(EU) č. 252/2012Nařízení Komise (EU) č. 252/2012 ze dne 21. března 2012 , kterým se stanoví metody odběru vzorků a analýzy pro úřední kontrolu obsahu dioxinů, PCB s dioxinovým efektem a PCB bez dioxinového efektu v některých potravinách a kterým se ruší nařízení (ES) 1883/2006 Text s významem pro EHP

1.1

„Akčním limitem“ se rozumí množství dané látky stanovené v příloze doporučení 2011/516/EU, které vede k zahájení šetření za účelem zjištění zdroje uvedené látky v případech, kdy jsou zjištěny zvýšené hodnoty příslušné látky.

1.2

„Bioanalytickými“ metodami se rozumějí metody založené na využití biologických principů, jako jsou buněčné testy, receptorové testy nebo imunologické testy. Neposkytují výsledky na úrovni kongeneru, ale pouze orientační hodnoty (2) úrovně TEQ, vyjádřené v bioanalytických ekvivalentech (BEQ), aby byla zohledněna skutečnost, že ne všechny sloučeniny přítomné v extraktu vzorku, který při zkoušce dává odezvu, nutně splňují všechny požadavky principu TEQ.

1.3

„Zjevnou výtěžností“ biologické zkoušky se rozumí hodnota BEQ vypočtená z kalibrační křivky TCDD nebo PCB 126 upravená o hodnoty slepého stanovení a poté vydělená hodnotou TEQ určenou pomocí GC/HRMS. Jejím účelem je korekce činitelů, jako je ztráta PCDD/PCDF a sloučenin s dioxinovým efektem během extrakce a čištění, současně extrahované sloučeniny zesilující nebo tlumící odezvu (agonistické a antagonistické účinky), kvalita kalibrace nebo rozdíly mezi hodnotami TEF a REP. Zjevná výtěžnost biologické zkoušky se vypočte z vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem sledované úrovně.

1.4

„Semikvantitativními metodami“ se rozumějí metody, které poskytují orientační hodnoty koncentrace domnělého analytu, přičemž numerické výsledky nesplňují požadavky na kvantitativní metody.

1.5

„Schválenou specifickou mezí kvantifikace jednotlivého kongeneru“ se rozumí koncentrace analytu v extraktu vzorku, jež dává instrumentální odezvu na dvou různých iontech, které mají být monitorovány při poměru signál–šum 3:1 pro méně intenzivní signál a při splnění identifikačních kritérií, jako jsou například kritéria popsaná v normě prEN 16215 (Krmiva – stanovení dioxinů a PCB s dioxinovým efektem pomocí GC/HRMS a indikátorových PCB pomocí GC/HRMS) a/nebo v metodě EPA 1613 revize B.

1.6

„Horním odhadem“ se rozumí koncept, který vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití hodnoty meze kvantifikace.

1.7

„Dolním odhadem“ se rozumí koncept, který vyžaduje pro příspěvek každého nekvantifikovaného kongeneru použití nulové hodnoty.

1.8

„Středním odhadem“ se rozumí koncept, který vyžaduje pro výpočet příspěvku každého nekvantifikovaného kongeneru použití poloviny hodnoty meze kvantifikace.

1.9

„Šarží“ se rozumí identifikovatelné množství potravinové komodity dodané ve stejném okamžiku, u nějž příslušný pracovník zjistil jednotné vlastnosti, jako je původ, druh, typ obalu, balírna, zasílatel nebo označení. U ryb a produktů rybolovu musí být srovnatelná také velikost ryb. I v případě, že velikost a/nebo hmotnost ryb nejsou v rámci zásilky srovnatelné, lze zásilku považovat za šarži, musí se však použít specifický postup odběru vzorků.

1.10

„Částí šarže“ se rozumí určitá část velké šarže vyčleněná k tomu, aby z ní byl proveden odběr vzorků. Každá část šarže musí být fyzicky samostatná a identifikovatelná.

1.11

„Dílčím vzorkem“ se rozumí množství materiálu odebrané z jednoho místa šarže nebo části šarže.

1.12

„Souhrnným vzorkem“ se rozumí souhrn všech dílčích vzorků odebraných ze šarže nebo části šarže.

1.13

„Laboratorním vzorkem“ se rozumí reprezentativní část nebo množství souhrnného vzorku určené pro laboratoř.

BEQ

Bioanalytické ekvivalenty

GC

Plynová chromatografie

HRMS

Vysoké rozlišení (hmotnostní spektrometrie)

LRMS

Nízké rozlišení (hmotnostní spektrometrie)

PCB

Polychlorované bifenyly

PCDD

Polychlorované dibenzo-p-dioxiny

PCDF

Polychlorované dibenzofurany

QC

Kontrola kvality

REP

Relativní účinnost

TEF

Toxický ekvivalenční faktor

TEQ

Toxické ekvivalenty

TCDD

Tetrachlordibenzodioxin

U

Rozšířená nejistota měření

—

Pokud vzorkovaná šarže obsahuje malé ryby (jednotlivé ryby o hmotnosti < přibližně 1 kg), odebírá se jako dílčí vzorek k vytvoření souhrnného vzorku celá ryba. Pokud je hmotnost takto vytvořeného souhrnného vzorku větší než 3 kg, může dílčí vzorek sestávat ze středních částí ryb tvořících souhrnný vzorek, přičemž každá tato část má hmotnost alespoň 100 g. Celá část, na niž se vztahuje maximální limit, se použije k homogenizaci vzorku.

Střední část ryby je část, v níž je těžiště. To se zpravidla nachází v hřbetní ploutvi (pokud ryba takovou ploutev má) nebo v polovině mezi žaberním a řitním otvorem.

—

Pokud vzorkovaná šarže obsahuje větší ryby (jednotlivé ryby o hmotnosti větší než přibližně 1 kg), tvoří dílčí vzorek střední část ryby. Hmotnost každého dílčího vzorku je alespoň 100 gramů.

U ryb s průměrnou velikostí (přibližně 1–6 kg) se dílčí vzorek odebírá jako řez od páteře k břichu ve střední části ryby.

U velmi velkých ryb (tj. > přibližně 6 kg) se dílčí vzorek odebírá ze svaloviny na pravé straně (pohled zpředu) hřbetu a boku ve střední části ryby. Pokud by odebrání takového kusu ze střední části způsobilo významnou hospodářskou škodu, lze za dostatečné považovat odebrání alespoň tří dílčích vzorků o hmotnosti každého alespoň 350 gramů, bez ohledu na velikost šarže, nebo lze případně odebrat rovnocennou část svaloviny z blízkosti ocasu a svaloviny z blízkosti hlavy z téže ryby, což představuje dílčí vzorek, jenž je reprezentativní z hlediska množství dioxinů v celé rybě.

—

Pokud jde o strukturu vzorku, použijí se ustanovení odstavce III.3.

—

Pokud převládá určitá třída/kategorie velikosti nebo hmotnosti (přibližně 80 % nebo větší podíl šarže), odebere se vzorek z ryb s převládající velikostí nebo hmotností. Takový vzorek se považuje za reprezentativní pro celou šarži.

—

Pokud žádná konkrétní třída/kategorie velikosti nebo hmotnosti nepřevládá, musí se zajistit, aby ryby vybrané do vzorku byly pro danou šarži reprezentativní. Zvláštní pokyny pro takové případy jsou stanoveny v „Pokynech pro odběr vzorků z celých ryb různé velikosti a/nebo hmotnosti“ (2).

—

započtením rozšířené nejistoty při použití faktoru pokrytí 2, který odpovídá hladině spolehlivosti asi 95 %. Šarže nebo její část nesplňuje podmínky, pokud naměřená hodnota, od níž se odečte U, překračuje stanovenou nejvyšší přípustnou hodnotu.

—

stanovením rozhodovací meze (CCα) podle ustanovení rozhodnutí 2002/657/ES (bod 3.1.2.5 přílohy I uvedeného rozhodnutí – pro látky, pro něž je stanovena nejvyšší přípustná hodnota). Šarže nebo její část nesplňuje podmínky, pokud je naměřená hodnota rovna stanovené rozhodovací mezi CCα nebo je vyšší.

—

provedené screeningovou metodou s mírou falešně vyhovujících vzorků nižší než 5 % naznačuje, že hladina nepřekračuje příslušný maximální limit pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006,

—

provedené konfirmační metodou nepřekročí příslušný maximální limit pro PCDD/PCDF a pro sumu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006, při zohlednění nejistoty měření.

—

započítáním rozšířené nejistoty při použití faktoru pokrytí 2, který odpovídá hladině spolehlivosti asi 95 %. Šarže nebo její část se považují za nevyhovující, pokud měřená hodnota, od níž se odečte U, překračuje stanovenou nejvyšší přípustnou hodnotu. V případě samostatného stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se pro odhad rozšířené nejistoty měření sumy PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí použít součet odhadované rozšířené nejistoty měření samostatných analytických výsledků u PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem,

—

stanovením rozhodovací meze (CCα) podle ustanovení rozhodnutí 2002/657/ES (bod 3.1.2.5 přílohy I uvedeného rozhodnutí – pro látky, pro něž je stanovena nejvyšší přípustná hodnota). Šarže nebo její část se považují za nevyhovující, pokud je naměřená hodnota rovna stanovené rozhodovací mezi CCα nebo je vyšší.

a)

identifikaci vzorků s obsahem PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem převyšujícím maximální nebo akční limity. To může zahrnovat screeningovou metodu umožňující nákladově efektivní analýzu velkého množství vzorků, čímž se zvyšuje možnost zjistit nové případy vysoké expozice a ohrožení zdraví spotřebitelů. Screeningové metody mohou zahrnovat bioanalytické metody a metody GC/MS. Cílem jejich použití je zabránit falešně vyhovujícím výsledkům. Koncentraci PCDD/PCDF a sumy PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v těchto vzorcích s významným obsahem je třeba stanovit/potvrdit konfirmační metodou;

b)

stanovení obsahu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem ve vzorcích potravin v rozmezí nízkých úrovní pozadí. To je důležité pro sledování vývoje v čase, posouzení expozice populace a pro vytvoření databáze za účelem případného přehodnocení akčních a maximálních limitů. Tohoto cíle se dosahuje pomocí konfirmačních metod umožňujících jednoznačnou identifikaci a kvantifikaci PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem na sledované úrovni. Tyto metody lze použít pro konfirmaci výsledků získaných screeningovými metodami a pro stanovení nízkých úrovní pozadí při sledování potravin. Rovněž jsou významné pro stanovení zastoupení kongenerů za účelem zjištění zdroje možné kontaminace. V současnosti tyto metody využívají plynovou chromatografii s vysokým rozlišením v tandemu s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (HRGC/HRMS).

—

bioanalytické metody, které jsou schopny odhalit sledované analyty, využívají kalibrační křivku, umožňují jednoznačné rozhodnutí (ano/ne) o případném překročení sledovaného limitu a umožňují vydat výsledek jako bioanalytické ekvivalenty (BEQ), které poskytují údaj o hodnotě TEQ ve vzorku,

—

fyzikálně-chemické zkoušky (např. GC-MS/MS nebo GC/LRMS), u nichž zjištěná přesnost metody nesplňuje požadavky na kvantitativní zkoušky.

—

Na každém stupni odběru vzorků a analýzy se musí přijmout opatření k zamezení křížové kontaminaci.

—

Vzorky musí být uchovávány a přepravovány ve skleněných, hliníkových, polypropylenových nebo polyethylenových nádobách vhodných pro skladování bez jakéhokoli vlivu na úrovně PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem ve vzorcích. Z nádoby na vzorky musí být odstraněny stopy papírového prachu.

—

Vzorky musí být uchovávány a přepravovány tak, aby byla zachována integrita vzorku potraviny.

—

Pokud je to relevantní, jednotlivé laboratorní vzorky se jemně rozemelou a důkladně promísí postupem, u nějž je prokázáno, že se jím dosáhne úplné homogenizace (např. rozemletím a proséváním přes síto s průměrem ok 1 mm); je-li vlhkost vzorků příliš vysoká, musí se vzorky před rozemletím sušit.

—

Je vždy důležité zkontrolovat činidla, pomůcky ze skla a vybavení z hlediska možného vlivu na výsledky založené na TEQ nebo BEQ.

—

Provede se slepá analýza, při níž se provede celý analytický postup bez vzorku.

—

U bioanalytických metod je velmi důležité, aby u veškerých pomůcek ze skla a rozpouštědel použitých při analýze bylo zkouškou potvrzeno, že jsou prosty sloučenin, které mohou bránit zjištění cílových sloučenin v pracovním rozsahu. Skleněné pomůcky se vypláchnou rozpouštědly nebo/a zahřejí na teploty vhodné pro odstranění stop PCDD/PCDF, sloučenin s dioxinovým efektem a interferujících sloučenin z jejich povrchu.

—

Množství vzorku použité pro extrakci musí být dostatečné, aby byly splněny požadavky s ohledem na dostatečně nízký pracovní rozsah včetně sledovaných koncentrací.

—

Specifické postupy přípravy vzorku použité pro zkoumané produkty musí splňovat mezinárodně uznávané metodiky.

—

Z ryb se musí odstranit kůže, vzhledem k tomu že maximální limit se vztahuje na svalovinu bez kůže. Je však nutné, aby všechna zbylá svalovina a tuková tkáň na vnitřní straně kůže byly z kůže pečlivě a úplně seškrabány a přidány k analyzovanému vzorku.

—

V souladu s nařízením (ES) č. 882/2004 musí být laboratoře akreditovány uznaným subjektem působícím v souladu s ISO Guide 58, aby bylo zaručeno, že uplatňují postupy zajištění analytické kvality. Laboratoře musí být akreditovány podle normy EN ISO/IEC 17025.

—

Odbornost laboratoře prokazuje soustavná úspěšná účast v mezilaboratorních studiích týkajících se stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem v příslušných matricích potravin a koncentračních rozpětích.

—

Laboratoře, které pro rutinní kontrolu vzorků používají screeningové metody, by měly úzce spolupracovat s laboratořemi používajícími konfirmační metodu, za účelem jednak kontroly kvality, jednak konfirmace výsledku analýzy podezřelých vzorků.

—

V případě PCDD/PCDF musí být zjistitelné množství z důvodu extrémní toxicity některých těchto sloučenin na horní úrovni femtogramů (10–15 g). V případě většiny kongenerů PCB je dostatečná již mez kvantifikace na úrovni nanogramů (10–9 g). Pro měření toxičtějších kongenerů PCB s dioxinovým efektem (zejména non-orto substituovaných kongenerů) však musí nejspodnější část pracovního rozsahu dosahovat nízkých úrovní pikogramů (10–12 g).

—

Je třeba rozlišit PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem a řadu jiných sloučenin, které se extrahují společně s těmito látkami, mohou rušit při jejich stanovování a jsou přítomny v koncentracích až o několik řádů vyšších než koncentrace sledovaných analytů. U metod založených na plynové chromatografii / hmotnostní spektrometrii (GC/MS) je nezbytné rozlišení mezi různými kongenery, např. mezi toxickými kongenery (např. sedmnácti PCCC/PCDF substituovanými v polohách 2,3,7,8 a dvanácti PCB s dioxinovým efektem) a ostatními kongenery.

—

Bioanalytické metody musí být schopny detekovat cílové sloučeniny jako sumu PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem. Čištění vzorku se zaměří na odstranění sloučenin způsobujících falešně nevyhovující výsledky nebo sloučenin, které mohou způsobovat snížení odezvy vedoucí k falešně vyhovujícím výsledkům.

—

U metod GC/MS musí stanovení poskytovat správný odhad skutečné koncentrace ve vzorku. Vysoká správnost (správnost měření: stupeň shody mezi výsledkem měření a skutečnou nebo přidělenou hodnotou) je nezbytná k tomu, aby nedošlo k zamítnutí výsledku analýzy vzorku na základě malé spolehlivosti stanovené úrovně TEQ. Správnost je vyjádřena pravdivostí (rozdílem mezi střední naměřenou hodnotou analytu v certifikovaném materiálu a jeho certifikovanou hodnotou, vyjádřeným v procentech této hodnoty) a přesností (RSDR je relativní směrodatná odchylka vypočtená z výsledků získaných za podmínek reprodukovatelnosti).

—

Pro bioanalytické metody se určí zjevná výtěžnost biologické zkoušky.

—

Laboratoře musí prokázat spolehlivost metod v rozsahu kolem sledované úrovně, např. v polovině, jednonásobku nebo dvojnásobku sledované úrovně, a to s přijatelným variačním koeficientem pro opakovanou analýzu, a sice během validace a/nebo během rutinní analýzy.

—

Jako opatření v rámci vnitřní kontroly kvality se provádějí pravidelná slepá kontrolní stanovení a stanovení s obohacenými vzorky nebo analýzy kontrolních vzorků (nejlépe certifikovaného referenčního materiálu, je-li k dispozici). Ze slepých kontrolních stanovení, stanovení s obohacenými vzorky nebo analýz kontrolních vzorků se vyhotoví a ověří grafy kontroly kvality, aby bylo zajištěno, že analytická výkonnost je v souladu s požadavky.

—

Pro bioanalytické screeningové metody není stanovení meze kvantifikace nezbytné, příslušná metoda však musí prokázat, že umožňuje rozlišení mezi hodnotou slepého stanovení a mezní hodnotou. Při poskytování úrovně BEQ se stanoví oznamovací mez pro vzorky s odezvou nižší než tato mez. Musí být prokázáno, že se oznamovací mez liší od slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup nejméně trojnásobně, s odezvou nižší než pracovní rozsah. Vypočte se proto ze vzorků obsahujících cílové sloučeniny přibližně v požadované minimální úrovni, a nikoli z poměru signál–šum nebo ze slepé zkoušky.

—

Mez kvantifikace u konfirmačních metod činí přibližně jednu pětinu sledované úrovně.

—

Pro spolehlivé výsledky konfirmačních nebo screeningových metod musí být splněna následující kritéria pro hodnotu TEQ a BEQ, ať už je určena jako celkový TEQ (jako suma PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem), nebo samostatně pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

—

Pro screening mohou být použity jak metody GC/MS, tak bioanalytické metody. V případě metod GC/MS platí požadavky uvedené v odstavci 7 této přílohy. Pro buněčné bioanalytické metody jsou zvláštní požadavky stanoveny v odstavci 8 této přílohy.

—

Laboratoře, které pro rutinní kontrolu vzorků používají screeningové metody, by měly úzce spolupracovat s laboratořemi používajícími konfirmační metodu.

—

Během rutinních analýz je nutné ověřovat výkonnost příslušné screeningové metody, a to kontrolou analytické kvality a průběžnou validací metody. Musí být zaveden stálý program kontroly vyhovujících výsledků.

—

Kontrola možného potlačení buněčné odezvy a cytotoxicity

20 % extraktů vzorků se změří při rutinním screeningu bez přidání a s přidáním 2,3,7,8-TCDD v množství odpovídajícím sledované úrovni, aby se zjistilo, zda odezva není potlačována interferujícími látkami přítomnými v extraktu vzorku. Naměřená koncentrace u obohaceného vzorku se porovná se součtem koncentrace neobohaceného extraktu a koncentrace obohacující látky. Pokud je tato naměřená koncentrace o více než 25 % nižší než vypočtená (souhrnná) koncentrace, svědčí to o tom, že možná dochází k potlačení odezvy, a dotčený vzorek musí být podroben konfirmační analýze pomocí GC/HRMS. Výsledky musí být zaznamenány v grafech kontroly kvality.

—

Kontrola kvality u vyhovujících vzorků

Přibližně 2 až 10 % vyhovujících vzorků, v závislosti na matrici vzorků a zkušenostech laboratoře, musí být potvrzeno pomocí GC/HRMS.

—

Určení míry falešně vyhovujících vzorků na základě údajů z kontroly kvality

Určí se míra falešně vyhovujících výsledků na základě screeningu nižších a vyšších než maximální nebo akční limit. Skutečný podíl falešně vyhovujících výsledků musí být nižší než 5 %.

Poté, co je k dispozici nejméně 20 potvrzených výsledků z kontroly kvality vyhovujících vzorků na matrici / matricovou skupinu, vyvodí se z těchto výsledků závěry ohledně míry falešně vyhovujících výsledků. Do minimálního počtu 20 výsledků pro hodnocení míry falešně vyhovujících výsledků se mohou zahrnout i výsledky ze vzorků analyzovaných pomocí okružních rozborů nebo při kontaminačních aférách, které pokrývají rozpětí koncentrace až např. do dvojnásobku maximálního limitu. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, která představují různé zdroje.

Ačkoli se mají screeningové testy přednostně zaměřit na zjištění vzorků přesahujících akční limit, je kritériem pro stanovení míry falešně vyhovujících vzorků maximální limit, s přihlédnutím k nejistotě měření konfirmační metody.

—

Případné nevyhovující výsledky ze screeningu musí být vždy ověřeny konfirmační analytickou metodou (GC/HRMS). Tyto vzorky mohou být také použity pro vyhodnocení podílu falešně nevyhovujících výsledků. U screeningových metod je mírou „falešně nevyhovujících výsledků“ podíl výsledků, které konfirmační analýza pomocí GC/HRMS potvrdí jako vyhovující, zatímco při předchozím screeningu bylo vysloveno podezření, že je vzorek nevyhovující. Hodnocení výhodnosti použití screeningové metody však musí vycházet z porovnání falešně nevyhovujících vzorků a celkového počtu kontrolovaných vzorků. Tento poměr musí být dostatečně nízký, aby bylo možné považovat používání příslušného screeningového nástroje za výhodné.

—

Bioanalytické metody musí alespoň při validačních podmínkách poskytovat platné údaje o úrovni TEQ, vypočtené a vyjádřené jako BEQ.

—

Pro bioanalytické metody prováděné za podmínek opakovatelnosti je vnitrolaboratorní RSDr obvykle menší než reprodukovatelnost RSDR.

—

U potravin s úrovní kontaminace přibližně 1 pg WHO-TEQ na gram tuku (na základě sumy PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem) nesmí rozdíl mezi horním odhadem a dolním odhadem překročit 20 %. U potravin s nízkým obsahem tuku musí být při úrovni kontaminace přibližně 1 pg WHO-TEQ na gram produktu dodrženy stejné požadavky. Při nižších úrovních kontaminace, např. 0,5 pg WHO-TEQ na gram produktu, může být rozdíl mezi horním a dolním odhadem v rozpětí mezi 25 % a 40 %.

—

Vnitřní standardy 2,3,7,8-chlor-substituovaných PCDD/PCDF značené isotopem 13C a standardy PCB s dioxinovým efektem značené isotopem 13C musí být přidány na samém začátku analýzy, např. před extrakcí, aby bylo možné validovat analytický postup. Alespoň jeden kongener musí být přidán pro každou z tetra až okta-chlorovaných homologických skupin PCDD/PCDF a alespoň jeden kongener pro každou z homologických skupin PCB s dioxinovým efektem (nebo alespoň jeden kongener pro každou skupinu vybraných iontů při použití hmotnostní spektrometrie v režimu registrace vybraných iontů (hmotnostní spektrometrie v režimu SIM) použitou pro sledování PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem). V případě konfirmačních metod se použije všech 17 vnitřních standardů 2,3,7,8-substituovaných PCDD/PCDF značených pomocí 13C a všech 12 vnitřních standardů PCB s dioxinovým efektem značených pomocí 13C.

—

Relativní odezvové faktory se s pomocí vhodných kalibračních roztoků stanoví také pro kongenery, pro něž nebyly přidány sloučeniny značené isotopem 13C,

—

U potravin rostlinného původu a potravin živočišného původu s obsahem tuku nižším než 10 % je přidání vnitřních standardů povinné před extrakcí. U potravin živočišného původu s obsahem tuku vyšším než 10 % lze vnitřní standardy přidat buď před extrakcí tuku, nebo po ní. Vhodným způsobem se validuje účinnost extrakce, a to v závislosti na fázi, ve které se přidávají vnitřních standardy, a podle toho, zda se vydávané výsledky vztahují na výrobek nebo na tuk ve výrobku obsažený.

—

Před analýzou metodou GC/MS musí být přidány 1 nebo 2 obohacené standardy (recovery standardy) pro stanovení výtěžnosti.

—

Kontrola výtěžnosti je nezbytná. U konfirmačních metod se výtěžnost jednotlivých vnitřních standardů musí pohybovat v rozmezí 60 až 120 %. Nižší nebo vyšší hodnota výtěžnosti u jednotlivých kongenerů, zejména některých hepta- a okta-chlorovaných dibenzo-p-dioxinů a dibenzofuranů, je přípustná pod podmínkou, že jejich příspěvek k hodnotě TEQ nepřesáhne 10 % celkové hodnoty TEQ (na základě součtu PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem). Hodnota výtěžnosti u screeningových metod GC/MS se musí pohybovat mezi 30 a 140 %.

—

Oddělení PCDD/PCDF od interferujících chlorovaných sloučenin, jako jsou PCB bez dioxinového efektu a chlorované difenylethery, se provede vhodnými chromatografickými technikami (nejlépe na florisilové, aluminové a/nebo uhlíkové koloně).

—

Oddělení isomerů pomocí plynové chromatografie musí být dostatečné (< 25 % překryvu mezi píky 1,2,3,4,7,8-HxCDF a 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Rozsah kalibrační křivky musí pokrývat odpovídající rozpětí sledovaných úrovní.

—

Při výpočtu koncentrace z kalibrační křivky TCDD vykáží hodnoty na spodním a horním konci křivky velký křivkový rozptyl (vysoký koeficient rozptylu – CV). Pracovní rozsah je oblast, kde je tento rozptyl menší než 15 %. Nejspodnější část pracovního rozsahu (oznamovací mez) musí být stanovena tak, aby výrazně (nejméně trojnásobně) přesahovala hodnoty slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup. Nejhořejší část pracovního rozsahu obvykle představuje hodnota EC70 (70 % maximální účinné koncentrace), je však nižší, pokud je křivkový rozptyl v tomto rozpětí vyšší než 15 %. Pracovní rozsah se stanoví během validace. Mezní hodnoty (8.3) musí být uvnitř pracovního rozsahu.

—

Standardní roztoky a extrakty vzorku se zkouší alespoň duplicitně. Při duplicitních zkouškách musí standardní roztok nebo kontrolní extrakt zkoušený ve 4–6 jamkách rozložených na destičce poskytnout odezvu nebo koncentraci (možné pouze v pracovním rozsahu) vycházející z CV < 15 %.

—

Za účelem výpočtu úrovně BEQ v extraktu a následně ve vzorku lze úroveň ve vzorcích odhadnout srovnáním jejich odezvy s odezvou kalibrační křivky TCDD (nebo PCB 126 nebo standardní směsi PCDD/PCDF / PCB s dioxinovým efektem).

—

Kalibrační křivky musí obsahovat 8 až 12 koncentrací (alespoň duplicitních), s dostatečným počtem koncentrací ve spodní části křivky (pracovním rozsahu). Zvláštní pozornost musí být věnována kvalitě proložení kalibračních bodů křivkou v pracovním rozsahu. Hodnota R2 sama o sobě má pouze zanedbatelný nebo žádný význam při hodnocení kvality proložení kalibračních bodů křivkou při nelineární regresi. Lepšího proložení se dosáhne minimalizací rozdílu mezi vypočtenými a zjištěnými úrovněmi v pracovním rozsahu křivky (např. minimalizací sumy druhých mocnin reziduí).

—

Od odhadované úrovně v extraktu vzorku se následně odečte úroveň BEQ vypočtená pro slepý vzorek matrice/rozpouštědla (aby se zohlednily nečistoty z použitých rozpouštědel a chemikálií) a provede se korekce na zjevnou výtěžnost (vypočtenou na základě úrovně BEQ vhodných referenčních vzorků s reprezentativním zastoupením kongenerů kolem sledované úrovně). Pro provedení korekce na výtěžnost musí být zjevná výtěžnost vždy v požadovaném rozmezí (viz bod 8.1.4). Referenční vzorky použité pro korekci na výtěžnost musí splňovat požadavky uvedené v bodě 8.2.

—

Při validaci je nutné zkontrolovat ztrátu sloučenin během čištění. Slepý vzorek obohacený směsí různých kongenerů se podrobí čištění (alespoň n = 3) a výtěžnost a variabilita se ověří analýzou GC/HRMS. Výtěžnost musí být v rozmezí 60 až 120 %, zejména u kongenerů s podílem na množství TEQ v různých směsích, který je vyšší než 10 %.

—

Při vydávání úrovní BEQ se stanoví oznamovací mez z příslušných matričních vzorků zahrnujících typická zastoupení kongenerů, avšak vzhledem k nízké přesnosti v dolním rozsahu křivky nikoli z kalibrační křivky standardů. Je třeba vzít v úvahu účinky extrakce a čištění. Oznamovací mez musí být stanovena významně (nejméně trojnásobně) vyšší než hodnoty slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup.

—

Referenční vzorky musí představovat matrice vzorku, zastoupení kongenerů a rozpětí koncentrací pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem kolem sledované úrovně (maximální nebo akční limity).

—

Každá série zkoušek musí zahrnovat slepý vzorek odrážející celý pracovní postup, či nejlépe slepý matriční vzorek, a referenční vzorek na sledované úrovni. Tyto vzorky musí být extrahovány a zkoušeny současně a za stejných podmínek. Referenční vzorek musí vykázat jasně vyšší odezvu v porovnání s odezvou slepého vzorku, čímž je zajištěna vhodnost zkoušky. Tyto vzorky mohou být použity pro korekci o hodnoty slepého stanovení a korekci na výtěžnost.

—

Referenční vzorky vybrané pro provedení korekce na výtěžnost musí být reprezentativní pro zkušební vzorky, což znamená, že zastoupení kongenerů nesmí vést k podhodnocení úrovní.

—

Pro prokázání odpovídající výkonnost zkoušky ve sledovaném rozsahu pro kontrolu sledované úrovně lze kromě toho zahrnout ještě referenční vzorky o např. poloviční a dvojnásobné koncentraci, než je sledovaná úroveň. Dohromady mohou být tyto vzorky použity pro výpočet úrovní BEQ ve zkušebních vzorcích (8.1.2.2).

BEQDL

je BEQ odpovídající rozhodovací mezi GC/HRMS, což je maximální limit včetně nejistoty měření

sy,x

je reziduální směrodatná odchylka

t α,f=m-2

je kvantil Studentova t-rozdělení (α = 5 %, f = stupně volnosti, jednostranný)

m

je celkový počet kalibračních bodů (index j)

n

je počet opakování na každé úrovni

xi

je koncentrace vzorku zkoušeného GC/HRMS (v TEQ) v kalibračním bodě i

je průměr koncentrací (v TEQ) všech kalibračních vzorků

SDR

je směrodatná odchylka výsledků biologické zkoušky na BEQDL, měřeno za podmínek vnitrolaboratorní reprodukovatelnosti.

—

Vzhledem k tomu, že při bioanalytických metodách nelze použít žádné vnitřní standardy, provedou se zkoušky opakovatelnosti pro získání informací o směrodatné odchylce v rámci zkoušek a mezi sériemi zkoušek. Opakovatelnost musí být nižší než 20 %, vnitrolaboratorní reprodukovatelnost pak nižší než 25 %. To musí vycházet z vypočtených úrovní v BEQ po odečtení hodnot slepého stanovení a korekci na výtěžnost.

—

Jako součást postupu validace musí být prokázáno, že zkouška umožňuje rozlišit slepý vzorek a úroveň ve výši mezní hodnoty, a umožňuje tak identifikovat vzorky nad příslušnou mezní hodnotou (viz 8.1.2).

—

Je třeba určit cílové sloučeniny, možné interference a nejvyšší přípustný obsah ve slepém vzorku.

—

Procentní směrodatná odchylka odezvy nebo koncentrace vypočtená z odezvy (možné pouze v pracovním rozsahu) trojnásobného stanovení extraktu vzorku nesmí být vyšší než 15 %.

—

Pro hodnocení výkonnosti bioanalytické metody v daném časovém období se použijí nekorigované výsledky referenčního vzorku (referenčních vzorků) vyjádřené v BEQ (pro slepý vzorek a sledovanou úroveň).

—

Pro slepé vzorky odrážející celý pracovní postup a pro každý typ referenčního vzorku se zaznamenávají a ověřují grafy kontroly kvality, aby bylo zajištěno, že analytická výkonnost je v souladu s příslušnými požadavky, u slepých vzorků odrážejících celý pracovní postup zejména s ohledem na požadovanou minimální odlišnost v nejspodnější části pracovního rozsahu a u referenčních vzorků zejména s ohledem na vnitrolaboratorní reprodukovatelnost. Slepé vzorky odrážející celý pracovní postup musí být důkladně kontrolovány, aby se zamezilo falešně vyhovujícím výsledkům po jejich odečtení.

—

Výsledky analýzy podezřelých vzorků a 2 až 10 % vyhovujících vzorků (minimálně 20 vzorků na jednu matrici) pomocí GC/HRMS se zaznamenají a použijí se pro hodnocení výkonnosti screeningové metody a vztahu mezi BEQ a TEQ. Tuto databázi lze použít pro přehodnocení mezních hodnot platných pro běžné vzorky pro validované matrice.

—

Dobrou výkonnost metody lze rovněž prokázat v okružních rozborech. Výsledky vzorků analyzovaných v okružních rozborech, které pokrývají rozsah koncentrací až do např. dvojnásobku maximálního limitu, se rovněž mohou zahrnout do hodnocení podílu falešně vyhovujících výsledků, je-li laboratoř schopna prokázat dobrou výkonnost. Vzorky musí zahrnovat nejčastější zastoupení kongenerů, která představují různé zdroje.

—

Při incidentech lze mezní hodnoty přehodnotit, aby odrážely konkrétní matrici a zastoupení kongenerů tohoto konkrétního incidentu.

—

Pokud to použitý analytický postup umožňuje, musí výsledky obsahovat hodnoty jednotlivých kongenerů PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem a vydávají se jako dolní, horní a střední odhad, aby se zahrnulo co nejvíce informací, a umožnil tak výklad podle příslušných zvláštních požadavků.

—

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF, PCB s dioxinovým efektem a lipidů. Obsah lipidů ve vzorku musí být stanoven a uveden pro potravinové vzorky s maximálními či akčními limity vztaženými na tuk a očekávané koncentrace tuku v rozmezí 0–2 % (v souladu se stávajícími předpisy), u ostatních vzorků je stanovení obsahu lipidů nepovinné.

—

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v bodě 7.2, je-li překročen maximální limit nebo v ostatních případech na žádost musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

—

Protože se má při rozhodování o souladu vzorku přihlédnout také k nejistotě měření, je třeba poskytnout také tento parametr. Výsledek analýzy se proto vydá ve tvaru „x +/– U“, kde x je výsledek analýzy a U je rozšířená nejistota měření, přičemž se použije faktor pokrytí 2, který odpovídá hladině spolehlivosti přibližně 95 %. V případě samostatného stanovení PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem se pro součet PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem musí použít součet odhadované rozšířené nejistoty měření samostatných výsledků analýzy pro PCDD/PCDF a PCB s dioxinovým efektem.

—

Je-li nejistota měření zohledněna uplatněním rozhodovací meze (CCα) (jak je popsáno v příloze II odstavci IV.2), tento parametr se uvede.

—

Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a (alespoň) se stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006.

—

Výsledek screeningu se vyjádří jako vyhovující nebo podezřelý jako nevyhovující („podezřelý“).

—

Kromě toho je možné vydat výsledek pro PCDD/PCDF a/nebo PCB s dioxinovým efektem vyjádřený v bioanalytických ekvivalentech (BEQ) (nikoli TEQ) (viz příloha III odstavec 2).

—

Pokud je uvedena nejistota měření u vypočtené úrovně BEQ, např. jako směrodatná odchylka, musí vycházet z nejméně trojnásobné analýzy (včetně extrakce, čištění a určení odezvy zkoušky) vzorku.

—

Vzorky s odezvou nižší než oznamovací mez musí být vyjádřeny jako nižší než oznamovací mez.

—

Pro každý typ matrice vzorku musí protokol uvádět sledovanou úroveň (maximální limit, akční limit), z níž hodnocení vychází.

—

Protokol musí uvádět použitý typ zkoušky, základní principy zkoušky a druh kalibrace.

—

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCDD/PCDF, PCB s dioxinovým efektem a lipidů. Obsah lipidů ve vzorku musí být stanoven a vydán pro potravinové vzorky s maximálními či akčními limity vztaženými na tuk a očekávané koncentrace tuku v rozmezí 0–2 % (v souladu se stávajícími předpisy), u ostatních vzorků je stanovení obsahu lipidů nepovinné.

—

Relativní retenční čas ve vztahu k vnitřním standardům nebo referenčním standardům (s přijatelnou odchylkou +/- 0,25 %).

—

Oddělení všech šesti indikátorových PCB (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 a PCB 180) pomocí plynové chromatografie od interferujících látek, zejména současně se eluujících PCB, zvláště jsou-li úrovně vzorků v rozmezí limitů stanovených právními předpisy a případný nesoulad má být teprve potvrzen.

Poznámka: Mezi kongenery, u nichž je často zjištěno, že se eluují zároveň, patří např. PCB 28/31, PCB 52/69 a PCB 138/163/164. U GC/MS je rovněž nutné vzít v úvahu možné interference z fragmentů vyšších chlorovaných kongenerů.

—

Techniky GC/MS:

—

Pro GC/ECD:

Konfirmace výsledků překračujících toleranci s dvěma kolonami GC se stacionární fází jiné polarity.

—

Použití vhodných vnitřních standardů s fyzikálně-chemickými vlastnostmi porovnatelnými se sledovanými analyty.

—

Přidání vnitřních standardů:

—

Požadavky na metody s využitím všech šesti isotopicky značených indikátorových kongenerů PCB:

—

Požadavky na metody, které nevyužívají všech isotopicky značených šesti vnitřních standardů nebo jiných vnitřních standardů:

—

Výtěžnosti neoznačených kongenerů se ověří pomocí obohacených vzorků nebo vzorků pro kontrolu kvality s koncentracemi v rozsahu sledované úrovně. Přijatelné výtěžnosti těchto kongenerů jsou mezi 70 a 120 %.

—

Pokud to použitý analytický postup umožňuje, musí výsledky obsahovat hodnoty jednotlivých kongenerů PCB a vydávají se jako dolní, horní a střední odhad, aby se zahrnulo co nejvíce informací, a umožnil tak výklad podle příslušných zvláštních požadavků.

—

Protokol musí také zahrnovat metodu použitou pro extrakci PCB a lipidů. Obsah lipidů ve vzorku musí být stanoven a vydán pro potravinové vzorky s maximálními hodnotami vztaženými na tuk a očekávané koncentrace tuku v rozmezí 0–2 % (v souladu se stávajícími předpisy), u ostatních vzorků je stanovení obsahu lipidů nepovinné.

—

Pokud výtěžnost leží mimo rozpětí uvedené v odstavci 6, je-li překročen maximální limit nebo v ostatních případech na žádost musí být dány k dispozici hodnoty výtěžnosti pro jednotlivé vnitřní standardy.

—

Protože se má při rozhodování o souladu vzorku přihlédnout také k nejistotě měření, je třeba poskytnout také tento parametr. Výsledek analýzy se proto vydá ve tvaru „x +/– U“, kde x je výsledek analýzy a U je rozšířená nejistota měření, přičemž se použije faktor pokrytí 2, který odpovídá hladině spolehlivosti přibližně 95 %.

—

Je-li nejistota měření zohledněna uplatněním rozhodovací meze (CCα) (jak je popsáno v příloze II odstavci IV.1), tento parametr se uvede.

—

Výsledky se vyjádří ve stejných jednotkách a (alespoň) se stejným počtem platných číslic jako maximální limity stanovené v nařízení (ES) č. 1881/2006.