsahuje 17,636 g mědi na litr;
n	:	počet mililitrů roztoku cukru použitého k titraci;
p	:	hmotnost množství vzorku;
0,95	:	přepočítací koeficient dextrózy na škrob.

IV.   PŘÍPRAVA FEHLINGOVA ROZTOKU

Roztok A	:	V odměrné baňce rozpusťte v destilované vodě 69,278 g čistého krystalického síranu měďnatého (CuSO4 5H2O), neobsahujícího železo a doplňte obsah do 1 litru destilovanou vodou. Přesná koncentrace roztoku musí být ověřena kvantitativním stanovením mědi.
Roztok B	:	V odměrné baňce rozpusťte 100 g hydroxidu sodného a 346 g vinanu sodnodraselného tetrahydrátu (Rochellova nebo Seignettova sůl) v destilované vodě a doplňte na objem 1 litru destilovanou vodou.

Oba roztoky A a B se smíchají ve stejných množstvích bezprostředně před použitím. Za podmínek uvedených v části III se 10 ml Fehlingova roztoku (5 ml roztoku A a 5 ml roztoku B) úplně zredukuje množstvím 0,04945 g bezvodé dextrózy.

PŘÍLOHA III

Zjišťování pšeničné mouky nebo krupice v těstovinách

(Young-Gillesova metoda upravená Bernaertsem a Grunerem)

I.   PRINCIP

Extrakt vzorku těstovin určeného k analýze se získá extrakcí nepolárním rozpouštědlem.

Tento extrakt se podrobí chromatografii na tenké vrstvě silikagelu, aby se oddělily přítomné steroly, jejichž frakce vytvoří různé pásy.

Podle počtu jasně vybarvených pásů je možné určit, zda je zkoušený produkt vyroben výlučně z pšenice tvrdé, pšenice obecné nebo z jejich směsi. Je také možné stanovit, zda byla přidána vejce.

II.   VYBAVENÍ A ČINIDLA

1.	Homogenizér nebo mlýnek pro získání drti, která projde normalizovaným sítem o velikosti ok 0,200 mm;

2.	normalizované síto o velikosti 0,200 mm;

3.	odparka s vodní lázní pro odpařování za sníženého tlaku;

4.

skleněná deska, hliníkový plech nebo jiná vhodná podložka o rozměrech 20 × 20 cm, povlečená tenkou vrstvou silikagelu. Musí-li být silikagelová vrstva připravena, je zapotřebí použít směs silikagelu s (přibližně) 13 % sádry a nanést směs vhodným zařízením ve vrstvě o síle 0,25 mm podle návodu výrobce;

5.	mikropipeta pro odměření 20 mikrolitrů;

6.	nádoba s víkem vhodná pro vyvíjení chromatogramů;

7.

atomizér;

8.	petrolether s bodem varu mezi 40 a 60 °C, před použitím předestilovaný;

9.	bezvodý ethylether pro analýzu;

10.	tetrachlormethan pro chromatografii, před použitím předestilovaný;

11.	kyselina fosfomolybdenová pro analýzu;

12.	94 % ethylalkohol.

III.   METODA

Rozemelte asi 20 g vzorku pro analýzu, aby všechen prošel sítem. Vložte vzorek do Erlenmeyerovy baňky a překryjte jej 150 ml petroletheru. Ponechte stát při pokojové teplotě do příštího dne. Občas protřepejte.

Potom směs přefiltrujte na Büchnerově nálevce opatřené filtrační hmotou nebo na skleněném filtru. Takto získaný čirý roztok postupně přeneste do 100 ml odměrné baňky. Odpařte rozpouštědlo ohřevem baňky ve vodní lázni o teplotě 40 °C až 50 °C za sníženého tlaku. Po odpaření rozpouštědla pokračujte v zahřívání ještě deset minut.

Po vychladnutí baňky stanovte hmotnost extraktu. Zřeďte extrakt ethyletherem v poměru 1 ml ethyletheru na 60 mg extraktu.

Aktivujte tenké vrstvy tříhodinovým ohřevem na 130 °C. Nechte je vychladnout v exsikátoru nad silikagelem. Desky, které nebudete ihned používat, můžete skladovat ve stejném exsikátoru.

Kapku po kapce naneste 20 mikrolitrů čirého roztoku tak, aby se na vrstvě, nejlépe nově aktivované, utvořil pás v rovnoměrné šířce a délce 3 cm. Nechte rozpouštědlo odpařit.

Vyvíjejte chromatogram za normální teploty tetrachlormethanem v chromatografické nádobě, jejíž stěny jsou pokryté filtračním papírem namočeným ve stejném rozpouštědle. Rozpouštědlo přibližně po jedné hodině vystoupá do výše 18 cm. Vyjměte desku a nechte rozpouštědlo volně odpařit. Pro lepší oddělení pásů proveďte vyvíjení chromatogramu ještě jednou. Rozpouštědlo nechte znovu volně odpařit.

Pokropte tenkou vrstvu silikagelu 20 % roztokem kyseliny fosfomolybdenové v ethylalkoholu. Vrstva musí být zbarvená rovnoměrnou žlutí. Pásy vyvolejte pětiminutovým ohřevem pokropené desky při teplotě 110 °C.

IV.   INTERPRETACE CHROMATOGRAMU

Jestliže chromatogram jeví jediný hlavní, jasně zbarvený pás s hodnotou Rf přibližně 0,4–0,5, byla pro výrobu dotyčné těstoviny použita pšenice tvrdá. Jestliže se však objeví dva hlavní pásy o stejném jasu, byla surovinou pšenice obecná. Směsi pšenice tvrdé a pšenice obecné lze posoudit vyhodnocením relativního jasu obou pásů.

Jestliže se na chromatogramu vyskytují tři pásy (dva pásy ve výšce, kde se mají nacházet hlavní pásy pšenice obecné, a další pás mezi nimi), byla do těstoviny přidána vejce. Je-li v tomto případě střední pás jasnější než horní pás, byla použitou surovinou pšenice tvrdá. Je-li však horní pás jasnější než pás střední, byla jako surovina použita pšenice obecná.

PŘÍLOHA IV

Zrušené nařízení a jeho následná změna

Nařízení Komise (EHS) č. 4154/87	(Úř. věst. L 392, 31.12.1987, s. 19)
Nařízení Komise (ES) č. 203/98	(Úř. věst. L 21, 28.1.1998, s. 6)

PŘÍLOHA V

Srovnávací tabulka

Nařízení (EHS) č. 4154/87	Toto nařízení
Články 1 až 4	Články 1 až 4
Článek 5	—
—	Článek 5
Článek 6	Článek 6
Přílohy I, II a III	Přílohy I, II a III
—	Příloha IV
—	Příloha V