(ES) č. 273/2008Nařízení Komise (ES) č. 273/2008 ze dne 5. března 2008 , kterým se stanoví prováděcí pravidla k nařízení Rady (ES) č. 1255/1999, pokud jde o metody analýzy a hodnocení jakosti mléka a mléčných výrobků

PŘÍLOHA I

(Článek 1)

SEZNAM REFERENČNÍCH METOD

Seznam zkratek min. = minimum, max. = maximum, příloha = příloha citovaného nařízení, TPS = tukoprostá sušina, PČ = peroxidové číslo, V = vzhled, CH = chuť, K = konzistence, CPB = celkový počet bakterií, term. = počet termofilních bakterií, ČS = členský stát, IDF = Mezinárodní mlékárenská federace, ISO = Mezinárodní organizace pro normalizaci, IUPAC = Mezinárodní unie čisté a aplikované chemie, ADPI = Americký ústav mléčných výrobků, SKM = slazené kondenzované mléko, ZMS = zahuštěné mléko nebo smetana.

ČÁST A

Nařízení Komise	Produkt	Parametr	Mezní hodnota (1)	Referenční metoda	Poznámka
Nařízení (ES) č. 2771/1999 – Veřejné skladování	Nesolené máslo	Tuk	Min. 82 % hm.	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Až 16 % hm.	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		TPS	Až 2 % hm.	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Kyselost tuku	1,2 mmol/100 g tuku	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PČ (max.)	0,3 mekv. O2/1 000 g tuku	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Poznámka 1
		Koliformní bakterie	Nezjistitelné v 1 g	Příloha X	Poznámka 3
		Nemléčný tuk	Nezjistitelný analýzou triglyceridů	Příloha XX
		Stopovací látky: steroly	Nezjistitelné, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg	Příloha VIII
		Jiné stopovací látky
		— vanilin	Nezjistitelný	Příloha VI
		— ethylester kyseliny karotenové	≤ 6 mg/kg	Příloha VII
		— triglyceridy kyseliny enanthové	Nezjistitelné	Příloha V
		Organoleptické vlastnosti	Nejméně 4 body z 5 pro A, F a C	Příloha IV
		Vodní disperze	Nejméně 4 body	ISO 7586:1985 – IDF 112A:1989
Nařízení (ES) č. 2771/1999 – Soukromé skladování	Nesolené máslo	Tuk	Min. 82 % hm.	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Až 16 % hm.	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		TPS	Až 2 % hm.	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
Nařízení (ES) č. 2771/1999 – Soukromé skladování	Solené máslo	Tuk	Min. 80 % hm.	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Až 16 % hm.	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		TPS (s výjimkou soli)	Až 2 % hm.	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Sůl	Až 2 % hm.	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005	Nesolené máslo	Tuk	Min. 82 % hm.	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Nemléčný tuk		Příloha XX
		Voda	Až 16 % hm.	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		TPS	Až 2 % hm.	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Stopovací látky:
		— steroly	Viz příloha VIII	Příloha VIII
		— vanilin	Viz příloha VI	Příloha VI
		— ethylester kyseliny karotenové	Viz příloha VII	Příloha VII
		— triglyceridy kyseliny enanthové	Viz příloha V	Příloha V
Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005	Solené máslo	Tuk	Min. 80 % hm.	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Nemléčný tuk		Příloha XX
		Voda	Až 16 % hm.	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		TPS (s výjimkou soli)	Až 2 % hm.	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Sůl	Až 2 % hm.	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Stopovací látky:
		— steroly	Viz příloha VIII	Příloha VIII
		— vanilin	Viz příloha VI	Příloha VI
		— ethylester kyseliny karotenové	Viz příloha VII	Příloha VII
		— triglyceridy kyseliny enanthové	Viz příloha V	Příloha V
Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005	Zahuštěné máslo	Tuk	Min. 99,8 % hm.	IDF 24:1964
		Voda a TPS	Až 0,2 % hm.	ISO 5536:2002|IDF 23:2002 (vlhkost) IDF 24:1964 (TPS)
		Kyselost tuku	1,2 mmol/100 g tuku	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PČ (max.)	0,5 mekv. O2/1 000 g tuku	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Poznámka 1
		Nemléčný tuk	Nepřítomnost	Příloha XX
		Chuť	Čistá
		Vůně	Nepřítomnost cizích vůní
		Jiné	Nepřítomnost neutralizačních činidel, antioxidantů a konzervačních činidel
		Stopovací látky:
		— steroly	Viz příloha VIII	Příloha VIII
		— vanilin	Viz příloha VI	Příloha VI
		— ethylester kyseliny karotenové	Viz příloha VII	Příloha VII
		— triglyceridy kyseliny enanthové	Viz příloha V	Příloha V
Kapitola II nařízení (ES) č. 1898/2005	Smetana	Tuk	Minimálně 35 % hm.	ISO 2450:1999 – IDF 16 C:1987
		Nemléčný tuk		Příloha XX
		Stopovací látky:
		— steroly	Viz příloha VIII		Poznámka 2
		— vanilin	Viz příloha VI	Příloha VI
		— ethylester kyseliny karotenové	Viz příloha VII		Poznámka 2
		— triglyceridy kyseliny enanthové	Viz příloha V	Příloha V
Kapitola III nařízení (ES) č. 1898/2005	Zahuštěné máslo	Tuk	Min. 96 % hm.		Poznámka 2
		Nemléčný tuk		Příloha XX
		TPS	Až 2 % hm.		Poznámka 2
		Stopovací látky:
		— stigmasterol (95 % hm.)	15 g/100 g zahuštěného másla	Příloha VIII
		— stigmasterol (85 % hm.)	17 g/100 g zahuštěného másla	Příloha VIII
		— triglyceridy kyseliny enanthové	10,34 kg/t zahuštěného másla	Příloha V
		— ethylester kyseliny máselné a stigmasterol		— ethylester kyseliny máselné — stigmasterol: Příloha VIII	Poznámka 2
		— ethylester kyseliny máselné a triglyceridy kyseliny enanthové		— ethylester kyseliny máselné — triglyceridy kyseliny enanthové: Příloha V	Poznámka 2
		lecitin (E 322)	Až 0,5 % hm.		Poznámka 2
		NaC1	Až 0,75 % hm.	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
		Kyselost tuku	1,2 mmol/100 g tuku	ISO 1740:2004|IDF 6:2004
		PČ (max.)	Až 0,5 mekv. O2/1 000 g tuku	ISO 3976:2006|IDF 74:2006	Poznámka 1
		Chuť	Čistá
		Vůně	Nepřítomnost cizích vůní
		Jiné	Nepřítomnost neutralizačních činidel, antioxidantů a konzervačních činidel
Kapitola IV nařízení (ES) č. 1898/2005	Nesolené máslo	Tuk	Min. 82 % hm.	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Až 16 % hm.	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		TPS	Až 2 % hm.	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
Kapitola IV nařízení (ES) č. 1898/2005	Solené máslo	Tuk	Min. 80 % hm.	ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Voda	Až 16 % hm.	ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
		TPS (s výjimkou soli)	Až 2 % hm.	ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
		Sůl	Až 2 % hm.	ISO 15648:2004|IDF 179:2004
Článek 9 a hlava II nařízení (ES) č. 1255/1999	Sýry vyráběné z ovčího a/nebo kozího mléka	Kravské mléko	< 1 % hm.	Příloha IX
Nařízení (EHS) č. 2921/90	Příloha I – Kyselý kasein	Voda	Až 12,00 % hm.	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Tuk	Až 1,75 % hm.	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Volné kyseliny	Až 0,30 ml 0,1 N roztoku NaOH/g	ISO 5547:1978 – IDF 91:1979
Nařízení (EHS) č. 2921/90	Příloha I – Sladký kasein	Voda	Až 12,00 % hm.	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Tuk	Až 1,00 % hm.	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Popeloviny	Min. 7,50 % hm.	ISO 5545:1978 – IDF 90:1979
Nařízení (EHS) č. 2921/90	Příloha I – Kaseináty	Voda	Až 6,00 % hm.	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mléčná bílkovina	Min. 88,00 % hm.	ISO 5549:1978 – IDF 92:1979
		Tuk a popeloviny	Až 6,00 % hm.	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Vázané popeloviny		ISO 5544:1978 – IDF 89:1979
		Popeloviny		ISO 5545:1978 – IDF 90:1979
Nařízení (EHS) č. 2921/90	Příloha II – Kyselý kasein	Voda	Až 10,00 % hm.	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Tuk	Až 1,50 % hm.	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Volné kyseliny	Až 0,20 ml 0,1 N roztoku NaOH/g	ISO 5547:1978 – IDF 91:1979
		CPB (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Poznámka 3
		Koliformní bakterie	Nepřítomnost v 0,1 g	Příloha X	Poznámka 3
		Term. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Poznámky 3 a 4
Nařízení (EHS) č. 2921/90	Příloha II – Sladký kasein	Voda	Až 8,00 % hm.	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Tuk	Až 1,00 % hm.	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Popeloviny	Min. 7,50 % hm.	ISO 5545:1978 – IDF 90:1979
		CPB (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Poznámka 3
		Koliformní bakterie	Nepřítomnost v 0,1 g	Příloha X	Poznámka 3
		Term. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Poznámky 3 a 4
Nařízení (EHS) č. 2921/90	Příloha II – Kaseináty	Voda	Až 6,00 % hm.	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mléčná bílkovina	Min. 88,00 % hm.	ISO 5549:1978 – IDF 92:1979
		Tuk a popeloviny	Až 6,00 % hm.	ISO 5543:2004|IDF 127:2004 ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 nebo ISO 5545:1978 – IDF 90:1979
		CPB (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Poznámka 3
		Koliformní bakterie	Nepřítomnost v 0,1 g	Příloha X	Poznámka 3
		Term. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Poznámky 3 a 4
Nařízení (EHS) č. 2921/90	Příloha III – Kaseináty	Voda	Až 6,00 % hm.	ISO 5550:2006|IDF 78:2006
		Mléčná bílkovina	Min. 85,00 % hm.	ISO 5549:1978 – IDF 92:1979
		Tuk	Až 1,50 % hm.	ISO 5543:2004|IDF 127:2004
		Laktóza	Až 1,00 % hm.	ISO 5548:2004|IDF 106:2004
		Popeloviny	Až 6,50 % hm.	ISO 5544:1978 – IDF 89:1979 nebo ISO 5545:1978 – IDF 90:1979
		CPB (max.)	30 000/g	ISO 4833:2003	Poznámka 3
		Koliformní bakterie	Nepřítomnost v 0,1 g	Příloha X	Poznámka 3
		Term. (max.)	5 000/g	ISO 4833:2003	Poznámky 3 a 4
Nařízení (ES) č. 2799/1999	Krmné směsi a sušené odstředěné mléko (SOM) (pro použití v krmivech)	Voda (sušené kysané podmáslí)	Až 5 % hm.	Příloha XIX
		Bílkoviny	31,4 % hm. (min.) v tukoprosté sušině	ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
		Voda (SOM)	Až 5 % hm.	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Tuky (SOM)	Až 11 % hm.	ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987
		Syřidlová syrovátka (SOM)	Nepřítomnost	Příloha XIII	Poznámka 6
		Škrob (SOM)	Nepřítomnost	Příloha XVII
		Voda (směsi)	Až 5 % v tukoprosté sušině	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Tuk (směsi)		Směrnice Komise 84/4/EHS (Úř. věst. L 15, 18.1.1984, s. 29)
		Syřidlová syrovátka (směsi)	Nepřítomnost	Příloha XIII
		Obsah SOM (v konečném výrobku)	Min. 50 % hm.	Příloha XVI
		Tuk (v konečném výrobku)	Min. 2,5 % hm. nebo 5 % hm.	Směrnice Komise 84/4/EHS (Úř. věst. L 15, 18.1.1984, s. 29)	Poznámka 7
		Škrob (v konečném výrobku)	Min. 2 % hm.	Příloha XVII	Poznámka 8
		Měď (v konečném výrobku)	25 ppm	Směrnice Komise 78/633/EHS (Úř. věst. L 206, 26.7.1987, s. 43)
Nařízení (ES) č. 214/2001	SOM (sušené rozprašováním)	Tuk	Až 1,0 % hm.	ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987
		Bílkoviny	31,4 % (2)hm. (min.) v tukoprosté sušině	ISO 8968–1/2:2001|IDF 20–1/2:2001
		Voda	Až 3,5 % hm.	ISO 5537:2004|IDF 26:2004
		Kyselost	Až 19,5 ml, 0,1 N NaOH, 10 g tukoprosté sušiny	ISO 6091:1980 – IDF 86:1981
		Mléčnany	Až 150 mg/100 g tukoprosté sušiny	ISO 8069:2005|IDF 69:2005
		Fosfatáza	Negativní	ISO 11816–1:2006|IDF 155–1:2006
		Index nerozpustnosti	Až 0,5 ml při 24 °C	ISO 8156:2005|IDF 129:2005
		Připálené částice	Filtr A nebo B (15,0 mg)	ADPI (1990)
		CPB	40 000/g	ISO 4833:2003	Poznámka 3
		Koliformní bakterie	Negativní/0,1 g	Příloha X	Poznámka 3
		Podmáslí	Negativní	Příloha XIV
		Syřidlová syrovátka	Negativní	Příloha XII
		Kyselá syrovátka	Negativní		Poznámka 2
		Antimikrobiální látky		Příloha XV

ČÁST B

Referenční metody uvedené v části B mohou být používány pro analýzu produktů, na které se vztahuje jakékoliv z nařízení uvedených ve sloupci 1.

Nařízení Komise	Produkt	Kód KN	Parametr	Mezní hodnota	Referenční metoda	Poznámka
Nařízení (EHS) č. 2658/87 Nařízení (ES) č. 2535/2001 Nařízení (ES) č. 1282/2006	Mléko a smetana, nezahuštěné, neobsahující přidaný cukr ani jiná sladidla	0401	Tuk (≤ 6 % hm.)	Mezní hodnoty jsou hodnoty stanovené v popisu kódu KN pro konkrétní produkt a případně blíže určené v nařízení Komise (EHS) č. 3846/87 (Úř. věst. L 366, 24.12.1987, s. 1), části 9 vývozní nomenklatury, nebo nařízení (ES) č. 2535/2001 (Úř. věst. L 341, 22.12.2001, s. 29).	ISO 1211:2001 – IDF 1D:1996
			Tuk (> 6 % hm.)		ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987
	Mléko a smetana, zahuštěné nebo obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla	0402	Tuk (v tekuté formě)		ISO 1737:1999 – IDF 13C:1987
			Tuk (v tuhé formě)		ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987
			Bílkoviny		ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
			Sacharóza (normální obsah)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sacharóza (nízký obsah)			Poznámka 2
			Sušina (SKM)		ISO 6734:1989 – IDF 15B:1991
			Sušina (ZMS)		ISO 6731:1989 – IDF 21B:1987
			Voda (sušené mléko)		ISO 5537:2004/IDF 26:2004
			Voda (sušená smetana)		Příloha XVIII
	Podmáslí, fermentované (kysané) nebo acidofilní mléko a smetana, zahuštěné nebo nezahuštěné, obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla	0403	Tuk		ISO 1211:2001 – IDF 1D:1996 ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987 ISO 7208:1999 – IDF 22B:1987 ISO 8262–3:2005 – IDF 124–3:2005
			Bílkoviny		ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
			Sacharóza (normální obsah)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sacharóza (nízký obsah)			Poznámka 2
			Voda (sušené kysané podmáslí)		Příloha XIX
			Voda (sušené sladké podmáslí)		ISO 5537:2004|IDF 26:2004
			Sušina (ostatní produkty)		Metody schválené příslušným orgánem
	Syrovátka, též zahuštěná nebo obsahující přidaný cukr nebo jiná sladidla; výrobky sestávající z přírodních složek mléka	0404	Tuk		ISO 1736:2000 – IDF 9C:1987 ISO 2450:1999 – IDF 16C:1987 ISO 7208:1999 – IDF 22B:1987
			Bílkoviny		ISO 8968–1|2|3:2001|IDF 20–1|2|3:2001
			Sacharóza (normální obsah)		ISO 2911:2004|IDF 35:2004
			Sacharóza (nízký obsah)			Poznámka 2
		0404 90	Bílkoviny		ISO 8968 1/2 2001|IDF 20–1/2:2001
			Voda		IDF 21B:1987
			Sušina		ISO 6734:1989 – IDF 15B:1991
			(Zahuštěné výrobky)		ISO 6731:1989 – IDF 21B:1987
	Máslo a jiné tuky získané z mléka; mléčné pomazánky	0405	Tuk (je-li ≤ 85 % hm.)		ISO 17189:2003|IDF 194:2003
		Máslo	Voda		ISO 3727–1:2001|IDF 80–1:2001
			TPS		ISO 3727–2:2001|IDF 80–2:2001
			NaCl		ISO 15648:2004|IDF 179:2004
			Tuk (je-li > 99 % hm.)		IDF 24:1964
	Máselný olej		Voda (je-li tuk < 99 % hm.)		ISO 5536:2002|IDF 23:2002
	Sýry a tvaroh	0406	Tuk		ISO 1735:2004|IDF 5:2004
			Sušina		ISO 5534:2004|IDF 4:2004
			Sušina (Ricotta)		ISO 2920:2004|IDF 58:2004
			NaCl		ISO 5943:2006|IDF 88:2006
			Laktóza		ISO 5765–1/2:2002|IDF 79–1/2:2002
Nařízení (EHS) č. 2658/87	Krmné směsi	2309	Laktóza		Příloha XI

Poznámky k seznamu referenčních metod Evropské unie:

Poznámka 1: Izolace mléčného tuku podle popisu v normě ISO 1740:1991 (ochrana před světlem).

Poznámka 2: Nebyla stanovena žádná referenční metoda. Metody schválené příslušným orgánem.

Poznámka 3: Vzorek je nutno připravit podle normy ISO 8261:2001|IDF 122:2001.

Poznámka 4: Inkubace po dobu 48 hodin při teplotě 55 °C; je třeba zabránit vyschnutí živné půdy kultury.

Poznámka 5: % hm. TPS = % hm. sušiny – % hm. tuku.

Poznámka 6: Směrnice Komise 84/4/EHS.

Poznámka 7: Nařízení Komise (ES) č. 2799/1999 (Úř. věst. L 340, 31.12.1999, s. 3-27).

Poznámka 8: Směrnice Komise 78/633/EHS.

---

(1)  Aniž jsou dotčeny požadavky v příslušném nařízení.

(2)  Minimální obsah bílkovin bude od 1. září 2009 činit 34 %.

PŘÍLOHA II

(Článek 3)

ZHODNOCENÍ SPLNĚNÍ ZÁKONEM STANOVENÉ MEZNÍ HODNOTY S OHLEDEM NA ŠARŽI

1.   PODSTATA METODY

V případech, kdy příslušné právní předpisy stanoví podrobné postupy pro odběr vzorků, dodržují se tyto postupy. Ve všech ostatních případech se používá vzorek nejméně ze 3 jednotek vzorku odebraných náhodně ze šarže odevzdané ke kontrole. Lze připravit i složený vzorek. Získaný výsledek se porovná se zákonem stanovenými mezními hodnotami na základě výpočtu 95 % intervalu spolehlivosti jakožto dvojnásobku směrodatné odchylky, kde příslušná směrodatná odchylka závisí buď na tom, 1) zda byla metoda validována na základě mezinárodní spolupráce s hodnotami pro σr a σR, nebo v případě vnitrolaboratorní validace na tom, 2) zda byla vypočítána vnitřní reprodukovatelnost. Tento interval spolehlivosti se potom rovná nejistotě měření výsledku.

2.   METODA JE VALIDOVÁNA NA ZÁKLADĚ MEZINÁRODNÍ SPOLUPRÁCE

V tomto případě byla směrodatná odchylka opakovatelnosti σr a směrodatná odchylka reprodukovatelnosti σR stanovena a laboratoř může prokázat soulad s pracovními charakteristikami validované metody.

Vypočítá se aritmetický průměr z počtu n opakovaných měření.

Vypočítá se rozšířená nejistota (k = 2) z  takto:

Je-li konečný výsledek měření x vypočítán ze vzorce ve tvaru x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 nebo x = y 1 / y 2, musí se v takových případech postupovat podle běžných postupů pro kombinování směrodatných odchylek.

Šarže se považuje za nevyhovující horní zákonem stanovené mezní hodnotě UL, jestliže

;

jinak se má za to, že hodnotě UL vyhovuje.

Šarže se považuje za nevyhovující dolní zákonem stanovené mezní hodnotě LL, jestliže

;

jinak se má za to, že hodnotě LL vyhovuje.

3.   VNITROLABORATORNÍ VALIDACE S VÝPOČTEM SMĚRODATNÉ ODCHYLKY VNITŘNÍ REPRODUKOVATELNOSTI

V případech, kdy jsou použity metody, které nejsou stanoveny v tomto nařízení, a kdy nebyla stanovena opatření pro zajištění shodnosti, je třeba provést vnitrolaboratorní validaci. Namísto σr a σ R se musí ve vzorci pro výpočet rozšířené nejistoty U použít směrodatná odchylka vnitřní opakovatelnosti sir a směrodatná odchylka vnitřní reprodukovatelnosti siR.

Pravidla rozhodování jsou stejná jako v bodě 1. Považuje-li se však šarže za nesplňující zákonem stanovenou mezní hodnotu, musí se měření opakovat pomocí metody stanovené v tomto nařízení a rozhodnutí musí být dosaženo podle bodu 1.

PŘÍLOHA III

(Článek 4)

HODNOCENÍ POSUZOVATEL Ů A SPOLEHLIVOST VÝSLEDKŮ ORGANOLEPTICKÝCH ANALÝZ

V případě použití bodovacích metod (norma IDF 99C: 1997) se použijí tyto postupy:

A.   STANOVENÍ „UKAZATELE OPAKOVATELNOSTI“

Jeden posuzovatel musí během 12 měsíců analyzovat nejméně deset vzorků jako slepé duplikáty. Jednotlivé analýzy obvykle provádí v odlišných termínech. Výsledky týkající se charakteristických znaků jednotlivých produktů se vyhodnotí pomocí tohoto vzorce:

kde:

w1	:	ukazatel opakovatelnosti
xi1	:	počet bodů pro první hodnocení vzorku xi
xi2	:	počet bodů pro druhé hodnocení vzorku xi
n	:	počet vzorků

Hodnocené vzorky musí představovat široký rozsah jakosti. Hodnota w1 nesmí překročit 1,5 bodu (na pětibodové stupnici).

B.   STANOVENÍ „UKAZATELE ODCHYLEK“

Tento ukazatel se musí používat pro kontrolu, zda posuzovatel používá pro hodnocení jakosti stejnou stupnici jako zkušená skupina posuzovatelů. Počet bodů přidělených posuzovatelem se porovnává s průměrným počtem bodů, které přidělila skupina posuzovatelů.

Pro hodnocení výsledků se použije tento vzorec:

kde:

xi1; xi2	:	viz část A
;	:	průměrný počet bodů skupiny posuzovatelů pro první a druhé hodnocení vzorku xi
n	:	počet vzorků (nejméně deset za 12 měsíců).

Hodnocené vzorky musí představovat široký rozsah jakosti. Hodnota DI nesmí překročit 1,5 bodu (na pětibodové stupnici).

Členské státy musí informovat o všech potížích, s nimiž se při používání tohoto postupu setkají.

Jestliže se zjistí, že ukazatele odchylek a opakovatelnosti u jednotlivých posuzovatelů překročí hranici 1,5 bodu, musí odborník (odborníci) příslušného orgánu provést jednu nebo několik náhodných „opakovaných“ kontrol na vzorcích jakostně setříděných během několika následujících týdnů, anebo musí s těmito posuzovateli provést jednu nebo několik „doprovázených“ kontrol. Důkladné sledování je nutné k rozhodnutí, zda nadále využívat jejich služeb. Zjištění musí být zaznamenána a uchována jako důkaz pro následná opatření.

C.   POROVNÁNÍ VÝSLEDKŮ ZÍSKANÝCH V RŮZNÝCH REGIONECH ČLENSKÉHO STÁTU A V RŮZNÝCH ČLENSKÝCH STÁTECH

V případě potřeby musí být nejméně jednou za rok zorganizována zkouška, která umožní porovnat výsledky získané posuzovateli z různých regionů. Pokud se zjistí významné rozdíly, je třeba přijmout nezbytná opatření, aby byly zjištěny důvody těchto rozdílů a dosaženy srovnatelné výsledky.

Členské státy mohou organizovat zkoušky, které umožní porovnat výsledky získané jejich vlastními posuzovateli a posuzovateli ze sousedních členských států. V případě zjištění významných rozdílů je nutné provést důkladné šetření, aby byly dosaženy srovnatelné výsledky.

Členské státy sdělí výsledky těchto porovnání Komisi.

PŘÍLOHA IV

(Článek 4)

ORGANOLEPTICKÉ HODNOCENÍ MÁSLA

1.   OBLAST POUŽITÍ

Cílem tohoto postupu organoleptického hodnocení másla je stanovit jednotnou metodu použitelnou ve všech členských státech.

K bližším podrobnostem viz platná mezinárodní norma IDF pro mléko a mléčné výrobky, IDF 99 –části 1, 2, 3 o organoleptickém hodnocení.

2.   DEFINICE

„Organoleptickým hodnocením“ se rozumí posuzování vlastností produktů smyslovými orgány.

„Porotou“ se rozumí skupina vybraných posuzovatelů, kteří během hodnocení pracují, aniž by mezi sebou komunikovali nebo se vzájemně ovlivňovali.

„Posuzovatel“ je osoba zvolená pro svou schopnost provést organoleptickou zkoušku. Tento posuzovatel může mít omezené zkušenosti.

„Odborný posuzovatel“ je osoba s vysokým stupněm organoleptické citlivosti a se zkušenostmi s organoleptickými metodami, jež je schopná provádět soustavná a spolehlivá organoleptická hodnocení různých produktů. Tento posuzovatel má dlouhodobou smyslovou paměť.

„Bodovým hodnocením“ se rozumí organoleptické hodnocení, které vypracuje porota za použití číselné řady. Musí být používána nomenklatura vad.

„Tříděním“ se rozumí třídění podle jakosti prováděné na základě bodového hodnocení.

„Kontrolními dokumenty“ se rozumí dokumenty používané k zaznamenávání bodového hodnocení každé vlastnosti a konečné jakostní třídy produktu (v těchto dokumentech může být rovněž zapsáno chemické složení).

3.   ZKUŠEBNÍ MÍSTNOST

K bližším podrobnostem viz normy ISO 8589 a ISO/DIS 22935–2 | IDF 99–2 odstavec 7.

Musí být přijata opatření, aby ve zkušební místnosti nepůsobily na posuzovatele vnější faktory.

Zkušební místnost musí být prosta cizích pachů a musí být snadné ji udržovat v čistotě. Stěny musí mít světlou a nereflexní barvu.

Zkušební místnost a její osvětlení nesmějí ovlivňovat vlastnosti bodově hodnocených produktů.

Místnost musí být vybavena vhodnou regulací teploty, aby bylo možno zachovat stálou teplotu másla. Máslo by mělo mít v době třídění teplotu 12 °C (±2 °C).

4.   VÝBĚR POSUZOVATELŮ

Posuzovatel musí být dobře obeznámen s výrobky z másla a musí být způsobilý provádět organoleptické jakostní třídění. Jeho způsobilost musí pravidelně (nejméně jednou ročně) posuzovat příslušný orgán.

4.1   Bližší informace o obecných požadavcích a screeningových zkouškách, které lze použít před oficiálním použitím nového posuzovatele, jsou uvedeny v normě ISO/DIS 22935–1 | IDF 99–1 odstavec 4 (nábor) a odstavec 5.1.

Je nezbytně nutné, aby probíhalo školení a aby se pravidelně konaly valné hromady. Informace o školení poroty jsou uvedeny v normě ISO 8586–1.

4.2   Počáteční školení by mělo zahrnovat:

—	obecnou teorii a praktickou důležitost organoleptického hodnocení,

—	metody, stupnice a popis organoleptických dojmů,

—	zjištění a rozpoznání organoleptických vlastností a zvláštní organoleptické termíny,

—	základní školení o výrobě másla,

—	ověřené reference a vzorky, které posuzovateli pomohou stanovit určité chutě a jejich intenzitu v produktu.

5.   POŽADAVKY KLADENÉ NA POROTU

Porota se musí skládat z lichého počtu posuzovatelů, a to nejméně tří. Většinu z nich musí tvořit zaměstnanci příslušného orgánu nebo schválené osoby, které nejsou zaměstnány v mlékárenském průmyslu.

Předseda poroty odpovídá za celkový postup a může být součástí poroty.

Před hodnocením je třeba vzít v úvahu řadu faktorů, aby členové poroty podali optimální výkon:

—	členové poroty nesmějí trpět žádnou chorobou, která by ovlivnila jejich výkon. Pokud taková okolnost nastane, je třeba dotčeného posuzovatele nahradit v porotě jiným,

—	členové poroty se k hodnocení musí dostavit včas a vyhradit si na provedení hodnocení dostatek času,

—	členové poroty nesmějí používat silně vonící látky jako parfém, vodu po holení, deodorant atd., ani jíst silně aromatizovaná (např. silně kořeněná) jídla atd.,

—	členové poroty nesmějí poslední půl hodinu před hodnocením kouřit, jíst ani pít nic jiného než vodu.

6.   VÝKONNOST

Všichni posuzovatelé se musí účastnit pravidelných organoleptických porot, aby si udrželi svou kvalifikaci. Častost zasedání porot závisí na objemu a množství másla; je-li to možné, měla by každý měsíc zasednout alespoň jedna porota.

Několika zasedání porot by se každý rok měli účastnit i zkušení posuzovatelé, a to alespoň jednou za čtvrt roku, je-li to možné.

7.   ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKŮ

Je nezbytné, aby během hodnocení nebyla známa totožnost vzorků a aby se tak zabránilo případné zaujatosti. Vzorky by měly být označeny kódy.

Odběr a přípravu vzorků je nutno zorganizovat před začátkem hodnocení. Musí se stanovit požadavek na teplotu másla během přepravy do zkušební místnosti (6 °C ± 2 °C).

Pokud se organoleptické hodnocení provádí v chladírenském skladu, vzorek se odebírá pomocí máslové sondy. Pokud se organoleptické hodnocení provádí na jiném místě než v chladírenském skladu, je třeba odebrat vzorek nejméně o hmotnosti 500g. Během hodnocení by máslo mělo mít teplotu 12 °C (±2 °C) (viz teplota pro hodnocení másla, jež je v normě ISO/DIS 22935–2 | IDF 99–2 stanovená na 14 °C ± 2 °C). Větším odchylkám od této teploty je nutno za každou cenu zabránit.

8.   POSOUZENÍ HODNOTY KAŽDÉ VLASTNOSTI

8.1   Organoleptické hodnocení musí být provedeno u třech následujících vlastností: vzhledu, konzistence a chuti.

„Vzhled“ se týká těchto znaků: barvy, zjevné čistoty, nepřítomnosti fyzického znečištění, nepřítomnosti tvorby plísní a stejnoměrnosti vodní disperze. Vodní disperze se testuje podle normy IDF 112A/1989.

„Konzistence“ se týká těchto znaků: struktury, textury a tuhosti. Pokud si tak členský stát přeje v zájmu uspokojení požadavků zákazníků, může pomocí fyzikálních prostředků sledovat roztíratelnost. Komise může rozhodnout, že tyto metody v budoucnu harmonizuje.

„Struktura“ je termín, kterým se označuje soudržnost produktu při konzumaci. Obvykle se spojuje s tuhostí a roztíratelností, přičemž by měla být v celém produktu stejnoměrná. Úzce souvisí s texturou a označuje schopnost produktu držet tvar pod vlastní vahou. Projevuje se odolností při krájení a lze ji měřit mechanicky a pocitem v ústech a mezi prsty.

„Chuť“ je vlastnost, kterou vnímáme v ústech, a to zejména chuťovými pohárky na jazyku.

„Vůně“ je vlastnost, kterou vnímáme nosem a čichem.

Významná odchylka od doporučené teploty brání tomu, aby konzistence a chuť byly spolehlivě ohodnoceny. Teplota má klíčový význam.

Jestliže je teplota mimo doporučené rozmezí, musí být třídění másla odloženo.

8.2   Organoleptické hodnocení každé vlastnosti musí být prováděno samostatně. Bodové hodnocení se musí provádět podle tabulky 1.

8.3   Může být žádoucí, aby v zájmu jednotnosti posuzovatelé před zahájením hodnocení společně přidělili body jednomu nebo více referenčním vzorkům za vzhled, konzistenci a chuť.

8.4   Počet bodů nutných pro přijetí je stanoven takto:

Viz část 7 – Nomenklatura a popis kritérií týkajících se bodů při bodování.

	Maximum	Požadavek
Vzhled	5	4
Konzistence	5	4
Chuť/vůně	5	4

—	Pokud není dosažen požadovaný počet bodů, musí být uveden popis vady.

—	Počet bodů od každého posuzovatele pro každou vlastnost musí být zapsán do kontrolního dokumentu.

—	Produkt je přijat, nebo zamítnut na základě rozhodnutí většiny.

—	Případy, kdy jsou rozdíly mezi jednotlivými bodovými hodnoceními každé vlastnosti větší než jeden bod, by se neměly vyskytovat často (nejvýše jednou u každých 20 vzorků). V opačném případě musí předseda poroty prověřit způsobilost poroty.

9.   DOZOR

Předseda poroty, jenž musí být řádným zaměstnancem příslušného orgánu a může být členem poroty, musí nést obecnou odpovědnost za celý postup. Je povinen zapisovat bodové hodnocení každé vlastnosti do kontrolního dokumentu a potvrdit, zda je produkt přijat, nebo zamítnut.

10.   NOMENKLATURA

Viz tabulka 2 uvedená v příloze.

11.   NORMATIVNÍ ODKAZY

FIL-IDF 99C:1997 Senzorické hodnocení mléčných výrobků bodovým hodnocením – Referenční metoda

ISO/DIS 22935 | IDF 99 Mezinárodní norma pro mléko a mléčné výrobky – Senzorická analýza – Části 1–3

ISO 8586–1 Senzorická analýza – Obecná směrnice pro výběr, výcvik a sledování činnosti posuzovatelů – Část 1

ISO 8589 Senzorická analýza – Obecná směrnice pro uspořádání senzorického pracoviště

FIL-IDF 112A:1989 Máslo – Stanovení hodnoty vodní disperze

Tabulka 1

Bodové hodnocení másla

Vzhled			Konzistence			Chuť + vůně
Body	Č. (1)	Poznámky	Body (jakostní třída)	Č. (1)	Poznámky	Body (jakostní třída)	Č. (1)	Poznámky
5		Velmi dobrý ideální druh nejvyšší jakost (rovnoměrný suchý)	5		Velmi dobrá ideální druh nejvyšší jakost (dobře roztíratelné)	5		Velmi dobré ideální druh nejvyšší jakost (absolutně čisté nejjemnější aroma)
4		Dobrý  (2) bez zjevných vad	4	17 18	Dobrá  (2) tvrdá měkká	4		Dobré  (2) bez zjevných vad
3	1 2 3 4 5 6 7 8	Uspokojivý (drobné vady) vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody nejednotné barvy, dvojbarevný pruhovaný žilkovaný, mramorovaný skvrnitý oddělování oleje nadměrné vybarvení porézní textura	3	14 15 16 17 18	Uspokojivá (drobné vady) drobivá, křehká, hrudky pastovitá, těstovitá, mazlavá lepivá tvrdá měkká	3	21 22 25 27 33 34 35	Uspokojivé (drobné vady) nevýrazné cizí chuť kyselé chuť po vaření, připálená chuť chuť krmiva trpké, hořké přesolené
2	1 3 4 5 6 10 11 12	Špatný (zjevné vady) vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody pruhovaný žilkovaný, mramorovaný skvrnitý oddělování oleje cizí látky plesnivý nerozpuštěná sůl	2	14 15 16 17 18	Špatná (zjevné vady) drobivá, křehká, hrudky pastovitá, těstovitá, mazlavá lepivá tvrdá měkká	2	21 22 23 25 32 33 34 35 36 38	Špatné (zjevné vady) nevýrazné cizí chuť zvětralé kyselé oxidovaná, kovová chuť chuť krmiva trpké, hořké přesolené zatuchlé, hnilobné po chemikáliích
1	1 3 4 5 6 7 9 10 11 12	Velmi špatný (závažné vady) vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody pruhovaný žilkovaný, mramorovaný skvrnitý oddělování oleje nadměrné vybarvení zrnitý cizí látky plesnivý nerozpuštěná sůl	1	14 15 16 17 18	Velmi špatná (závažné vady) drobivá, křehká, hrudky pastovitá, těstovitá, mazlavá lepivá tvrdá měkká	1	22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38	Velmi špatné (závažné vady) cizí chuť sýrovité, mléčně sýrové kyselé po kvasnicích po plísni žluklé olejovité, rybina lojovité oxidovaná, kovová chuť trpké, hořké přesolené zatuchlé, hnilobné po sladu po chemikáliích

Tabulka 2

Tabulka vad másla

I. Vzhled

1. vodnatý, se zřetelnými kapičkami vody

2. nejednotné barvy, dvojbarevný

3. pruhovaný

4. žilkovaný, mramorovaný

5. skvrnitý

6. oddělování oleje

7. nadměrné vybarvení

8. porézní textura

9. zrnitý

10. cizí látky

11. plesnivý

12. nerozpuštěná sůl

II. Konzistence

14. drobivá, křehká, hrudky

15. pastovitá, těstovitá, mazlavá

16. lepivá

17. tvrdá

18. měkká

III. Chuť a vůně

20. bez chuti

21. nevýrazné (3)

22. cizí chuť

23. zvětralé

24. sýrovité, mléčně sýrové

25. kyselé

26. po kvasnicích

27. a) chuť po vaření

b) připálená chuť

28. po plísni

29. žluklé

30. olejovité, rybina

31. lojovité

32. a) oxidovaná chuť

b) kovová chuť

33. chuť krmiva

34. trpké, hořké

35. přesolené

36. zatuchlé, hnilobné

37. po sladu

38. po chemikáliích

---

(1)  Tabulka 2.

(2)  Vady uvedené pod hodnocením „dobrý“ představují pouze velmi malé odchylky od ideálního druhu.

(3)  Toto označení je třeba používat co nejméně a jen tehdy, nelze-li vadu popsat přesněji.

PŘÍLOHA V

(Článek 5)

STANOVENÍ OBSAHU TRIGLYCERIDU KYSELINY ENANTHOVÉ V MÁSLE, MÁSELNÉM OLEJI A SMETANĚ PLYNOVOU CHROMATOGRAFICKOU ANALÝZOU TRIGLYCERIDŮ

1.   OBLAST POUŽITÍ

Tento postup vymezuje metodu stanovení obsahu triglyceridu kyseliny enanthové v máselném oleji, másle a smetaně.

2.   TERMÍNY A DEFINICE

Obsah kyseliny enanthové: obsah triglyceridu kyseliny enanthové stanovený postupem uvedeným v této metodě.

Poznámka: Obsah kyseliny enanthové se vyjadřuje v kilogramech na tunu výrobku v případě máselného oleje a másla a v kilogramech na tunu mléčného tuku v případě smetany.

3.   PODSTATA METODY

V souladu s normou ISO 14156 | IDF 172:2001 se z různých výrobků extrahuje mléčný tuk. Kvantitativní stanovení obsahu trigliceridu kyseliny enanthové v extrahovaném tuku se určí pomocí kapilární plynové chromatografie (GC). Výsledek získaný ze vzorku se vyhodnotí porovnáním s triglyceridem kyseliny kapronové jako vnitřním standardem.

Poznámka: Bylo zjištěno, že vhodným vnitřním standardem je také tributyrin.

4.   CHEMIKÁLIE

Použijte pouze chemická činidla uznávané analytické čistoty.

4.1   n-hexan

4.2   Běžný triglycerid kyseliny kapronové, čistota nejméně 99 %

4.3   Běžný triglycerid kyseliny enanthové, čistota nejméně 99 %

4.4   Bezvodý síran sodný (Na2SO4)

5.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení, a zejména:

5.1   Analytické váhy s přesností na 1 mg

5.2   Odměrné baňky o objemu 10 ml a 20 ml

5.3   Odstředivkové zkumavky o objemu 30 ml

5.4   Rotační odparka

5.5   Pec, kterou lze udržovat na teplotě 50 °C ± 5 °C

5.6   Filtrační papír střední pórovitosti o průměru asi 15 cm

Plynové chromatografické zařízení

5.7.1   Plynový chromatograf s děleným/neděleným (tzv. split/splitless) nebo kolonovým (tzv. on-column) nástřikovým zařízením a plamenově ionizačním detektorem (FID)

GC kolona se stacionární fází, která se ukázala být vhodnou při provádění separace triglyceridů (100 % dimethylpolysiloxan, nebo 5 % fenyl – 95 % methylpolysiloxan). Zvolte stacionární fázi, délku kolony (od 4 m do 15 m), vnitřní průměr (od 0,22 mm do 0,50 mm) a tloušťku filmu (0,12 μm nebo více) s přihlédnutím k laboratorním zkušenostem a použitému nástřikovému sytému. Zvolená kolona by v každém případě měla umožnit sledovat jak úplné rozdělení mezi píkem rozpouštědla a triglyceridem kyseliny kapronové, tak rozlišení základní linie mezi píky triglyceridu kyseliny kapronové a enanthové. Příklady použitelných podmínek jsou uvedeny níže.

5.7.2.1   Příklad použitelných podmínek s využitím děleného nástřikového zařízení:

—	nosný plyn: helium,

—	tlak na koloně: 100 kPa,

—	kolona: kolona z křemenného skla o délce 12 m, vnitřním průměru 0,5 mm, tloušťce filmu 0,1 μm,

—	stacionární fáze: 100 % dimethylpolysiloxan, nebo 5 % fenyl – 95 % dimethylpolysiloxan (např. HT5),

—	teplota kolony: počáteční teplota 130 °C udržovaná po dobu 1 minuty, zvýšená rychlostí 20 °C/min na 260 °C a poté zvýšená rychlostí 30 °C/min na 360 °C; udržujte při teplotě 360 °C po dobu 10 min,

—	teplota detektoru: 370 °C,

—	teplota nástřikového zařízení: 350 °C,

—	poměr rozdělení 1:30,

—	množství nastříknutého vzorku: 1 μl.

5.7.2.2   Příklad použitelných podmínek s využitím kolonového nástřikového zařízení:

—	nosný plyn: vodík (systém s konstantním průtokem),

—	tlak na koloně: 89 kPa,

—	kolona: kolona z křemenného skla o délce 4 m, vnitřním průměru 0,32 mm, tloušťce filmu 0,25 μm,

—	stacionární fáze: 5 % fenyl, 95 % dimethylpolysiloxan,

—	teplota kolony: počáteční teplota 60 °C udržovaná po dobu 2 minut, zvýšená rychlostí 35 °C/min na 340 °C a udržovaná při této teplotě po dobu 5 min,

—	teplota detektoru: 350 °C,

—	množství nastříknutého vzorku: 1 μl.

5.8   Injekční stříkačka o objemu 5 μl

6.   ODBĚR VZORKŮ

Je důležité, aby laboratoř obdržela vzorek, který je skutečně reprezentativní a který nebyl během přepravy nebo skladování poškozen ani změněn.

Odběr vzorků není součástí metody uvedené v této mezinárodní normě. Doporučená metoda odběru vzorků je uvedena v normě IDF 50C:1995 nebo ISO 707–1997 – Mléko a mléčné výrobky – Směrnice pro odběr vzorků.

7.   PRACOVNÍ POSTUP

7.1   Příprava zkušebního vzorku a zkušební dávky

Postupujte podle normy ISO 14156 | IDF 172:2001.

7.1.1   Máselný olej, máslo

7.1.1.1   Rozpusťte 50 až 100 g zkušebního vzorku v peci (5.5).

7.1.1.2   Do složeného filtračního papíru vložte 0,5 g až 1,0 g bezvodého síranu sodného (5.4).

7.1.1.3   Přefiltrujte tuk přes filtrační papír obsahující bezvodý síran sodný a filtrát zachyťte do kádinky ponechané v peci (5.5). Při přelévání rozpuštěného másla na filtrační papír dávejte pozor na to, aby nedošlo k přenosu séra.

7.1.2   Smetana

7.1.2.1   Zahřejte zkušební vzorek na teplotu 20 °C ± 2 °C.

7.1.2.2   Důkladně vzorek promíchejte.

7.1.2.3   Rozpusťte vhodné množství zkušebního vzorku tak, abyste získali 10 ml zkušební dávky s hmotnostním zlomkem tuku asi 4 %.

7.1.2.4   Při extrahování tuku ze smetany postupujte jako v případě syrového a homogenizovaného mléka (viz ISO 14156 | IDF 172:2001, §8.3).

7.1.2.5   V odměrné baňce na 10 ml (5.2) odměřte 1 g extrahovaného tuku s přesností na 1 mg. Přidejte 1 ml roztoku 7.2.2. Doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1) a homogenizujte.

7.1.2.6   Přidejte 1 ml roztoku 7.1.1.2 do odměrné baňky na 10 ml (5.2) a nařeďte ho na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.2   Příprava kalibračních standardů

7.2.1   Rozpusťte 10 mg triglyceridu kyseliny enanthové (4.3) v 10 ml n-hexanu (4.1).

7.2.2   Rozpusťte 10 mg triglyceridu kyseliny kapronové (4.2) v 10 ml n-hexanu (4.1).

7.2.3   Přidejte 1 ml roztoku 7.2.2 do odměrné baňky na 10 ml (5.2). Doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.2.4   Přidejte 1 ml roztoku 7.2.1 a 1 ml roztoku 7.2.2 do odměrné baňky na 10 ml (5.2). Doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.2.5   Přidejte 1 ml roztoku 7.2.4 do odměrné baňky na 10 ml (5.2) a doplňte na 10 ml n-hexanem (4.1).

7.3   Chromatografické stanovení

7.3.1   Nastříkněte dvakrát 1 μl standardního roztoku 7.2.5.

7.3.2   Nastříkněte 1 μl každého roztoku vzorku.

Poznámka: Použije-li se kolonový nástřikový systém, měly by se jak standardní roztok, tak roztoky vzorků více naředit.

7.3.3   Opakujte operaci 7.3.1 u každého třetího vzorku tak, abyste na začátku a na konci skupiny vzorků provedli vždy dva standardní nástřiky. Výsledky jsou založeny na středním průměru odezvových faktorů ze standardních chromatogramů.

8.   VÝPOČET VÝSLEDKŮ

U každého chromatogramu určete oblast píků souvisejících s triglyceridy kyseliny enanthové a kyseliny kapronové.

Řiďte se těmito pokyny u každé ohraničené řady, tj. u každé skupiny ohraničených vzorků je standardním roztokem nastříknutým dvakrát bezprostředně před ní STD1 a standardním roztokem nastříknutým dvakrát bezprostředně po ní STD2.

8.1   Kalibrace

8.1.1   Vypočítejte odezvový faktor Rf1(a) a Rf1(b) pro každý duplikát STD1

Rf1 (a) nebo (b) = (plocha píků triglyceridu kyseliny kapronové/plocha píků triglyceridu kyseliny enanthové) × 100

Vypočítejte střední průměr odezvového faktoru Rf1:

Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2

8.1.2   Obdobným způsobem vypočítejte střední průměr odezvového faktoru Rf2 pro STD2

8.1.3   Vypočítejte střední průměr odezvového faktoru Rf

Rf = (Rf1 + Rf2) /2

8.2   Zkušební vzorky

Pro každý chromatogram vzorků získaný mezi STD1 a STD2 vypočítejte obsah kyseliny enanthové C (kg/t):

C = (plocha píků triglyceridu kyseliny enanthové × Rf × 100)/(plocha píků triglyceridu kyseliny kapronové × Wt × 1 000)

kde:

—	Wt = váha odebraného tuku (g),

—	100 = objem zředěného vzorku,

—	1 000 = převodní faktor (z μg/g na kg/t)

V případě vzorků másla přihlédněte k obsahu tuku v másle a vypočítejte upravenou hodnotu koncentrace Cmáslo (kg/t másla)

Cmáslo = Ctuk × F

kde F je obsah tuku v másle.

9.   SHODNOST

Podrobnosti o mezilaboratorní zkoušce másla podle norem ISO 5725–1 a ISO 5725–2 týkající se přesné metody jsou uvedeny v bodě (12).

Mezní hodnoty opakovatelnosti a reprodukovatelnosti jsou vyjádřeny pro 95 % pravděpodobnost a nemusí být použitelné na jiné než uvedené rozsahy koncentrací a matrice.

9.1   Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek získaných s krátkým časovým odstupem stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu ve stejné laboratoři a stejným pracovníkem používajícím stejné zařízení by ve více než 5 % případů neměl být větší než 0,35 kg/t.

9.2   Reprodukovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek získaných stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu v různých laboratořích a různými pracovníky používajícími odlišná zařízení by ve více než 5 % případů neměl být větší než 0,66 kg/t.

10.   MEZE TOLERANCE: DOLNÍ MEZE (PŘÍPAD NEDOSTATEČNÝCH MNOŽSTVÍ)

10.1   Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

10.2   Máslo a zahuštěné máslo

10.2.1   Dávkování je 11 kg triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 % na jednu tunu másla, tj. 10,45 kg/t.

10.2.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	9,51 kg/t (95 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení),

—	6,89 kg/t (70 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení),

—	koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem s nejnižší hodnotou se použije interpolací mezi hodnotami 9,51 kg/t a 6,89 kg/t.

10.3   Smetana

10.3.1   Dávkování je 10 kg triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 % na jednu tunu mléčného tuku, tj. 9,50 kg/t mléčného tuku se stopovací látkou.

10.3.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	8,60 kg/t (95 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení),

—	6,23 kg/t (70 % minimálního dávkování triglyceridu kyseliny enanthové o čistotě 95 %, jednotlivé stanovení),

—	koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem s nejnižší hodnotou se použije interpolací mezi hodnotami 8,60 kg/t a 6,23 kg/t.

11.   MEZE TOLERANCE: HORNÍ MEZE (PŘÍPAD PŘEKROČENÍ MNOžSTVÍ O VÍCE NEŽ20 %)

11.1   Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

11.2   Máslo a zahuštěné máslo

11.2.1   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a průměrný výsledek se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	horní mez činí 12,96 kg/t.

11.3   Smetana

11.3.1   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a průměrný výsledek se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	horní mez činí 11,82 kg/t.

12.   DALŠÍ INFORMACE: STATISTICKÁ ANALÝZA VÝSLEDKŮ STANOVENÍ TRIENANTOÁTU V MÁSELNÉM TUKU ANALÝZOU TRIGLICERIDU

Pro stanovení obsahu trienantoátu v másle se stopovacími látkami byly provedeny čtyři společné pokusy.

První kruhové zkoušky se zúčastnilo devět laboratoří, přičemž nebyly poskytnuty žádné specifikace o analytických metodách, které se měly použít.

Druhé kruhové zkoušky se zúčastnilo deset laboratoří, přičemž byly použity 4 různé metody:

—	kvantifikace methylheptanoátu použitím n-nonanu nebo methylnonanoátu jako vnitřního standardu,

—	kvantifikace trienantoátu použitím trikaproátu jako vnitřního standardu,

—	kvantifikace methylheptanoátu použitím kalibračního vzorku/kalibrační směsi,

—	kvantifikace methylheptanoátu použitím kalibrační směsi.

Prováděla-li se kromě toho analýza methylesterů mastných kyselin (FAME), byly použity dva odlišné postupy methylace (De Francesco a Christopherson & Glass).

V důsledku získaných výsledků byly pro třetí kruhovou zkoušku zvoleny dvě metody:

—	kvantifikace methylheptanoátu použitím n-nonanu nebo methylnonanoátu jako vnitřního standardu,

—	kvantifikace trienantoátu použitím trikaproátu jako vnitřního standardu.

Výsledky sedmi laboratoří prokázaly, že metoda FAME vede k vyšší variabilitě, v důsledku čehož bylo rozhodnuto, že se použije pouze stanovení trienantoátu jako triglyceridu na základě postupu kvantifikace trienantoátu použitím trikaproátu jako vnitřního standardu. Analýza triglyceridu musí být navíc provedena pomocí kapilární kolony.

Ve čtvrté kruhové zkoušce kolovaly čtyři vzorky (A, B, C, D) a výsledky poskytlo devět laboratoří (tabulky 1–2).

Dvě laboratoře (DE a EU) analyzovaly vzorky pomocí metody FAME.

Z důvodu nižšího počtu laboratoří byl statistický výpočet proveden jak z celkového souboru údajů (obrázky 1–2) včetně výsledků analýz FAME, tak z údajů získaných z analýzy TG.

Zkoušky pro odlehlé hodnoty:

—	Vzorek A. Dixonův, Cochranův a Grubbsův test na úrovni 1 a 5 % prokázaly jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

—	Vzorek B. Grubbsův test na úrovni 5 % prokázal jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

—	Vzorek C. Dixonův a Grubbsův test na úrovni 1 a 5 % prokázaly jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

—	Vzorek D. Dixonův a Grubbsův test na úrovni 1 a 5 % prokázaly jednu laboratorní odlehlou hodnotu.

Odlehlá hodnota byla z výpočtu vyloučena.

Hodí se poznamenat, že výsledky získané metodou FAME se v použitých zkouškách nikdy nepovažovaly za odlehlé hodnoty.

Parametry shodnosti

V tabulkách 1 a 2 jsou uvedeny výsledky všech laboratoří a parametry shodnosti, jež jsou vypočítané z přijatelného počtu (8) laboratoří, bohužel však nevycházejí ze stejné analytické metody.

V tabulkách 3 a 4 jsou uvedeny výsledky odvozené pouze z metody TG a odpovídající parametry shodnosti. Přijetí těchto parametrů závisí na přijetí nízkého počtu laboratoří (6).

Obrázky 2 a 3 ukazují trend hodnot Sr a SR vypočítaných ze 4 vzorků dvou souborů údajů popsaných výše.

V tabulce 5 jsou uvedeny hodnoty Sr a SR společně s odpovídajícími úhrnnými hodnotami a celkovými parametry r a R.

Nakonec byl vypočítán kritický rozdíl při 95 % pravděpodobnosti.

Tabulka 1:

Statistické výsledky metod TG a FAME*

Vzorek A		R1	R2	Střed	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	8
RENNES	FR1	11,0	11.1	11.1	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Odlehlé hodnoty	DК
ZPLA	DE*	11,6	11,8	11,7	Střední hodnota	11,3
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Skutečná hodnota	11,0
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,09
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	0,80
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Opakovatelnost r (95 %)	0,26
ISPRA	EU*	11,0	11,0	11,0	Relativní opakovatelnost r %	2,24
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,23
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	2,04
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,84
					Relativní reprodukovatelnost R %	5,71
Vzorek B		R1	R2	Střed	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	8
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Odlehlé hodnoty	DK
ZPLA	DE*	14,0	13,8	13,9	Střední hodnota	13,4
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Skutečná hodnota	13,5
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,14
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	1,04
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Opakovatelnost r (95 %)	0,40
ISPRA	EU*	13,2	13,3	13,3	Relativní opakovatelnost r %	2,91
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,35
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	2,61
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,99
					Relativní reprodukovatelnost R %	7,31

Tabulka 2:

Statistické výsledky metod TG a FAME*

Vzorek C		R1	R2	STŘED	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	8
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Odlehlé hodnoty	DK
ZPLA	DE*	9,2	9,4	9,3	Střední hodnota	9,3
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Skutečná hodnota	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,14
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	1,50
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Opakovatelnost r (95 %)	0,40
ISPRA	EU*	9,4	9,3	9,4	Relativní opakovatelnost r %	4,20
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,17
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	1,82
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,47
					Relativní reprodukovatelnost R %	5,10
Vzorek D		R1	R2	Střed	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	8
RENNES	R1	1,6	1,6	1,6	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Odlehlé hodnoty	DK
ZPLA	DE*	2,3	2,3	2,3	Střední hodnota	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Skutečná hodnota	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,08
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	3,81
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Opakovatelnost r (95 %)	0,22
ISPRA	UE*	2,3	2,3	2,3	Relativní opakovatelnost r %	10,67
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,24
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	11,43
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,67
					Relativní reprodukovatelnost R %	32,00

Tabulka 3:

Statistické výsledky metod TG a FAME*

Vzorek A		R1	R2	Střed	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	6
RENNES	FR1	11,0	11,1	11,1	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	11,2	11,2	11,2	Odlehlé hodnoty	DК
ADAS	GB	11,4	11,2	11,3	Střední hodnota	11,2
CNEVA	FR2	11,4	11,4	11,4	Skutečná hodnota	11,0
LODI	IT	11,1	11,3	11,2	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,09
EELA	FI	11,3	11,2	11,3	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	0,80
D.V.F.A.	DK	13,3	11,8	12,6	Opakovatelnost r (95 %)	0,25
					Relativní opakovatelnost r %	2,24
					Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,13
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	1,16
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,36
					Relativní reprodukovatelnost R %	3,25
Vzorek B		R1	R2	Střed	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	6
RENNES	FR1	12,7	12,8	12,8	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	13,5	13,3	13,4	Odlehlé hodnoty	DК
ADAS	GB	13,4	13,5	13,5	Střední hodnota	13,3
CNEVA	FR2	13,3	13,4	13,4	Skutečná hodnota	13,5
LODI	IT	13,9	13,5	13,7	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,15
EELA	FI	13,4	13,2	13,3	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	1,13
D.V.F.A.	DK	14,1	14,8	14,5	Opakovatelnost r (95 %)	0,42
					Relativní opakovatelnost r %	3,16
					Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,33
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	2,48
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,93
					Relativní reprodukovatelnost R %	6,94

Tabulka 4:

Statistické výsledky metody TG

Vzorek C		R1	R2	Střed	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	6
RENNES	FR1	8,9	9,2	9,1	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	9,2	9,3	9,3	Odlehlé hodnoty	DК
ADAS	GB	9,5	9,3	9,4	Střední hodnota	9,3
CNEVA	FR2	9,4	9,4	9,4	Skutečná hodnota	9,3
LODI	IT	9,2	9,5	9,4	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,15
EELA	FI	9,4	9,6	9,5	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	1,61
D.V.F.A.	DK	10,7	10,9	10,8	Opakovatelnost r (95 %)	0,42
					Relativní opakovatelnost r %	4,51
					Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,19
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	2,04
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,53
					Relativní reprodukovatelnost R %	5.71
Vzorek D		R1	R2	Střed	Počet laboratoří po vyloučení odlehlých hodnot	6
RENNES	FR1	1,6	1,6	1,6	Počet odlehlých hodnot	1
RIKILT	NL	2,1	2,1	2,1	Odlehlé hodnoty	DK
					Střední hodnota	2,1
ADAS	GB	2,1	2,2	2,2	Skutečná hodnota	2,1
CNEVA	FR2	2,1	2,1	2,1	Směrodatná odchylka opakovatelnosti (Sr)	0,09
LODI	IT	2,2	1,9	2,1	Relativní směrodatná odchylka opakovatelnosti (RSDr %)	4,29
EELA	FI	2,3	2,3	2,3	Opakovatelnost r (95 %)	0,26
D.V.F.A.	DK	3,4	2,9	3,2	Relativní opakovatelnost r %	12,01
					Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR)	0,25
					Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR %)	11,90
					Reprodukovatelnost R (95 %)	0,69
					Relativní reprodukovatelnost R %	33,32

Tabulka 5

Opakovatelnost a reprodukovatelnost (s analýzou FAME*)

	Počet laboratoří	Odlehlá hodnota	Opakovatelnost Sr (95 %)	Reprodukovatelnost SR (95 %)
Vzorek A	8	1	0,09	0,23
Vzorek B	8	1	0,14	0,35
Vzorek C	8	1	0,14	0,17
Vzorek D	8	1	0,08	0,24
Úhrnná hodnota			0,116	0,256
			R	R
Úhrnná hodnota* 2,8			0,324	0,716
CrD95 = 0,40 Minimální čistota stanovená pro trienantoát = 95 % Minimální mez stanovená pro trienantoát v mléčném tuku = 11 kg/t Přihlédneme-li ke kritickému rozdílu při 95 % pravděpodobnosti, nesmí být průměr obou výsledků menší než:   10,05 kg/t v případě přidání trienantoátu o čistotě 95 %.

Opakovatelnost a reprodukovatelnost (bez analýzy FAME)

	Počet laboratoří	Odlehlá hodnota	Opakovatelnost Sr (95 %)	Reprodukovatelnost SR (95 %)
Vzorek A	6	1	0,09	0,13
Vzorek B	6	1	0,15	0,33
Vzorek C	6	1	0,15	0,19
Vzorek D	6	1	0,09	0,25
Úhrnná hodnota			0,124	0,237
			r	R
Úhrnná hodnota * 2,8			0,347	0,663
CrD95 = 0,36 Minimální čistota stanovená pro trienantoát = 95 % Minimální mez stanovená pro trienantoát v mléčném tuku = 11 kg/t Přihlédneme-li ke kritickému rozdílu při 95 % pravděpodobnosti, nesmí být průměr obou výsledků menší než:   10,09 kg/t v případě přidání trienantoátu o čistotě 95 %.

Obrázek 1 (1)

Výsledky zkoušek: vzorek A

Výsledky zkoušek: vzorek B

Výsledky zkoušek: vzorek C

Výsledky zkoušek: vzorek D

Obrázek 2

Směrodatná odchylka opakovatelnosti a reprodukovatelnosti na různých stupních (TG + FAME)

Obrázek 3

Směrodatná odchylka opakovatelnosti a reprodukovatelnosti na různých stupních (TG)

Obrázek 4

Příklad použití kolonového nástřikového zařízení

---

(1)  = metoda FAME.

PŘÍLOHA VI

(Článek 5)

STANOVENÍ OBSAHU VANILINU V ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE, MÁSLE NEBO SMETANĚ VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení vanilinu v zahuštěném másle, másle nebo smetaně.

2.   PODSTATA METODY

Extrakce známého množství vzorku směsí isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Vysrážení většiny tuku ochlazením na teplotu mezi –15 °C a –20 °C a následným odstředěním.

Po zředění vodou se stanoví obsah vanilinu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení, a zejména:

3.1   Mrazicí box určený pro teploty v rozmezí od –15 °C do –20 °C

3.2   Injekční stříkačky na jedno použití o objemu 2 ml

3.3   Membránové mikrofiltry o velikosti pórů 0,45 μm, odolné roztoku obsahujícímu 5 % extrakčního roztoku (4.4)

3.4   Systém pro kapalinovou chromatografii sestávající z čerpadla (s průtokem 1,0 ml/min), nástřikového zařízení (automatického nebo manuálního, objem nástřiku 20 μl) a UV detektoru (fungujícího při 306 nm, 0,01 Å rozsahu stupnice), zapisovače nebo integrátoru a termostatu kolony fungujícího při 25 °C

3.5   Analytická kolona (250 mm × 4,6 mm/vnitřní průměr/), naplněná fází LiChrosper RP 18 (Merck, 5 μm) nebo jinou rovnocennou fází

3.6   Ochranná kolona (cca 20 mm × 3 mm/vnitřní průměr/), naplněná za sucha fází LiChrospher RP 18 (5 až 10 μm) nebo jinou rovnocennou fází

3.7   Odstředivka fungující při 2 000 ot/min

4.   CHEMIKÁLIE

Používají se pouze chemikálie čistoty p.a.

4.1   Isopropanol

4.2   Ethanol, 96 % obj.

4.3   Acetonitril

4.4   Extrakční roztok

Isopropanol (4.1), ethanol (4.2) a acetonitril (4.3) se smíchají v poměru 1:1:2 (obj.).

Vanilin (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd) ≥ 98 %

4.5.1   Zásobní roztok vanilinu (500 μg/ml)

S přesností na 0,1 mg navažte asi 50 mg (CM mg) vanilinu (4.5) do odměrné baňky na 100 ml, přidejte 25 ml extrakčního roztoku (4.4) a doplňte po značku vodou.

4.5.2   Standardní roztok vanilinu (10 μg/ml)

Do odměrné baňky na 250 ml pipetou přeneste 5 ml zásobního roztoku vanilinu (4.5.1) a doplňte po značku vodou.

4.5.3   Methanol čistoty pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC)

4.5.4   Kyselina octová, ledová

4.5.5   Voda čistoty pro HPLC

4.5.6   Mobilní fáze HPLC

V odměrné baňce na 1 000 ml smíchejte 300 ml methanolu (4.5.3), cca 500 ml vody (4.5.5) a 20 ml kyseliny octové (4.5.4) a doplňte po značku vodou (4.5.5). Přefiltrujte přes filtr 0,45 μm (3.3).

5.   PRACOVNÍ POSTUP

5.1   Příprava zkušebního vzorku

5.1.1   Máslo

Vzorek zahřívejte, dokud nezačne tát. Je nutné zabránit místnímu přehřátí nad 30 °C. Máslo se v žádném případě nesmí oddělit ve dvou fázích. Jakmile je vzorek dostatečně plastický, homogenizujte jej protřepáním. Před odběrem vzorku máslo po dobu 15 sekund míchejte. Do odměrné baňky na 100 ml navažte s přesností na 1 mg asi 5 g (SM g) másla.

5.1.2   Zahuštěné máslo

Bezprostředně před odběrem vzorku vložte nádobu se zahuštěným máslem do sušárny o teplotě 40 °C až 50 °C, aby máslo zcela roztálo. Vzorek promíchejte protřepáním nebo mícháním, které však nesmí být tak silné, aby se vytvářely vzduchové bubliny. Do odměrné baňky na 100 ml navažte s přesností na 1 mg asi 4 g (SM g) zahuštěného másla.

5.1.3   Smetana

Vzorek zahřejte ve vodní lázni nebo termostatu na teplotu 35 °C až 40 °C. Tuk rovnoměrně rozprostřete třepáním, a je-li to nutné, také promícháním. Vzorek rychle ochlaďte na 20 ± 2 °C. Vzorek musí být na pohled homogenní, v opačném případě je třeba postup opakovat. Do odměrné baňky na 100 ml navažte s přesností na 1 mg asi 10 g (SM g) smetany.

5.2   Příprava zkušebního roztoku

Přidejte asi 75 ml extrakčního roztoku (4.4) ke zkušebnímu vzorku (5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3), důkladně promíchávejte nebo protřepávejte po dobu asi 15 minut a doplňte po značku extrakčním roztokem (4.4). Asi 10 ml tohoto extraktu převeďte do zkumavky opatřené zátkou. Zkumavku uložte do mrazicího boxu (3.1) a nechte ji v něm stát asi 30 minut. Vychlazený extrakt odstřeďujte po dobu 5 minut asi při 2 000 otáčkách za minutu a okamžitě dekantujte. Dekantovaný roztok nechte přizpůsobit laboratorní teplotě. Do odměrné baňky na 100 ml pipetou přeneste 5 ml dekantovaného roztoku a doplňte vodou. Alikvotní díl přefiltrujte přes membránový mikrofiltr (3.3) pomocí stříkačky (3.2). Filtrát je připraven ke stanovení pomocí HPLC.

5.3   Kalibrace

Do odměrné baňky na 100 ml pipetou přeneste 5 ml standardního roztoku vanilinu (4.5.2). Přidejte 5 ml extrakčního roztoku (4.4) a doplňte po značku vodou. Tento roztok obsahuje 0,5 μg/ml vanilinu.

5.4   Stanovení pomocí HPLC

Chromatografický systém nechte asi 30 minut stabilizovat. Nastříkněte standardní roztok (5.3). Tento postup opakujte, dokud rozdíl v ploše píků nebo výšce píků mezi dvěma po sobě jdoucími nástřiky nebude menší než 2 %. Za popsaných podmínek je retenční čas vanilinu asi 9 minut. Standardní roztok (5.3) paralelně analyzujte nastříknutím 20 μl. Nastříkněte 20 μl zkušebních roztoků (5.2). Stanovte plochu nebo výšku získaného píku vanilinu. Po provedení 10 nástřiků zkušebních vzorků (5.2) opakujte duplicitní nástřik standardního roztoku (5.3).

6.   VÝPOČET VÝSLEDKŮ

Vypočítejte průměrnou plochu (nebo výšku) (AC) píků vanilinu odpovídajících duplicitním nástřikům u každé šarže zkušebních roztoků (čtyři plochy nebo výšky).

Vypočítejte odezvový faktor (R):

kde CM je hmotnost vanilinu v mg (4.5.1).

Obsah (mg/kg) vanilinu (C) ve zkušebním vzorku je dán vzorcem:

kde:

AS	=	plocha nebo výška píku vanilinu zkušebního vzorku
SM	=	hmotnost zkušebního vzorku v g (5.1.1, 5.1.2 nebo 5.1.3).

Poznámka: Pokud se za účelem stanovení vanilinu analyzuje smetana, koncentrace stopovací látky musí být vyjádřena v miligramech stopovací látky na kilogram mléčného tuku. Tento výpočet se provede vynásobením hodnoty C výrazem 100/f, kde f je obsah tuku ve smetaně v hmotnostních procentech.

20	=	koeficient, kterým se berou v úvahu zředění srovnávacího a zkušebního vzorku
0,96	=	opravný faktor pro obsah tuku v prvním zředění zkušebního vzorku

Poznámka: Místo plochy píků lze použít výšku píků (viz 8.3).

7.   PŘESNOST METODY

7.1   Opakovatelnost (r)

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 16 mg/kg.

7.2   Reprodukovatelnost (R)

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 27 mg/kg.

8.   MEZE TOLERANCE

8.1   Pro účely posouzení homogenity musí být z produktu obsahujícího stopovací látku odebrány tři vzorky.

Stopovací látka získaná z vanilky nebo ze syntetického vanilinu

8.2.1   Dávkování 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehydu je 250 g na jednu tunu zahuštěného másla nebo másla. Jsou-li stopovací látky přidávány do smetany, pak je dávkování 250 g látky na tunu mléčného tuku.

8.2.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	220,8 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky),

—	158,3 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 220,8 mg/kg a 158,3 mg/kg.

Stopovací látka získaná výhradně z vanilkových bobů nebo z jejich komplexních extraktů

8.3.1   Dávkování 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehydu je 100 g na jednu tunu zahuštěného másla nebo másla. Jsou-li stopovací látky přidávány do smetany, pak je dávkování 100 g látky na tunu mléčného tuku.

8.3.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	78,3 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky),

—	53,3 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 78,3 mg/kg a 53,3 mg/kg.

9.   POZNÁMKY

9.1   Rekuperace přidaného vanilinu na úrovni 250 mg/kg máselného oleje kolísá v rozmezí od 97,0 do 103,8. Průměrný zjištěný obsah byl 99,9 % se směrodatnou odchylkou 2,7 %.

9.2   Standardní roztok obsahuje 5 % extrakčního roztoku z důvodu kompenzace rozšiřování píků způsobeného přítomností 5 % extrakčního roztoku ve zkušebních vzorcích. To umožňuje kvantifikaci na základě výšky píků.

9.3   Analýza je založena na lineární kalibrační křivce (intercept nula).

9.4   Linearitu je třeba ověřit nejprve při prvním provedení analýzy pomocí vhodných ředění standardního roztoku (4.5.2) a poté v pravidelných intervalech a po každé změně či opravě zařízení na HPLC. Vanilin lze působením vnitřních enzymů v nepasterizované smetaně nebo ve výrobcích z nepasterizované smetany rozložit na kyselinu vanilinovou, divanilin a jiné sloučeniny.

PŘÍLOHA VII

(Článek 5)

SPEKTROMETRICKÉ KVANTITATIVNÍ STANOVENÍ ETHYLESTERU BETA-APO-8'-KAROTENOVÉ KYSELINY V ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE A MÁSLE

1.   PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení ethylesteru beta-apo-8'-karotenové kyseliny (apokarotenového esteru) v zahuštěném másle a másle. Apokarotenový ester je souhrn všech látek přítomných v extraktu vzorků získaném za podmínek popsaných v této metodě, které absorbují světlo při 440 nm.

2.   PODSTATA METODY

Máselný tuk se rozpustí v petroletheru a změří se jeho absorbance při 440 nm. Obsah apokarotenového esteru se stanoví porovnáním s vnějším standardem.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1   Pipety – dělené, o objemu 0,25, 0,50, 0,75 a 1,0 ml

3.2   Spektrofotometr – vhodný pro používání při 440 nm (a 447–449 nm) a vybavený kyvetami s délkou optické dráhy 1 cm

3.3   Odměrné baňky na 20 ml a 100 ml

3.4   Analytické váhy s citlivostí 0,1 mg, vážící s přesností na 1 mg a s možností odečtu po 0,1 mg

3.5   Pec, 45 °C ± 1 °C

3.6   Rychlofiltrační bezpopelné filtry

4.   CHEMIKÁLIE

Používají se pouze chemikálie čistoty p.a.

Suspenze apokarotenového esteru (přibližně 20 %)

4.1.1   Obsah látky v suspenzi se stanoví takto:

Suspenzi zahřejte na teplotu 45 °C až 50 °C a homogenizujte v neotevřené původní nádobě. Do odměrné baňky na 100 ml navažte 400 mg, rozpusťte ve 20 ml chloroformu (4.4) a doplňte po značku cyklohexanem (4.5). Zřeďte 5 ml tohoto roztoku cyklohexanem na 100 ml (roztok A). Zřeďte 5 ml roztoku A cyklohexanem na 100 ml. Změřte absorbanci při 447–449 nm (měří se maximum vztažené k cyklohexanu jako referenční hodnotě pomocí kyvet s délkou optické dráhy 1 cm).

Obsah apokarotenového esteru P (%) = (Abs max × 40 000)/(Msusp × 2 550) nebo se odvodí: (Absmax /2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/Msusp)

Absmax	=	absorbance měrného roztoku při maximu
Msusp	=	hmotnost suspenze (g)
2 550	=	referenční hodnota Abs (1 %, 1 cm)
P	=	Čistota (obsah) suspenze (%)

Poznámka: Suspenze apokarotenového esteru je citlivá na vzduch, teplo a světlo. V neotevřené původní nádobě (těsně uzavřené v dusíkové atmosféře) a v chladu ji lze skladovat po dobu asi 12 měsíců. Po otevření je třeba obsah v krátké době spotřebovat.

4.1.2   Standardní roztok apokarotenového esteru, přibližně 0,2 mg/ml

S přesností na 0,1 mg navažte asi 0,100 g suspenze apokarotenového esteru (4.1.1) (W), rozpusťte v petroletheru (4.2), kvantitativně převeďte do odměrné baňky o objemu 100 ml a doplňte po značku petroletherem.

Tento roztok obsahuje (W × P) / 10 mg/ml apokarotenového esteru.

Poznámka: Roztok musí být uložen na chladném a tmavém místě. Nepoužitý roztok po měsíci vyřaďte.

4.2   Petrolether (40–60 °C)

4.3   Síran sodný bezvodý, granulovaný, předem sušený dvě hodiny při teplotě 102 °C

4.4   Chloroform

4.5   Cyklohexan

5.   PRACOVNÍ POSTUP

5.1   Příprava zkušebního vzorku

5.1.1   Zahuštěné máslo

Vzorek roztavte v sušárně při teplotě asi 45 °C.

5.1.2   Máslo

Vzorek roztavte v sušárně při teplotě asi 45 °C a reprezentativní část přefiltrujte přes filtr obsahující asi 10 g bezvodého síranu sodného (4.3) v prostředí, které je chráněné před silným přirozeným nebo umělým světlem a udržované při teplotě 45 °C. Odeberte patřičné množství máselného tuku.

5.2   Stanovení

S přesností na 1 mg navažte asi 1 g zahuštěného másla (nebo extrahovaného máselného tuku (5.1.2)) (M). Kvantitativně převeďte do odměrné baňky na 20 ml (V) petroletherem (4.2), doplňte po značku a důkladně promíchejte.

Alikvotní díl této směsi převeďte do kyvety 1 cm dlouhé a změřte absorbanci při 440 nm ve vztahu k petroletheru jako referenční hodnotě. Pomocí získané standardní křivky (C μ/ml) zjistěte koncentraci apokarotenového esteru v roztoku.

5.3   Kalibrace

Do pěti odměrných baněk na 100 ml pipetou přeneste 0, 0,25, 0,5, 0,75 a 1,0 ml standardního roztoku apokarotenového esteru (4.1.2). Zřeďte petroletherem (4.2) doplněním ke značce a promíchejte.

Přibližné koncentrace roztoků se pohybují od 0 do 2 μg/ml a přesně se vypočítají ve vztahu ke koncentraci standardního roztoku (4.1.2) (W × P)/10 mg/ml. Změřte absorbanci při 440 nm vztaženou k petroletheru (4.2) jako referenční hodnotě.

Hodnoty absorbance vyneste do grafu na osu pořadnic („y“) a koncentrace apokarotenového esteru na osu úseček („x“). Vypočítejte rovnici standardní křivky.

6.   VÝPOČET VÝSLEDKŮ

6.1   Obsah apokarotenového esteru vyjádřený v mg/kg produktu je dán:

u zahuštěného másla výrazem: (C × V)/M

u másla výrazem: 0,82 (C × V)M

kde:

C	=	obsah apokarotenového esteru v μg/ml odečtený z kalibračního grafu (5.3)
V	=	objem zkušebního roztoku v ml (5.2)
M	=	hmotnost dílčího zkušebního vzorku v g (5.2)
0,82	=	opravný koeficient pro obsah máselného tuku v másle

7.   PŘESNOST METODY

7.1   Opakovatelnost

7.1.1   Analýza másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 1,4 mg/kg.

7.1.2   Analýza zahuštěného másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 1,6 mg/kg.

7.2   Reprodukovatelnost

7.2.1   Analýza másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 4,7 mg/kg.

7.3.   Analýza zahuštěného másla

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 5,3 mg/kg.

7.4.   Zdroj údajů o shodnosti

Údaje o shodnosti byly získány na základě pokusu z roku 1995, kterého se zúčastnilo jedenáct laboratoří a ve kterém bylo v případě másla použito dvanáct vzorků obsahujících stopovací látku (šest slepých duplikátů) a v případě zahuštěného másla dvanáct vzorků obsahujících stopovací látku (šest slepých duplikátů).

8.   MEZE TOLERANCE

8.1   Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

8.2   Máslo

8.2.1   S přihlédnutím k absorbanci pozadí se stopovací látka přidává do másla v poměru 22 mg/kg.

8.2.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	17,7 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky),

—	12,2 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 17,7 mg/kg a 12,2 mg/kg.

8.3   Zahuštěné máslo

8.3.1   S přihlédnutím k absorbanci pozadí se stopovací látka přidává do zahuštěného másla v poměru 24 mg/kg.

Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	19,2 mg/kg (95 % minimálního dávkování přidané látky),

—	13,2 mg/kg (70 % minimálního dávkování přidané látky).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 19,2 mg/kg a 13,2 mg/kg.

PŘÍLOHA VIII

(Článek 5)

STANOVENÍ OBSAHU SITOSTEROLU NEBO STIGMASTEROLU V MÁSLE NEBO ZAHUŠTĚNÉM MÁSLE PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ V KAPILÁRNÍ KOLONĚ

1.   PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup pro kvantitativní stanovení sitosterolu nebo stigmasterolu v másle nebo zahuštěném másle. Sitosterol je považován za látku složenou zejména z β-sitosterolu a 22-dihydro-β-sitosterolu, zatímco ostatní sitosteroly jsou považovány za bezvýznamné.

2.   PODSTATA METODY

Máslo nebo zahuštěné máslo se zmýdelní hydroxidem draselným v ethanolovém roztoku a nezmýdelnitelný podíl se extrahuje diethyletherem.

Steroly se přemění na trimethylsilylethery a analyzují se plynovou chromatografií v kapilární koloně za použití betulinu jako vnitřního standardu.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1   Saponifikační baňka na 150 ml opatřená zpětným chladičem se zabroušenými spoji

3.2   Dělicí nálevky na 500 ml

3.3   Baňky na 250 ml

3.4   Nálevky o objemu přibližně 250 ml s vyrovnáváním tlaku pro zachycování odpadního diethyletheru

3.5   Skleněná kolona, 350 mm × 20 mm, opatřená zátkou se skleněným sintrem

3.6   Vodní lázeň nebo izotermní plášť

3.7   Reakční nádobky na 2 ml

Plynový chromatograf, který lze používat s kapilární kolonou, opatřený dělicím systémem, který tvoří:

3.8.1   termostatická komora pro kolony schopná udržovat požadovanou teplotu s přesností ±1 °C

3.8.2   nástřikový systém s nastavitelnou teplotou

3.8.3   plamenově ionizační detektor a převodník/zesilovač

3.8.4   integrátor/zapisovač, který lze použít s převodníkem/zesilovačem (3.8.3)

3.9   Kapilární kolona z křemenného skla zcela potažená BP1 nebo rovnocenným materiálem (nebo jiná kolona alespoň stejného rozkladu) ve stejnoměrné tloušťce 0,25 μm; kolona musí být schopna rozložit trimethylsilylderiváty lanosterolu a sitosterolu. Vhodná je kolona o délce 12 m a vnitřním průměru 0,2 mm.

3.10   Injekční mikrostříkačka pro plynovou chromatografii o objemu 1 μl s tvrzenou jehlou

4.   CHEMIKÁLIE

Používají se pouze chemikálie čistoty p.a. Použitá voda musí být voda destilovaná nebo voda nejméně rovnocenné čistoty.

4.1   Ethanol o čistotě nejméně 95 %

4.2   Hydroxid draselný, 60 % roztok. Rozpusťte 600 g hydroxidu draselného (nejméně 85 %) ve vodě a doplňte vodou do 1 litru.

Betulin o čistotě nejméně 99 %

Roztoky betulinu v diethyletheru (4.4)

4.3.1.1   Koncentrace roztoku betulinu pro stanovení sitosterolu musí být 1,0 mg/ml.

4.3.1.2   Koncentrace roztoku betulinu pro stanovení stigmasterolu musí být 0,4 mg/ml.

4.4   Diethylether o čistotě p.a. (zbavený peroxidů s zbytků)

4.5   Síran sodný, bezvodý, granulovaný, předem sušený dvě hodiny při teplotě 102 °C

4.6   Silylační činidlo, např. TRI-SIL (dodávané firmou Pierce Chemical Co., katalogové číslo 49001) nebo rovnocenné. (Důležité: TRI-SIL je hořlavý, toxický, korozivní a pravděpodobně karcinogenní. Laboratorní personál musí být seznámen se zásadami bezpečnosti práce s TRI-SILem a přijmout nezbytná bezpečnostní opatření).

4.7   Lanosterol

Sitosterol o známé čistotě nejméně 90 % (P)

Poznámka 1: Čistota standardních materiálů používaných pro kalibraci musí být zjištěna standardizační metodou. Vychází se z předpokladu, že všechny steroly ve vzorku jsou znázorněny na chromatogramu, že celková plocha píků představuje 100 % sterolových složek a že steroly reagují na detektor stejně. Linearita systému musí být ověřena v celém dotčeném rozsahu koncentrací.

4.8.1   Standardní roztok sitosterolu – s přesností na 0,001 mg/ml připravte roztok obsahující přibližně 0,5 mg/ml (W1) sitosterolu (4.8) v diethyletheru (4.4).

Stigmasterol o známé čistotě nejméně 90 % (P)

4.9.1   Standardní roztok stigmasterolu – s přesností na 0,001 mg/ml připravte roztok obsahující přibližně 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolu (4.9) v diethyletheru (4.4).

4.10   Směs pro rozlišovací zkoušku. Připravte roztok obsahující 0,05 mg/ml lanosterolu (4.7) a 0,5 mg/ml sitosterolu (4.8) v diethyletheru (4.4).

5.   PRACOVNÍ POSTUP

5.1   Příprava standardních roztoků pro chromatografii

Roztok vnitřního standardu (4.3.1) musí být přidán současně do odpovídajícího standardního roztoku sterolu a do zmýdelněného vzorku (viz 5.2.2).

5.1.1   Standardní chromatografický roztok sistosterolu: Převeďte 1 ml standardního roztoku sitosterolu (4.8.1) do každé ze dvou reakčních nádobek (3.7) a proudem dusíku odstraňte diethylether. Přidejte 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.1) a proudem dusíku odstraňte diethylether.

5.1.2   Standardní chromatografický roztok stigmasterolu: Převeďte 1 ml standardního roztoku stigmasterolu (4.9.1) do každé ze dvou reakčních nádobek (3.7) a proudem dusíku odstraňte diethylether. Přidejte 1 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.2) a proudem dusíku odstraňte diethylether.

5.2   Příprava nezmýdelnitelného podílu

5.2.1   Vzorek másla roztavte při teplotě nepřesahující 35 °C; vzorek důkladně promíchejte mícháním.

S přesností na 1 mg navažte přibližně 1 g másla (W2) nebo zahuštěného másla (W2) do baňky na 150 ml (3.1). Přidejte 50 ml ethanolu (4.1) a 10 ml roztoku hydroxidu draselného (4.2). Nasaďte zpětný chladič a obsah zahřívejte asi na 75 °C po dobu 30 minut. Sejměte chladič a ochlaďte baňku přibližně na laboratorní teplotu.

5.2.2   Přidejte do baňky 1,0 ml roztoku vnitřního standardu (4.3.1.1, má-li být stanoven sitosterol, a 4.3.1.2, má-li být stanoven stigmasterol). Důkladně promíchejte. Obsah baňky kvantitativně převeďte do dělicí nálevky na 500 ml (3.2). Baňku postupně vypláchněte 50 ml vody a 250 ml diethyletheru (4.4). Obsah dělicí nálevky důkladně protřepávejte po dobu 2 minut a počkejte, dokud se neoddělí jednotlivé fáze. Spodní vodnou vrstvu vypusťte a etherovou vrstvu čtyřikrát po sobě promyjte alikvotními, 100 ml díly vody.

Poznámka 2: Má-li se zabránit tvorbě emulze, je nezbytně nutné provést první dvě promytí vodou jemně (deset převrácení nálevky). Třetí promytí lze provést důkladným protřepáváním po dobu 30 vteřin. Pokud se vytvoří emulze, je možné ji rozpustit přidáním 5–10 ml ethanolu. V případě, že se ethanol přidá, je nutné provést další dvě důkladná promytí vodou.

5.2.3   Čirou, mýdla zbavenou etherovou vrstvu nechte projít přes skleněnou kolonu (3.5) naplněnou 30 g bezvodého síranu sodného (4.5). Ether odeberte do baňky na 250 ml (3.3). Přidejte jeden varný kamínek a obsah nechte odpařit téměř do sucha ve vodní lázni nebo v izotermním plášti. Dbejte přitom na to, abyste zachytili odpadní rozpouštědla.

Poznámka 3: Jestliže se extrakty vzorků odpařují do sucha při příliš vysoké teplotě, může dojít ke ztrátám na sterolu.

5.3   Příprava trimethylsilyletherů

5.3.1   Převeďte etherový roztok zbývající v baňce do reakční nádobky na 2 ml (3.7) se 2 ml diethyletheru a odstraňte ether proudem dusíku. Promyjte baňku dvěma dalšími 2 ml alikvotními dávkami diethyletheru s tím, že tekutinu pokaždé převedete do reakční nádobky a ether odstraníte proudem dusíku.

5.3.2   Proveďte silylaci vzorku přidáním 1 ml TRI-SILu (4.6). Uzavřete nádobku a důkladně ji protřepejte, aby se obsah rozpustil. Nerozpustí-li se úplně, zahřejte nádobku na 65–70 °C. Nechte ji nejméně 5 minut odstát a teprve poté její obsah nastříknete do plynového chromatografu. Silylaci standardů proveďte stejným způsobem jako silylaci vzorků. Silylaci směsi pro rozlišovací zkoušku (4.10) proveďte stejným způsobem jako silylaci vzorků.

Poznámka 4: Silylace musí být provedena v bezvodém prostředí. Neúplná silylace betulinu je indikována druhým píkem v blízkosti píku betulinu.

Pokud je během silylace přítomen ethanol, pak tuto sylilaci ruší. Ethanol může být přítomen v důsledku nedostatečného promývání ve fázi extrakce. Pokud tento problém přetrvává, může být během fáze extrakce provedeno páté promytí s důkladným protřepáváním po dobu 30 vteřin.

5.4   Analýza plynovou chromatografií

5.4.1   Volba provozních podmínek

Připravte plynový chromatograf podle návodu výrobce.

Směrné provozní podmínky jsou tyto:

—	teplota kolony: 265 °C

—	teplota nástřikového zařízení: 265 °C

—	teplota detektoru: 300 °C

—	průtok nosného plynu: 0,6 ml/min

—	tlak vodíku: 84 kPa

—	tlak vzduchu: 155 kPa

—	rozdělení nástřiku: 10:1 až 50:1; poměr rozdělení musí být optimalizován podle návodu výrobce a linearity odezvy detektoru a poté ověřen v rozmezí dotčených koncentrací. Poznámka 5: Je nesmírně důležité pravidelně čistit vložku do nástřikového prostoru (tzv. liner).

—	množství nastříknuté látky: 1 μl roztoku TMSE.

Počkejte, dokud systém nedosáhne rovnováhy, a teprve po dostatečně stabilní reakci zahajte analýzu.

Tyto podmínky je třeba měnit podle charakteristických vlastností kolony a plynového chromatografu tak, aby získané chromatogramy splňovaly tyto požadavky:

—	pík sitosterolu musí být dostatečně odlišen od píku lanosterolu. Obrázek 1 znázorňuje typický chromatogram, který je třeba získat ze silylované směsi pro rozlišovací zkoušku (4.10),

—	relativní retenční časy následujících sterolů se musí blížit těmto hodnotám: — cholesterol: 1,0 — stigmasterol: 1,3 — sitosterol: 1,5 — betulin: 2,5,

—	retenční čas betulinu musí být přibližně 24 minut.

5.4.2   Analytický postup

Nastříkněte 1 μl roztoku silylovaného standardu (stigmasterolu nebo sitosterolu) a upravte kalibrační parametry integrátoru.

Nastříkněte další 1 μl roztoku silylovaného standardu, aby bylo možné stanovit odezvové faktory ve vztahu k betulinu.

Nastříkněte 1 μl roztoku silylovaného vzorku a změřte plochy píků. Nástřik standardů musí být proveden před každým chromatografickým cyklem a po každém takovém cyklu.

Za normálních okolností by měl každý takto ohraničený cyklus zahrnovat šest nástřiků vzorku.

Poznámka 6: Do integrace píku stigmasterolu je třeba zahrnout chvosty uvedené v bodech 1, 2 a 3 na obrázku 2b.

Integrace píku sitosterolu by měla zahrnovat plochu píku 22-dihydro-β-sitosterolu (stigmastanolu), který se vymývá okamžitě po sitosterolu (viz obrázek 3b) při vyhodnocování celkového sitosterolu.

6.   VÝPOČET VÝSLEDKŮ

6.1   Stanoví se plocha píků sterolu a píků betulinu v obou standardech na začátku a na konci každého pokusu a vypočte se R1:

R1 = (průměrná plocha píku sterolu ve standardu)/(průměrná plocha píku betulinu ve standardu)

Stanoví se plocha píku sterolu (stigmasterolu a sitosterolu) a píku betulinu ve vzorku a vypočte seR2:

R2 = (plocha píku sterolu ve vzorku)/(plocha píku betulinu ve vzorku)

W1	=	obsah sterolu ve standardu (mg), obsažený v 1 ml standardního roztoku (4.8.1 nebo 4.9.1)
W2	=	hmotnost vzorku (g) (5.2.1)
P	=	čistota standardního sterolu (4.8 nebo 4.9)

Obsah sterolu ve vzorku (mg/kg) = ((R 2)/(R 1)) × ((W 1)/(W 2)) × P × 10

7.   PŘESNOST METODY

7.1   Máslo

7.1.1   Opakovatelnost

7.1.1.1   Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 19,3 mg/kg.

7.1.1.2   Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 23,0 mg/kg.

7.1.2   Reprodukovatelnost

7.1.2.1   Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 31,9 mg/kg.

7.1.2.2   Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 8,7 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.

7.1.3   Zdroj údajů o shodnosti

Údaje o shodnosti byly získány na základě pokusu z roku 1992, kterého se zúčastnilo osm laboratoří a ve kterém bylo v případě stigmasterolu použito šest vzorků (tří slepých duplikátů) a v případě sitosterolu šest vzorků (tří slepých duplikátů).

7.2   Zahuštěné máslo

7.2.1   Opakovatelnost

7.2.1.1   Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 10,2 mg/kg.

7.2.1.2   Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedl v co nejkratším časovém odstupu jeden pracovník na stejném přístroji, by neměl překročit 3,6 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.

7.2.2   Reprodukovatelnost

7.2.2.1   Stigmasterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 25,3 mg/kg.

7.2.2.2   Sitosterol

Rozdíl mezi výsledky dvou stanovení, která u stejného zkušebního materiálu provedli pracovníci v různých laboratořích na různých přístrojích, by neměl překročit 8,9 %, vztaženo ke střední hodnotě stanovení.

7.2.3   Zdroj údajů o shodnosti

Údaje o shodnosti byly získány na základě pokusu z roku 1991, kterého se zúčastnilo devět laboratoří a ve kterém bylo v případě stigmasterolu použito šest vzorků (tří slepých duplikátů) a v případě sitosterolu šest vzorků (tří slepých duplikátů).

8.   MEZE TOLERANCE

8.1   Z produktu obsahujícího stopovací látku musí být odebrány tři vzorky pro ověření, zda zavedení této látky do produktu bylo provedeno správně.

8.2   Máslo

8.2.1   Stigmasterol

8.2.1.1   Dávkování stigmasterolu je 150 g stigmasterolu o čistotě nejméně 95 % na tunu másla, tj. 142,5 mg/kg, nebo 170 g stigmasterolu o čistotě nejméně 85 % na tunu másla, tj. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	115,8 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %),

—	117,7 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %),

—	80,1 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %),

—	81,5 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 115,8 mg/kg a 80,1 mg/kg nebo 117,7 mg/kg a 81,5 mg/kg.

8.2.2   Sitosterol

8.2.2.1   Dávkování sitosterolu je 600 g sitosterolu o čistotě nejméně 90 % na tunu másla, tj. 540 mg/kg.

8.2.2.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	482,6 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %),

—	347,6 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 482,6 mg/kg a 347,6 mg/kg.

8.3   Zahuštěné máslo

8.3.1   Stigmasterol

8.3.1.1   Dávkování stigmasterolu je 150 g stigmasterolu o čistotě nejméně 95 % na tunu zahuštěného másla, tj. 142,5 mg/kg, nebo 170 g stigmasterolu o čistotě nejméně 85 % na tunu zahuštěného másla, tj. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	118,5 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %),

—	120,4 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %),

—	82,9 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 95 %),

—	84,3 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 85 %).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 118,5 mg/kg a 82,9 mg/kg nebo 120,4 mg/kg a 84,3 mg/kg.

8.3.2.   Sitosterol

8.3.2.1   Dávkování sitosterolu je 600 g sitosterolu o čistotě nejméně 90 % na tunu zahuštěného másla, tj. 540 mg/kg.

8.3.2.2   Výsledky analýzy tří vzorků odebraných z daného produktu se použijí pro ověření dávkování a homogenity přidané stopovací látky a výsledek s nejnižší hodnotou se porovná s následujícími mezními hodnotami:

—	480,9 mg/kg (95 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %),

—	345,9 mg/kg (70 % minimálního dávkování stigmasterolu o čistotě 90 %).

Koncentrace stopovací látky ve vzorku s výsledkem o nejnižší hodnotě se použije interpolací mezi 480,9 mg/kg a 345,9 mg/kg.

Obrázek 1

Chromatogram směsi pro rozlišovaci zkoušku

Vhodnějši je úplné rozlišení, tj. zápis píku lanosterolu se musí vrátit na základní linii dříve než začne růst pík sitosrerolu. Neúplné rozlišení se však toleruje.

Obrázek 2a	Obrázek 2b
Standard stigmasterolu	Vzorek másla denaturovaného stigmasterolem
Poznámka: Integrace píku.stigmasterolu musi zahrnout všechny chvosty uvedené v bodech 1, 2 a 3.

Obrázek 3a	Obrázek 3a
Standard β-sitosterolu	Vzorek másla denaturovaného β-sitosterolem
Poznámka: β-sitosterol často obsahuje nečistotu (identifikovanou jako stigmastanol), která se vymývá okamžitě po β-sitosterolu. Plochy těchto dvou píků musí být při vyhodnocování celkového přítomného β-sitosterolu sečteny.

PŘÍLOHA IX

(Článek 6)

REFERENČNÍ METODA PRO ZJIŠŤOVÁNÍ KRAVSKÉHO MLÉKA A KASEINÁTŮ V SÝRECH Z OVČÍHO MLÉKA, KOZÍHO MLÉKA NEBO BUVOLÍHO MLÉKA, NEBO SMĚSÍ OVČÍHO, KOZÍHO A BUVOLÍHO MLÉKA

1.   PŘEDMĚT

Zjišťování kravského mléka a kaseinátů v sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka anebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka izoelektrickou fokusací γ-kaseinů po plasminolýze.

2.   OBLAST POUŽITÍ

Metoda je vhodná pro citlivé a specifické zjišťování mléka a kaseinátu, též tepelně ošetřených, v čerstvých a zralých sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka. Není vhodná k odhalení falšování mléka a sýrů tepelně ošetřenými bílkovinnými koncentráty z hovězí syrovátky.

3.   PODSTATA METODY

3.1   Izolace kaseinů ze sýra a referenčních standardů

3.2   Rozpuštění izolovaných kaseinů a proteolýza plasminem (EC.3.4.21.7)

3.3   Izoelektrická fokusace plasminem ošetřených kaseinů za přítomnosti močoviny a vybarvení bílkovin

3.4   Vyhodnocení vybarvených obrazců kaseinu γ3 a γ2 (důkaz přítomnosti kravského mléka) na základě porovnání obrazce získaného ze vzorku s obrazci získanými u téhož gelu z referenčních standardů obsahujících 0 % a 1 % kravského mléka

4.   CHEMIKÁLIE

Není-li stanoveno jinak, používají se pouze chemikálie čistoty p.a. Voda musí být redestilovaná nebo rovnocenné čistoty.

Poznámka: Následující údaje se vztahují na laboratorně připravované polyakrylamidové gely s obsahem močoviny o rozměrech 265 × 125 × 0,25 mm. Pokud se použijí jiné rozměry nebo druhy gelu, může být nutné upravit podmínky separace.

Isoelektrická fokusace

4.1   Chemikálie pro přípravu polyakrylamidových gelů s obsahem močoviny

4.1.1   Zásobní roztok gelu

Ve vodě rozpusťte:

4,85g akrylamidu

0,15g N, N'-methylen-bis-akrylamidu (BIS)

48,05g močoviny

15,00g glycerolu (87 % hm.),

doplňte na 100 ml a uložte do chladničky v hnědé skleněné lahvi.

Poznámka: Místo uvedených množství neurotoxického akrylamidu lze použít komerčně dostupný, předem namíchaný roztok akrylamidu a BIS. V případě, že koncentrace komerčního roztoku je 30 % hm./obj. akrylamidu a 0,8 % hm./obj. BIS, pak uvedená množství (4,85g akrylamidu a 0,15g BIS) musí být nahrazena komerčním roztokem o objemu 16,2 ml. Zásobní roztok lze skladovat nejdéle 10 dnů. Pokud je jeho vodivost vyšší než 5 μS, je nutné provést jeho deionizaci promícháváním s 2g Amberlitu MB-3 po dobu 30 minut a poté jej přefiltrovat přes 0,45μm membránu.

4.1.2   Roztok gelu

Připravte roztok gelu smícháním přísad a amfolytů se zásobním roztokem gelu (viz 4.1.1).

9,0 ml zásobního roztoku

24 mg β-alaninu

500 μl amfolytu pH 3,5–9,5 (1)

250 μl amfolytu pH 5–7 (1)

250 μl amfolytu pH 6–8 (1).

Gelový roztok promíchejte a odplyňujte po dobu dvou až tří minut v ultrazvukové lázni nebo ve vakuu.

Poznámka: Gelový roztok připravte bezprostředně před jeho naléváním (viz 6.2).

4.1.3   Roztoky katalyzátorů

4.1.3.1   N, N, N’, N’-tetramethylendiamin (Temed)

4.1.3.2   40 % hm./obj. roztoku persíranu amonného (PER)

800 mg PER rozpusťte ve vodě a doplňte na 2 ml.

Poznámka: Vždy používejte čerstvě připravený roztok PER.

4.2   Kontaktní tekutina

Kerosin nebo kapalný parafin

4.3   Anodový roztok

Rozpusťte 5,77g kyseliny fosforečné (85 % hm.) ve vodě a zřeďte na 100 ml.

4.4   Katodový roztok

Rozpusťte 2,00g hydroxidu sodného ve vodě a zřeďte vodou na 100 ml.

Příprava vzorku

4.5   Chemikálie určené k izolaci bílkovin

4.5.1   Zředěná kyselina octová (25,0 ml ledové kyseliny octové doplněné vodou do 100 ml)

4.5.2   Dichlormethan

4.5.3   Aceton

4.6   Tlumivý roztok pro rozpuštění bílkovin

Ve vodě rozpusťte:

5,75g glycerolu (87 % hm.)

24,03g močoviny

250 mg dithiothreitolu

a doplňte na 50 ml vodou.

Poznámka: Skladujte v chladničce; maximální doba uskladnění je jeden týden.

4.7   Chemikálie určené k plasminovému štěpení kaseinů

4.7.1   Tlumivý roztok uhličitanu amonnného

Titrujte molární roztok hydrogenuhličitanu amonného 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml vody) obsahující 0,05 mol/l kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA, 1,46 g/100 ml) roztokem uhličitanu amonného (1,92 g/100 ml vody) obsahujícího 0,05 mol/l EDTA na pH 8.

4.7.2   Hovězí plasmin (EC. 3.4.21.7), s aktivitou nejméně 5 U/ml.

4.7.3   Roztok kyseliny ε-aminokapronové určené k inhibici enzymu

Rozpusťte 2,624g kyseliny ε-aminokapronové (6-amino-n-hexankyseliny) ve 100 ml 40 % obj. ethanolu.

4.8   Referenční standardy

4.8.1   Certifikované referenční standardy směsi ovčího a kozího odstředěného mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mléka lze získat od Ústavu pro referenční materiály a měření působícího při Komisi, B-2440, Geel, Belgie.

4.8.2   Příprava laboratorních prozatímních standardů buvolího mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mléka

Odstředěné mléko se připraví odstředěním syrového buvolího nebo kravského mléka při teplotě 37 °C (2 500g, 20 minut). Po rychlém ochlazení zkumavky a jejího obsahu na 6 až 8 °C se úplně odstraní horní tuková vrstva. Pro přípravu 1 % standardu přidejte 5,00 ml odstředěného kravského mléka do 495 ml odstředěného buvolího mléka v kádince o obsahu 1 l. Hodnotu pH upravte na 6,4 přídavkem zředěné kyseliny mléčné (10 %, hm./obj.). Teplotu upravte na 35 °C, přidejte 100 μl telecího syřidla (aktivita syřidla 1:10 000, cca 3 000 U/ml) a míchejte po dobu 1 minuty. Poté kádinku zakryjte hliníkovou fólií a nechte hodinu stát při teplotě 35 °C k utvoření sýřeniny. Po utvoření sýřeniny se veškeré mléko vysrážené pomocí syřidla lyofilizuje, aniž by předtím byla provedena homogenizace nebo odebrání syrovátky. Lyofilizované mléko se jemně rozemele na homogenní prášek. K přípravě referenčního standardu 0 % použijte stejný postup u čistého odstředěného buvolího mléka. Referenční standardy musí být skladovány při teplotě –20 °C.

Poznámka: Před přípravou referenčních standardů se doporučuje zkontrolovat čistotu buvolího mléka izoelektrickou fokusací kaseinů vystavených působení plasminu.

Chemikálie určené k barvení bílkovin

4.9   Fixativ

Rozpusťte 150g kyseliny trichloroctové ve vodě a doplňte na 1 000 ml.

4.10   Odbarvovací roztok

Zřeďte 500 ml methanolu a 200 ml ledové kyseliny octové destilovanou vodou na 2 000 ml.

Poznámka: Odbarvovací roztok připravte každý den čerstvý; lze jej připravit smícháním stejných objemů zásobního roztoku 50 % obj. methanolu a zásobního roztoku 20 % obj. ledové kyseliny octové.

4.11   Barvicí roztoky

4.11.1   Barvicí roztok (zásobní roztok 1)

V 1 000 ml 90 % obj. methanolu rozpusťte pomocí magnetické míchačky (asi 45 minut) 3,0g brilantní modři Coomassie G-250 (C. I. 42655) a roztok přefiltrujte přes dva středně husté skládané filtry.

4.11.2   Barvicí roztok (zásobní roztok 2)

V 1 000 ml 20 % obj. kyseliny octové rozpusťte 5,0g síranu měďnatého, pentahydrátu.

4.11.3   Barvicí roztok (pracovní roztok)

Bezprostředně před barvením smíchejte 125 ml obou zásobních roztoků (4.11.1 a 4.11.2).

Poznámka: Barvicí roztok je třeba použít v den přípravy.

5.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

5.1   Skleněné desky (265 × 125 × 4 mm), pryžový váleček (o šířce 15 cm), nivelační stolek

5.2   Nosná fólie gelu (265 × 125 mm)

5.3   Krycí fólie (280 × 125 mm). Na každý dlouhý okraj nalepte pruh lepicí pásky (280 × 6 × 0,25 mm) (viz obrázek 1).

5.4   Elektrofokusační komora s chladicí deskou (např. 265 × 125 mm) a vhodný napájecí zdroj (≥ 2,5 kV) nebo automatické elektroforetické zařízení

5.5   Cirkulační kryostat s regulací teploty ve výši 12 ±0,5 °C

5.6   Odstředivka nastavitelná na 3 000g

5.7   Elektrodové proužky (o délce ≥ 265 mm)

5.8   Plastové kapací nádobky na anodový a katodový roztok

5.9   Aplikátory vzorku (10 × 5 mm, z viskózy nebo filtračního papíru s nízkou adsorpcí bílkovin)

5.10   Nůžky, skalpely a pinzety z nerezové oceli

5.11   Odbarvovací a barvicí misky (např. misky na nástroje 280 × 150 mm) z nerezové oceli nebo skleněné

5.12   Nastavitelný tyčový homogenizátor s průměrem tyče 10 mm a rychlostí 8 000 až 20 000 ot/min

5.13   Magnetická míchačka

5.14   Ultrazvuková lázeň

5.15   Svářečka fólií

5.16   Mikropipety na 25 μl

5.17   Vakuová odstředivka nebo lyofilizátor

5.18   Termostatem řízená vodní lázeň, nastavitelná na 35 a 40 ± 1 °C s třepačkou

5.19   Densitometrické zařízení umožňující měření na vlnové délce λ = 634 nm

6.   PRACOVNÍ POSTUP

6.1   Příprava vzorku

6.1.1   Izolace kaseinů

Do odstředivkové kyvety na 100 ml navažte množství sýra nebo referenčního standardu odpovídající 5g sušiny, přidejte 60 ml destilované vody a obsah homogenizujte tyčovým homogenizátorem (8 000 až 10 000 ot/min). Upravte pH na 4,6 zředěnou kyselinou octovou (4.5.1) a odstřeďujte (5 minut, 3 000g). Dekantujte tuk a syrovátku a zbytek homogenizujte při 20 000 ot/min se 40 ml destilované vody s hodnotou pH upravenou na 4,5 zředěnou kyselinou octovou (4.5.1). Přidejte 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a znovu homogenizujte a odstřeďuje (5 minut, 3 000g). Špachtlí vyjměte kaseinovou vrstvu, která se nachází mezi vodnou a organickou fází (viz obrázek 2), a obě fáze dekantujte. Kasein znovu homogenizujte se 40 ml destilované vody (viz výše) a 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a odstřeďte. Tento postup opakujte, dokud obě extrakční fáze nejsou bezbarvé (dvakrát až třikrát). Bílkovinný zbytek homogenizujte s 50 ml acetonu (4.5.3) a přefiltrujte přes středně hustý skládaný papírový filtr. Zbytek promyjte dvěma samostatnými 25ml dávkami acetonu a nechte vysušit na vzduchu nebo v proudu dusíku. Potom jemně rozmělněte v třecí misce.

Poznámka: Suché bílkovinné extrakty se musí uchovávat při teplotě –20 °C.

6.1.2   Přeměna β-kaseinů na γ-kaseiny působením plasminu

Rozptylte 25 mg izolovaných kaseinů (6.1.1) v 0,5 ml tlumivého roztoku uhličitanu amonného (4.7.1) a směs 20 minut homogenizujte, např. ultrazvukem. Směs zahřejte na 40 °C a přidejte 10 μl plasminu (4.7.2), promíchejte a inkubujte 1 hodinu při teplotě 40 °C za stálého třepání. Pro inhibici enzymu přidejte 20 μl roztoku kyseliny ε-aminokapronové (4.7.3). Poté přidejte 200 mg pevné močoviny a 2 mg dithiothreitolu.

Poznámka: Pro získání lepší symetrie fokusovaných kaseinových pásů se doporučuje po přidání kyseliny ε-aminokapronové roztok lyofilizovat a poté zbytky rozpustit v 0,5 ml tlumivého roztoku pro rozpouštění bílkovin (4.6).

6.2   Příprava polyakrylamidových gelů s obsahem močoviny

Na skleněnou desku (5.1) válečkem naneste nosnou fólii gelu (5.2) s pomocí několika kapek vody a přebytečnou vodu odsajte papírovým ubrouskem nebo kapesníčkem. Stejným způsobem válečkem naneste druhou, krycí fólii (5.3) s distančními vložkami (0,25 mm) na jinou skleněnou desku. Tuto druhou desku uložte vodorovně na nivelační stolek.

K připravenému odplyněnému roztoku gelu (4.1.2) přidejte 10 μl Temedu (4.1.3.1), protřepejte a přidejte 10 μl roztoku PER (4.1.3.2); důkladně promíchejte a okamžitě nalijte rovnoměrně na střed krycí fólie. Jeden okraj nosné desky gelu (stranou s fólií směrem dolů) přiložte k desce s krycí fólií a pomalu pokládejte tak, aby se mezi fóliemi vytvořila pravidelně rozprostřená tenká vrstva gelu bez bublin (obrázek 3). Pomocí tenké špachtle nosnou desku gelu opatrně přitiskněte po celé délce a položte na ni tři další skleněné desky, aby ji zatížily. Po skončení polymerace (asi po 60 minutách) spolu s krycí fólií sejměte gel zpolymerovaný na nosné fólii gelu tak, že skleněné desky nakloníte. Zadní stranu nosné fólie pečlivě očistěte, aby se odstranily zbytky gelu a močoviny. „Gelový sendvič“ zavařte do tenké fólie a uložte do chladničky (nejdéle na šest týdnů).

Poznámka: Krycí fólii s distančními vložkami lze použít znovu. Polyakrylamidový gel může být rozřezán na menší části; je to vhodné v případě omezeného počtu vzorků nebo v případě použití automatického elektroforetického zařízení (dva gely o rozměrech 4,5 × 5 cm).

6.3   Izoelektrická fokusace

Nastavte kryostat na 12 °C. Zadní stranu nosné fólie gelu otřete kerosinem a poté na střed chladicího bloku kápněte několik kapek kerosinu (4.2). Opatrně přiložte „gelový sendvič“ nosnou fólií obrácený dolů, aby se vytlačily všechny vzduchové bubliny. Přebytečný kerosin otřete a sejměte krycí fólii. Elektrodové proužky napusťte elektrodovými roztoky (4.3, 4.4), seřízněte na délku gelu a uložte na místo (vzdálenost elektrod 9,5 cm).

Podmínky izoelektrické fokusace

6.3.1   Rozměry gelu 265 × 125 × 0,25 mm

Fáze	Doba (min)	Napětí (V)	Proud (mA)	Příkon (W)	Volty/hodiny (Vh)
1. Předběžná fokusace	30	max. 2 500	max. 15	konstantní 4	cca 300
2. Fokusace vzorku (2)	60	max. 2 500	max. 15	konstantní 4	cca 1 000
3. Konečná fokusace	60	max. 2 500	max. 5	maximální 20	cca 3 000
	40	max. 2 500	max. 6	maximální 20	cca 3 000
	30	max. 2 500	max. 7	maximální 25	cca 3 000

Poznámka: Jestliže se změní tloušťka nebo šířka gelů, hodnoty proudu a příkonu musí být odpovídajícím způsobem upraveny (např. hodnoty proudu a příkonu se zdvojnásobí, použije-li se gel o rozměrech 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2   Příklad programování napětí u automatického elektroforetického zařízení (2 gely 5,0 × 4,5 cm, elektrody bez proužků se přikládají přímo na gel.

Fáze	Napětí	Proud	Příkon	Teplota	Volty/hodiny
1. Předběžná fokusace	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
2. Fokusace vzorku	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
3. Fokusace	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
4. Fokusace	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

Aplikátor vzorku ve fázi 2 vložte při 0 Vh.

Aplikátor vzorku ve fázi 2 odstraňte při 30 Vh.

6.4   Barvení bílkovin

6.4.1   Fixace bílkovin

Okamžitě po vypnutí napájení odstraňte elektrodové proužky a gel ihned vložte do barvicí/ odbarvovací misky naplněné 200 ml fixatéru (4.9). Gel v ní ponechte 15 minut za stálého třepání.

6.4.2   Praní a barvení gelové desky

Fixatér beze zbytku dekantujte a gelovou desku dvakrát promývejte po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10). Odbarvovací roztok dekantujte, misku naplňte 250 ml barvicího roztoku (4.11.3) a gel nechte za mírného třepání po dobu 45 minut zbarvovat.

6.4.3   Odbarvení gelové desky

Barvicí roztok dekantujte a gelovou desku dvakrát promývejte po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10). Poté 15 minut protřepávejte s 200 ml odbarvovacího roztoku; fázi odbarvování opakujte nejméně dvakrát až třikrát, dokud není pozadí čiré a bezbarvé. Gelovou desku potom promyjte destilovanou vodou (2 × 2 minuty) a nechte uschnout na vzduchu (2 až 3 hodiny) nebo usušte vysoušečem vlasů (10 až 15 minut).

Poznámka 1: Fixaci, promývání, barvení a odbarvování provádějte při teplotě 20 °C. Vyšší teploty nepoužívejte.

Poznámka 2: Pokud upřednostňujete citlivější obarvení stříbrem (např. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, kód č. 17–1150–01), musí být kaseinové vzorky ošetřené plasminem zředěny v poměru 5 mg/ml.

7.   HODNOCENÍ

Hodnocení se provádí porovnáním proteinových obrazců zkoumaného vzorku s obrazci referenčních standardů u stejného gelu. Zjišťování kravského mléka v sýrech vyrobených z ovčího mléka, kozího mléka, buvolího mléka nebo ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka se provádí prostřednictvím γ3- a γ2-kaseinů, jejichž izoelektrické body se nacházejí v rozmezí mezi pH 6,5 a pH 7,5 (obrázky 4a, b, obrázek 5). Detekční mez je nižší než 0,5 %.

7.1   Vizuální hodnocení

Pro vizuální hodnocení množství kravského mléka se doporučuje upravit koncentraci vzorků a referenčních standardů s cílem dosáhnout u hovězích, kozích a/nebo buvolích γ2- a γ3-kaseinů (viz „γ2 E, G, B“ a „γ3 E, G, B“ na obrázcích 4a, b a obrázku 5) stejné úrovně intenzity. Pouze za těchto podmínek lze přímo posoudit množství kravského mléka (menší nebo větší než 1 % nebo ve výši 1 %) v analyzovaném vzorku porovnáním intenzity hovězích γ3- a γ2-kaseinů (viz „γ3 C“ a „γ2 C“ na obrázcích 4a, b a obrázku 5) s intenzitami kaseinů v referenčních standardech s obsahy 0 % a 1 % (ovčích, kozích), nebo prozatímních laboratorních standardech (buvolích).

7.2   Denzitometrické hodnocení

Pokud je to možné, použijte pro stanovení poměru mezi plochami píků hovězích γ2- a γ3-kaseinů a plochami píků ovčích, kozích a/nebo buvolích γ2- a γ3-kaseinů (viz obrázek 5) denzitometrii (5.19). Tuto hodnotu porovnejte s poměrem ploch píků γ2- a γ3-kaseinů v 1 % referenčním standardu (ovčím, kozím) nebo prozatímním laboratorním standardu (buvolím) analyzovaných u téhož gelu.

Poznámka: Tato metoda funguje uspokojivě, pokud existuje jasný pozitivní signál obou hovězích γ2- a γ3-kaseinů v 1 % referenčním standardu, avšak nikoli v 0 % referenčním standardu. V opačném případě je nutné postup optimalizovat při přesném dodržení pokynů stanovených v dané metodě.

Vzorek je považován za pozitivní, jestliže hodnoty obou hovězích γ2- a γ3-kaseinů nebo příslušných poměrů ploch píků jsou stejné nebo větší než hodnoty odpovídající 1 % referenčnímu standardu.

8.   LITERATURA

1.	Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708–711 (1990).

2.	Addeo F., Nicolai M. A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83–85 (1995).

3.

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp. 389–393, Bode-Verlag, München (1989).

4.	Krause Ι., Belitz H.–D., Kaiser K.–P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195–199 (1982).

5.	Radola B. J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43–56 (1980).

Obrázek 1

Schematický výkres krycí fólie

Obrázek 2

Kaseinová vrstva plovoucí mezi vodnou a organickou fází po odstředění

Obrázek 3

Sklápěcí technika pro odlévání ultratenkých polyakrylamidových gelů

a = distanční páska (0,25 mm); b = krycí fólie (5.3); c, e = skleněné desky (5.1); d = gelový roztok (4.1.2); f = nosná fólie gelu (5.2)

Obrázek 4

Izoelektrická fokusace kaseinů ze sýrů z ovčího a kozího mléka, ošetřených plasminem, s různým obsahem kravského mléka

% CM = procento kravského mléka, C = kravské, E = ovčí, G = kozí

Na obrázku je znázorněna horní polovina gelu IEF.

Obrázek 4b

Izoelektrická fokusace kaseinů ze sýrů vyrobených ze směsí ovčího, kozího a buvolího mléka, ošetřených plasminem, s různým obsahem kravského mléka

% CM = procento kravského mléka; 1+ = vzorek s obsahem 1 % kravského mléka a s přídavkem čistého hovězího kaseinu ve středu dráhy. C = kravské, E = ovčí, G = kozí, B = buvolí

Na obrázku je znázorněna celá separační vzdálenost gelu IEF.

Obrázek 5

Superpozice denzitogramů referenčních standardů (STD) a vzorků sýra vyrobeného ze směsi ovčího a kozího mléka, po izoelektrické fokusaci

a, b = referenční standardy obsahující 0 a 1 % kravského mléka; c–g = vzorky sýra obsahujícího 0, 1, 2, 3 a 7 % kravského mléka. C = kravské, E = ovčí, G = kozí.

Byla snímána horní polovina gelu IEF při λ = 634 nm.

---

(1)  Jako zvláště vhodné pro dosažení žádoucího rozdělení γ-kaseinů se ukázaly výrobky Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) a Resolyte® pH 5–7 a pH 6–8 (BDH, Merck).

(2)  Použití vzorku: Po předběžné fokusaci (krok 1) pipetou odměřte 18 µl vzorku a standardních roztoků do aplikátorů vzorku (10 × 5 mm), vložte na gel ve vzdálenosti 1 mm od sebe a 5 mm podélně od anody a jemně přitlačte. Fokusaci proveďte za výše uvedených podmínek a aplikátory vzorku opatrně vyjměte po 60 minutách fokusace vzorku.