(EU) 2016/1840Prováděcí rozhodnutí Komise (EU) 2016/1840 ze dne 14. října 2016, kterým se mění příloha IV směrnice Rady 2009/156/ES, pokud jde o diagnostické metody moru koní (oznámeno pod číslem C(2016) 6509) (Text s významem pro EHP)

1.1.1.1.

Destičky ELISA se pokryjí rekombinantem AHSV-4 VP7 rozpuštěným v karbonátovém/bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Destičky se inkubují přes noc při teplotě 4 °C.

1.1.1.2.

Destičky se pětkrát propláchnou destilovanou vodou obsahující 0,01 % (obj.) látky Tween 20 (mycí roztok). Destičky se jemně poklepou savým materiálem, aby byl odstraněn veškerý zbytkový mycí roztok.

1.1.1.3.

Destičky se blokují fosfátovým pufrem (PBS) pH 7,2 + 5 % (hmot./obj.) roztokem odstředěného mléka (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/jamka, 1 hodinu při teplotě 37 °C.

1.1.1.4.

Blokující pufr se odstraní a destičky se jemně poklepou savým materiálem.

1.1.2.1.

Vzorky séra, které mají být testovány, a pozitivní a negativní kontrolní sérum se rozpustí v poměru 1 ku 25 v PBS + 5 % (hmot./obj.) roztoku odstředěného mléka + 0,05 % (obj.) látky Tween 20, 100 μl na jamku. Inkubují se 1 hodinu při teplotě 37 °C.

Pro titraci se připraví dvojitá série roztoků od 1 ku 25 (100 μl/jamka), jedno sérum v každém sloupci destičky, a totéž se provede s pozitivními a negativními kontrolními vzorky. Vzorky se inkubují 1 hodinu při teplotě 37 °C.

1.1.2.2.

Destičky se pětkrát propláchnou destilovanou vodou obsahující 0,01 % (obj.) látky Tween 20 (mycí roztok). Destičky se jemně poklepou savým materiálem, aby byl odstraněn veškerý zbytkový mycí roztok.

1.1.3.1.

Antikoňský gama-globulin konjugovaný s křenovou peroxidázou (HRP) rozředěný v PBS + 5 % mléka + 0,05 % látky Tween 20, pH 7,2 se rozdělí v množstvích 100 μl/jamka. Inkubuje se 1 hodinu při teplotě 37 °C.

1.1.3.2.

Destičky se pětkrát propláchnou destilovanou vodou obsahující 0,01 % (obj.) látky Tween 20 (mycí roztok). Destičky se jemně poklepou savým materiálem, aby byl odstraněn veškerý zbytkový mycí roztok.

1.1.4.1.

Přidá se 200 μl/jamka roztoku chromogenu/substrátu (10 ml 80,6 mM DMAB (dimethylaminobenzaldehyd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid) + 5 μl H2O2).

Proces barvení se zastaví přidáním 50 μl 3N HH2SO4 asi po 5 až 10 minutách (předtím, než se začnou zbarvovat negativní kontrolní vzorky).

Mohou být použity také další chromogeny, např. ABTS (2,2′-azino-bis-[3-ethylbenzothiazolin-6-kyselina sulfonová]), TMB (tetra-methyl benzidin) nebo OPD (orto-fenyldiamin).

1.1.4.2.

Destičky se vyhodnotí při vlnové délce 600 nm (nebo 620 nm).

1.2.1.

Prahová hodnota se vypočte přidáním 0,06 k hodnotě negativní kontroly (0,06 je směrodatná odchylka odvozená ze skupiny 30 negativních sér).

1.2.2.

Testované vzorky vykazující hodnoty absorpce nižší než prahová hodnota jsou považovány za negativní.

1.2.3.

Testované vzorky vykazující hodnoty absorpce vyšší než prahová hodnota +0,15 jsou považovány za pozitivní.

1.2.4.

Testované vzorky vykazující střední hodnoty absorpce jsou nejisté a k potvrzení výsledku musí být použita druhá metoda.

2.1.1.1.

Destičky ELISA se pokryjí 50–100 ng rekombinantu AHSV-4 VP7 rozpuštěného v karbonátovém/bikarbonátovém pufru, pH 9,6. Inkubují se přes noc při teplotě 4 °C.

2.1.1.2.

Destičky se třikrát propláchnou fosfátovým pufrem (PBS) 0,1× obsahujícím 0,135 M NaCl a 0,05 % (obj.) látky Tween 20 (PBST). Destičky se jemně poklepou savým materiálem, aby byl odstraněn veškerý zbytkový mycí roztok.

2.1.2.1.

Vzorky séra, které mají být testovány, a pozitivní a negativní kontrolní sérum se rozpustí v poměru 1 ku 5 v roztoku obsahujícím 0,35 M NaCl, 0,05 % (obj.) látky Tween 20 a 0,1 % Kathon, 100 μl na jamku. Inkubuje se 1 hodinu při teplotě 37 °C.

Pro titraci se připraví dvojitá série roztoků testovaných sér (100 μl/jamka) od 1 ku 10 do 1 ku 280 v osmi jamkách, jedno sérum na sloupec destičky. Stejný krok se provede i s pozitivním a negativním kontrolním sérem. Inkubuje se 1 hodinu při teplotě 37 °C.

2.1.2.2.

Destičky se pětkrát propláchnou solným fosfátovým pufrem (PBS) 0,1× obsahujícím 0,135 M NaCl a 0,05 % (obj.) látky Tween 20 (PBST). Destičky se jemně poklepou savým materiálem, aby byl odstraněn veškerý zbytkový mycí roztok.

2.1.3.1.

Do každé jamky se přidá 100 μl roztoku Mab proti VP7 konjugovaného s křenovou peroxidázou. Tento roztok Mab byl předem naředěn v poměru 1/5 000–1/15 000 v roztoku stabilizátoru StabiliZyme Select® (SurModics. Reference: SZ03) 1 ku 1 v destilované vodě. Inkubuje se 30 minut při teplotě 37 °C.

2.1.3.2.

Destičky se pětkrát propláchnou solným fosfátovým pufrem (PBS) 0,1× obsahujícím 0,135 M NaCl a 0,05 % (obj.) látky Tween 20 (PBST). Destičky se jemně poklepou savým materiálem, aby byl odstraněn veškerý zbytkový mycí roztok.

2.2.1.

Blokující procento (BP) každého vzorku se určí pomocí následujícího vzorce, kde „Abs“ znamená protilátky:

2.2.2.

Vzorky s hodnotou BP vyšší než 50 % by měly být považovány za pozitivní na protilátky proti AHSV.

2.2.3.

Vzorky s hodnotou BP nižší než 45 % by měly být považovány za negativní na protilátky proti AHSV.

2.2.4.

Vzorky s hodnotou BP mezi 45 % a 50 % by měly být považovány za nejisté a testování je třeba provést znovu. V případě opakovaného nejistého výsledky by zvířata měla být znovu vyšetřena na základě vzorků odebraných nejdříve dva týdny po odběru vzorku, který se považoval za nejistý.

—

extrakce nukleových kyselin pomocí fenol-chloroformu,

—

adsorpce nukleových kyselin do filtračního systému,

—

adsorpce nukleových kyselin do systému magnetických kuliček.

1.1.

1 g vzorku tkáně se homogenizuje v 1 ml denaturačního roztoku (4 M guanidium thiokyanát, 25 mM citronan sodný, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarkosyl).

1.2.

Po odstředění se do supernatantu přidá 1 μg reagentu kvasinkové RNA, 0,1 ml 2 M octanu sodného pH 4, 1 ml fenolu a 0,2 ml směsi chloroformu a isoamylalkoholu (49/1).

1.3.

Suspenze se prudce protřepe a po dobu 15 minut zchladí na ledu.

1.4.

Po odstředění se RNA přítomná ve vodné fázi extrahuje fenolem, precipituje etanolem a resuspenduje ve sterilní vodě.

—

přímý primer

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

reverzní primer

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

sonda MGB-TaqMan

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

Koncentrace primeru se naředí na pracovní koncentraci 8 μM (dále jen „pracovní primer 8 μM“) a sonda se naředí na pracovní koncentraci 50 μM (dále jen „pracovní roztok sondy 50 μM“). Navrhne se uspořádání testovací destičky a nahraje se do softwaru přístroje k provedení metody PCR v reálném čase. S využitím plánu uspořádání se přidá 2,5 μl každého pracovního primeru 8 μM do každé jamky, která bude obsahovat vzorky RNA, pozitivní a/nebo negativní kontrolní vzorky (konečná koncentrace primeru bude 1 μM v 20 μl roztoku RT-PCR mix). Destička se uchovává na ledu.

2.1.2.

2 μl izolované RNA (testované vzorky a pozitivní kontrolní vzorky), nebo 2 μl vody bez ribonukleáz pro negativní kontrolní vzorky se smíchají s přímým a reverzním primerem. Směs se ohřevem na 95 °C po dobu 5 minut denaturuje a následně je rychle zchlazena na ledu po dobu alespoň 5 minut.

2.1.3.

Podle pokynů výrobce se připraví roztok master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase v objemu dostatečném pro počet testovaných vzorků. 0,1 μl pracovního roztoku sondy o 50 μM se přidá do každé jamky obsahující vzorky RNA (konečná koncentrace sondy bude 0,25 μM v každé jamce obsahující vzorky RNA. 13 μl roztoku master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase se rozdělí do každé jamky na destičce PCR obsahující denaturované primery a RNA.

2.1.4.

Destička se umístí do termocykleru v reálném čase naprogramovaného na reverzní transkripci a detekci amplifikace/fluorescence cDNA. Podmínky amplifikace zahrnují první krok reverzní transkripce při 48 °C po 25 minut, následovaný 10 minutami při 95 °C („horký start“) a 40 cykly po 15 sekundách při 95 °C, po 35 sekundách při 55 °C a po 30 sekundách při 72 °C (nebo 40 cyklů při 97 °C po 2 sekundách a při 55 °C po 30 sekundách při použití reakčních činidel a termocykleru určených pro rychlé reakce). Údaje o fluorescenci se získají na konci kroku při 55 °C.

2.1.5.

Stanovení se nepovažuje za validní, jsou-li výsledkem atypické amplifikační křivky, a musí být provedeno znovu.

Vzorky jsou považovány za pozitivní, pokud je hodnota Ct (číslo cyklu, při němž fluorescence vzniklá při reakci překročí prahovou hodnotu fluorescence) nižší nebo se rovná definované prahové hodnotě Ct (35) během 40 cyklů PCR (Ct ≤ 35).

Vzorky jsou považovány za nejisté, pokud je hodnota Ct vyšší než definovaná prahová hodnota Ct (35) během 40 cyklů PCR (Ct ≥ 35).

Vzorky jsou považovány za negativní, pokud získaná horizontální křivka amplifikace během 40 cyklů PCR nepřekročí prahovou linii.

—

přímý primer

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

reverzní primer

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

sonda MGB-TaqMan

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

Roztoky primeru a sondy se připraví v 25 × násobné koncentraci při 5 μΜ v případě přímého a reverzního primeru a 3 μΜ v případě sondy. Navrhne se uspořádání testovací destičky a nahraje se do softwaru přístroje k provedení metody PCR v reálném čase. S využitím plánu uspořádání se přidá 5 μl vzorků RNA, včetně testovacích vzorků a pozitivních i negativních kontrolních vzorků, do příslušných jamek na destičce.

2.2.2.

RNA se denaturuje ohřevem na 95 °C po dobu 5 minut a následně se rychle zchladí na ledu po dobu alespoň 3 minut.

2.2.3.

Podle pokynů výrobce se připraví roztok master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase v objemu dostatečném pro počet testovaných vzorků. 1 μl 25 × násobného roztoku směsi primeru a sondy (viz bod 2.2.1 výše) se přidá do roztoku master mix k získání konečné koncentrace v každé jamce 200 nM pro každý primer a 120 nM pro sondu. 20 μl roztoku master mix se rozdělí do každé jamky na destičce PCR obsahující denaturovanou RNA.

2.2.4.

Destička se umístí do termocykleru v reálném čase naprogramovaného na reverzní transkripci a detekci amplifikace/fluorescence cDNA dle doporučení výrobců. Podmínky amplifikace zahrnují například první krok reverzní transkripce při 48 °C po 10 minut, následovaný 10 minutami při 95 °C a 40 cykly po 15 sekundách při 95 °C a po 45 sekundách při 60 °C.

2.2.5.

Vzorky jsou považovány za pozitivní, pokud normalizovaná fluorescence stanovení obsahu AHSV RT-PCR překročí prahovou hodnotu 0,1 během 36 cyklů PCR ve všech replikacích vzorku.

Vzorky jsou považovány za nejisté, pokud normalizovaná fluorescence stanovení obsahu AHSV RT-PCR překročí prahovou hodnotu 0,1 během 36 až 40 cyklů PCR v kterékoli replikaci vzorku.

Vzorky jsou považovány za negativní, pokud normalizovaná fluorescence stanovení obsahu AHSV RT-PCR nepřekročila prahovou hodnotu 0,1 během 40 cyklů PCR ve všech replikacích vzorku a pokud normalizovaná fluorescence chráněné syntetické externí kontroly stanovení obsahu překročila prahovou hodnotu 0,1 během 33 cyklů PCR.“