2003/126/ESSMĚRNICE KOMISE 2003/126/ES ze dne 23. prosince 2003, kterou se stanoví analytická metoda identifikace složek živočišného původu pro úřední kontrolu krmiv (Text s významem pro EHP)

Směrnice Komise 2003/126/ES

ze dne 23. prosince 2003,

kterou se stanoví analytická metoda identifikace složek živočišného původu pro úřední kontrolu krmiv

(Text s významem pro EHP)

KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,

s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,

s ohledem na směrnici Rady 70/373/EHS ze dne 20. července 1970 o zavedení metod odběru vzorků a analytických metod Společenství pro úřední kontrolu krmiv [1], a zejména na článek 2 uvedené směrnice,

vzhledem k těmto důvodům:

(1) Úřední kontroly krmiv za účelem ověření souladu s požadavky právních a správních přepisů upravujících jakost a složení krmiv se podle směrnice 70/373/EHS provádějí podle metod odběru vzorků a analytických metod Společenství.

(2) Z předpisů o označování krmiv a z požadavků zakazujících používání některých druhů živočišných bílkovin v krmivech pro určité kategorie zvířat vyplývá potřeba stanovit spolehlivé analytické metody pro zjištění přítomnosti těchto látek a popřípadě procentuálního vyjádření jejich obsahu.

(3) Metoda popsaná ve směrnici Komise 98/88/ES ze dne 13. listopadu 1998, kterou se stanoví obecné zásady pro mikroskopickou identifikaci a hodnocení složek živočišného původu pro úřední kontrolu krmiv [2], je v současné době jedinou uznanou metodou kontroly přítomnosti živočišných bílkovin, včetně bílkovin ošetřených při teplotě 133 °C pod tlakem 3 barů po dobu 20 minut.

(4) Porovnávací studie ohledně identifikace zpracovaných živočišných bílkovin nedávno prokázala, že odchylky při provádění mikroskopických zkoušek uvedených ve směrnici 98/88/ES vedly k významným rozdílům v citlivosti, specificitě a přesnosti metody. Za účelem harmonizace a zdokonalení metod identifikace zpracovaných živočišných bílkovin by ustanovení o mikroskopické metodě měla být více upřesněna a učiněna závaznými. Je nezbytné zajistit, aby laboranti, kteří metodu používají, byli dostatečně vyškoleni, neboť kvalita výsledků závisí na jejich dovednostech.

(5) Směrnice 98/88/ES by se proto měla nahradit.

(6) Opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro potravinový řetězec a zdraví zvířat,

PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:

Článek 1

Členské státy zajistí, aby se při úřední analýze krmiv, která se provádí za účelem úřední kontroly přítomnosti, identifikace nebo odhadu množství složek živočišného původu v krmivech v rámci koordinovaného programu kontroly v oblasti výživy zvířat podle směrnice Rady 95/53/ES [3], postupovalo v souladu s přílohou této směrnice.

Článek 2

Členské státy zajistí, aby se laboratoře, které provádějí úřední kontroly přítomnosti složek živočišného původu v krmivech, pravidelně účastnily zkoušek odborné způsobilosti pro provádění analytických metod a aby laboratorní personál, který provádí analýzy, byl patřičně vyškolen.

Článek 3

Směrnice 98/88/ES se zrušuje.

Odkazy na zrušenou směrnici se považují za odkazy na tuto směrnici.

Článek 4

1. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 1. července 2004. Neprodleně sdělí Komisi znění těchto předpisů a srovnávací tabulku mezi ustanoveními této směrnice a přijatými vnitrostátními předpisy.

Tato opatření přijatá členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.

2. Členské státy sdělí Komisi znění vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice.

Článek 5

Tato směrnice vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropské unie.

Článek 6

Tato směrnice je určena členským státům.

V Bruselu dne 23. prosince 2003.

Za Komisi

David Bryne

člen Komise

[1] Úř. věst. L 170, 3.8.1970, s. 2. Směrnice naposledy pozměněná nařízením (ES) č. 807/2003 (Úř. věst. L 122, 16.5.2003, s. 36).

[2] Úř. věst. L 318, 27.11.1998, s. 45.

[3] Úř. věst. L 265, 8.11.1995, s. 17. Směrnice naposledy pozměněná směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2001/46/ES (Úř. věst. L 234, 1.9.2001, s. 55).

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA

Podmínky pro mikroskopické zjišťování, identifikaci nebo odhad složek živočišného původu v krmivech

1. Cíl a oblast použití

Tyto podmínky se použijí, provádí-li se zjišťování složek živočišného původu (definovaných jako výrobky ze zpracování těl a částí těl savců, drůbeže a ryb) v krmivech mikroskopickou zkouškou v rámci koordinovaného programu kontroly v oblasti výživy zvířat v souladu se směrnicí Rady 95/53/ES. Pokud se metody popsané v této příloze používají ve všech úředně stanovených testech, lze rovněž provést druhou zkoušku pomocí odlišných nebo alternativních metod, aby se lépe zjistily některé druhy složek živočišného původu nebo více zpřesnil původ těchto složek. Kromě toho lze použít odlišný protokol, pokud se zkoumají některé zvláštní složky živočišného původu, jako například plazma nebo kosti v loji (viz též bod 9) za předpokladu, že se tyto analýzy provádějí jako doplněk k analýzám stanoveným v koordinovaném programu kontroly.

2. Citlivost

Podle druhu složek živočišného původu lze v krmivech prokázat velmi malá množství (< 0,1 %).

3. Princip

K identifikaci se používá reprezentativní vzorek odebraný v souladu s ustanoveními směrnice Komise 76/371/EHS ze dne 1. března 1976, kterou se stanoví metody odběru vzorků Společenství pro úřední kontrolu krmiv [1], jenž byl vhodným způsobem upraven. Pro manipulaci s krmivem o nízkém obsahu vlhkosti je vhodný následující protokol. Krmivo s obsahem vlhkosti vyšším než 14 % se před manipulací suší (zahušťuje). Některá krmiva a některé krmné suroviny (např. tuky a oleje) vyžadují speciální ošetření (viz bod 9). Složky živočišného původu jsou identifikovány na základě charakteristických, mikroskopicky rozeznatelných znaků (tj. svalových vláken a jiných masitých částic, chrupavek, kostí, rohů, chlupů, štětin, krve, peří, vaječných skořápek, rybích kostí, šupin). Identifikace musí být provedena jak v prosívané frakci (bod 6.1), tak v koncentrovaném sedimentu (bod 6.2) vzorku.

4. Činidla

4.1 Zalévací přípravek

4.1.1 Chloralhydrát (vodný, 60 % hm./obj.)

4.1.2 Louh (NaOH 2,5 % hm./obj. nebo KOH 2,5 % hm./obj.) pro prosívané frakce

4.1.3 Parafínový olej nebo glycerol (viskozita: 68-81) pro mikroskopické pozorování v sedimentu

4.2 Oplachovací činidla

4.2.1 Alkohol, 96 %

4.2.2 Aceton

4.3 Koncentrační přípravek

4.3.1 Tetrachloroethylen (hustota 1,62)

4.4 Činidla k barvení

4.4.1 Roztok jódu v jodidu draselném (rozpusťte 2 g jodidu draselného ve 100 ml vody a přidejte 1 g jódu za častého protřepávání.)

4.4.2 Alizarinová červeň (rozřeďte 2,5 ml 1M kyseliny chlorovodíkové ve 100 ml vody a do tohoto roztoku přidejte 200 mg alizarinové červeně)

4.4.3 Činidlo na cystin (2 g octanu olovnatého, 10 g NaOH/100 ml H2O)

4.4.4 Roztok jódu v jodidu draselném (rozředěný v 70 % ethanolu)

4.5 Bělící činidlo

4.5.1 Roztok hypochloritu sodného obchodní jakosti (9,6 % aktivního chlóru)

5. Přístroje a pomůcky

5.1 Analytické váhy (přesnost 0,01 g, vyjma vážení koncentrovaného sedimentu: 0,001 g)

5.2 Rozmělňovací zařízení (mlýnek nebo hmoždíř, zejména pro analýzu krmiv obsahujících více než 15 % tuku)

5.3 Síto s velikostí ok nejvýše 0,50 mm se čtvercovými otvory

5.4 Dělicí nálevka nebo usazovací kádinka s kónickým dnem

5.5 Stereoskopický mikroskop (s alespoň 40násobným zvětšením)

5.6 Kombinovaný mikroskop (s alespoň 400násobným zvětšením), pro pozorování v procházejícím světle nebo s polarizačním zařízením

5.7 Standardní laboratorní sklo

Všechny přístroje musejí být důkladně vyčištěny. Dělicí nálevky a sklo musejí být umyty v myčce. Síta je třeba vyčistit kartáčem s tvrdými štětinami.

6. Pracovní postup

Granulované krmivo lze předběžně přesít, pokud se obě frakce analyzují jako samostatné vzorky.

Upraví se alespoň 50 g vzorku (v případě nutnosti se opatrně rozmělní pomocí vhodného rozmělňovacího zařízení (5.2), aby se dosáhlo vhodné struktury). Z rozmělněného materiálu se odeberou dvě reprezentativní části, jedna pro prosévané frakce (nejméně 5 g) (6.1) a jedna pro koncentrovaný sediment (nejméně 5 g) (6.2). Z důvodu identifikace lze dodatečně použít činidla k barvení (6.3).

Aby se zjistila povaha živočišných bílkovin a původ částeček, lze použít systém pro podporu rozhodování, jako například Aries, a referenční vzorky.

6.1 Identifikace složek živočišného původu v prosívaných frakcích

Nejméně 5 g vzorku se proseje skrze síto (5.3) na dvě frakce.

Prosetá/é frakce s velkými částečkami (nebo reprezentativní část frakce) se nanese(ou) v tenké vrstvě na vhodnou podložku a pod stereoskopickým mikroskopem se systematicky zkoumá(ají) při různém zvětšení na přítomnost složek živočišného původu (5.5).

Preparáty s prosetou frakcí obsahující jemné částečky se systematicky zkoumají pod kombinovaným mikroskopem (5.6) při různém zvětšení na přítomnost složek živočišného původu.

6.2 Identifikace složek živočišného původu v koncentrovaném sedimentu

Do dělicí nálevky nebo do usazovací kádinky s kónickým dnem se naváží nejméně 5 g (s přesností na 0,01 g) vzorku a přidá se alespoň 50 ml tetrachlorethylenu (4.3.1). Tato směs se opakovaně protřepe nebo promíchá.

- Je-li použita uzavřená dělicí nálevka, sediment se nechá dostatečně dlouho ustát (alespoň tři minuty), než se oddělí. Opakuje se protřepání a sediment se opět nechá alespoň tři minuty ustát, než se znovu oddělí.

- Je-li použita otevřená kádinka, sediment se před oddělením nechá ustát alespoň pět minut.

Veškerý sediment se vysuší a potom zváží (s přesností na 0,001 g). Vážení je nezbytné pouze tehdy, pokud je požadováno hodnocení. Pokud sediment obsahuje mnoho velkých částeček, může se prosít sítem (5.3) do dvou frakcí. Vysušený sediment se zkoumá pod stereoskopickým (5.5) a kombinovaným (5.6) mikroskopem na přítomnost částic kostí.

6.3 Použití zalévacích přípravků a činidel k barvení

Mikroskopickou identifikaci složek živočišného původu lze podpořit použitím speciálních zalévacích přípravků a činidel k barvení.

Chloralhydrát (4.1.1): | opatrným zahřátím lze jednoznačněji rozeznat buněčné struktury, jelikož škrobové částice gelovatí, a odstraňuje se nežádoucí buněčný obsah. |

Louh (4.1.2): | hydroxid sodný nebo hydroxid draselný čistí materiál, a napomáhá tak zjištění svalových vláken, chlupů a jiných keratinových struktur. |

Parafínový olej a glycerol (4.1.3): | částice kostí lze v tomto zalévacím přípravku snadno identifikovat, jelikož většina lakun zůstává vyplněna vzduchem a je rozeznatelná jako černé otvory o velikosti přibližně 5 až 15 µm. |

Roztok jódu v jodidu draselném: | používá se ke zjišťování škrobu (modrofialové zbarvení) a bílkovin (žlutooranžové zbarvení). Může se v případě potřeby ředit. |

Roztok alizarinové červeně (4.4.2): | červené až růžové zbarvení kostí, rybích kostí a šupin. Před vysušením (viz bod 6.2) se celý sediment přenese do skleněné zkumavky a dvakrát propláchne asi 5 ml alkoholu (4.2.1) (směs se pokaždé rozvíří, rozpouštědlo se nechá asi minutu ustát a vylije se). Před použitím tohoto činidla k barvení se sediment bělí přidáním nejméně 1 ml roztoku hypochloritu sodného (4.5.1). Reakce se nechá probíhat po dobu 10 minut. Zkumavka se naplní vodou, sediment se nechá dvě až tři minuty ustát a voda se suspendovanými částečkami se vylije. Sediment se znovu dvakrát propláchne asi 10 ml vody (směs se pokaždé rozvíří, nechá se ustát a voda se vylije). Přidá se 2 až 10 nebo více kapek alizarinové červeně (v závislosti na množství sedimentu). Směs se protřepe a několik vteřin se nechá probíhat reakce. Zbarvený sediment se dvakrát propláchne asi 5 ml alkoholu (4.2.1), pak se jednou propláchne acetonem (4.2.2) (směs se pokaždé rozvíří, rozpouštědlo se nechá asi minutu ustát a vylije se). Sediment je pak připraven k vysušení. |

Činidlo na cystin (4.4.3): | opatrným zahříváním se složky obsahující cystin (chlupy, peří atd.) zbarví černohnědě. |

6.4 Zkoumání možné přítomnosti rybí moučky v krmivu

Pod kombinovaným mikroskopem se zkoumá alespoň jedno podložní sklíčko s jemnou prosívanou frakcí a jemnou frakcí sedimentu (viz body 6.1 a 6.2).

Pokud je na etiketě uvedeno, že složky zahrnují rybí moučku, nebo v případě podezření na přítomnost rybí moučky nebo jejího zjištění při první prohlídce, se zkoumají alespoň dvě další podložní sklíčka s jemnou frakcí z původního vzorku a z celkové frakce sedimentu.

7. Výpočet a vyhodnocení

Členské státy zajistí, aby se postupy popsané v tomto bodu používaly vždy, když se provádí úřední analýza za účelem kvantitativního určení (nikoli jen přítomnosti) složek živočišného původu.

Výpočet lze provést pouze tehdy, jsou-li ve složkách živočišného původu obsaženy částice kostí.

Částice kostí teplokrevných suchozemských zvířat (tj. savců a ptáků) se v mikroskopickém preparátu odlišují od rybích kostí charakteristickými lakunami. Určení podílu složek živočišného původu ve zkoumaném vzorku se provádí s přihlédnutím k:

- odhadovanému podílu ( % hmot.) částic kostí v koncentrovaném sedimentu a

- podílu ( % hmot.) kostí ve složkách živočišného původu.

Hodnocení se provádí na základě (pokud možno) nejméně tří preparátů a nejméně pěti polí na preparát. Koncentrovaný sediment u krmných směsí zpravidla obsahuje kromě částic kostí suchozemských zvířat a částic rybích kostí i jiné částice vysoké specifické hmotnosti, například minerálie, písek, zdřevnatělé úlomky rostlin atd.

7.1 Určení procentuálního podílu kostních částic

částice kostí suchozemských zvířat ( %) = (S × c)/W

částice rybích kostí a šupin ( %) = (S × d)/W

(S = hmotnost sedimentu (mg), c = opravný koeficient ( %) pro odhadovaný podíl kostí suchozemských živočichů v sedimentu, d = opravný koeficient ( %) pro odhadovaný podíl částic rybích kostí a šupin v sedimentu, W = navážka vzorku pro sedimentaci (mg)).

7.2 Určení podílu složek živočišného původu

Podíl kostí v produktech živočišného původu se může značně lišit. (Procentuální podíl kostí je v případě kostní moučky řádově 50 až 60 % a v případě masových mouček řádově 20 až 30 %; v případě rybích mouček se obsah kostí a šupin liší podle kategorie a původu rybí moučky a obvykle se pohybuje na úrovni 10 až 20 %.

Je-li znám druh živočišné moučky ve vzorku, lze podíl odhadnout:

Odhadovaný podíl složek ze suchozemských živočichů ( %) = (S × c)/(W × f) × 100

Odhadovaný podíl složek z ryb ( %) = (S × d)/(W × f) × 100

(S = hmotnost sedimentu (mg), c = opravný koeficient ( %) pro odhadovaný podíl kostí suchozemských živočichů v sedimentu, d = opravný koeficient ( %) pro odhadovaný podíl částic rybích kostí a šupin v sedimentu, f = opravný koeficient pro podíl kostí ve složkách živočišného původu ve zkoumaném vzorku, W = navážka vzorku pro sedimentaci (mg)).

8. Vyjádření výsledku zkoušky

Zpráva musí obsahovat přinejmenším informace o přítomnosti složek ze suchozemských živočichů a rybí moučky. Různé nálezy lze vyjadřovat následovně:

8.1 Pokud jde o přítomnost složek ze suchozemských živočichů:

- pokud lze mikroskopicky zjistit, nebyly v předloženém vzorku nalezeny žádné složky ze suchozemských živočichů

nebo

- pokud lze mikroskopicky zjistit, byly v předloženém vzorku nalezeny složky ze suchozemských živočichů;

8.2 Pokud jde o přítomnost rybí moučky:

- pokud lze mikroskopicky zjistit, nebyly v předloženém vzorku nalezeny žádné složky z ryb

nebo

- pokud lze mikroskopicky zjistit, byly v předloženém vzorku nalezeny složky z ryb.

V případě zjištění složek z ryb nebo ze suchozemských živočichů může být v případě nutnosti ve zprávě o zkoušce uveden odhad množství zjištěných složek (x %, < 0,1 %, 0,1–0,5 %, 0,5–5 % nebo > 5 %) a upřesněn druh suchozemských živočichů (je-li to možné) a zjištěné živočišné složky (svalová vlákna, chrupavky, kosti, rohovina, chlupy, štětiny, peří, krev, vaječné skořápky, rybí kosti, šupiny).

Je-li uveden odhad množství složek živočišného původu, uvede se rovněž použitý opravný koeficient f.

Pokud byly prokázány částice kostí suchozemských živočichů, obsahuje zpráva tento dodatek:

"Nelze vyloučit, že se jedná o částice ze savců."

Tento dodatek není nutný v případech, kdy jsou částice kostí suchozemských živočichů rozlišeny na částice kostí drůbeže nebo savců.

9. Nepovinný protokol pro analýzu tuků nebo olejů

Pro analýzu tuků nebo olejů lze použít tento protokol:

- je-li tuk v pevném stavu, ohřívá se například v mikrovlnné troubě, dokud není kapalný,

- pomocí pipety se přenese 40 ml tuku ze spodní části vzorku do odstředivkové zkumavky,

- odstřeďuje se po dobu 10 minut při 4000 ot/min,

- pokud tuk při odstřeďování ztuhl, znovu se ohřeje v troubě, dokud není kapalný. Opakuje se odstřeďování po dobu 5 minut při 4000 ot/min,

- pomocí lžičky nebo stěrky se polovina dekantovaných nečistot přenese na malou Petriho misku nebo na podložní sklíčko pro mikroskopování za účelem zjištění možného obsahu živočišných složek (svalová vlákna, peří, částice kostí atd.). Jako zalévací přípravek pro mikroskopování se doporučuje použít parafinový olej nebo glycerol,

- zbylé nečistoty se použijí pro sedimentaci podle bodu 6.2.

[1] Úř. věst. L 102, 15.4.1976, s. 1.

--------------------------------------------------