(ES) č. 2091/2002NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 2091/2002 ze dne 26. listopadu 2002, kterým se mění nařízení (ES) č. 2870/2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovin

Nařízení Komise (ES) č. 2091/2002

ze dne 26. listopadu 2002,

kterým se mění nařízení (ES) č. 2870/2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovin

KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,

s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,

s ohledem na nařízení Rady (EHS) č. 1576/89 ze dne 29. května 1989, kterým se stanoví obecná pravidla pro definici, označování a obchodní úpravu lihovin [1], ve znění aktu o přistoupení Rakouska, Finska a Švédska, a zejména na čl. 4 odst. 8 uvedeného nařízení,

vzhledem k těmto důvodům:

(1) V příloze nařízení Komise (ES) č. 2870/2000 ze dne 19. prosince 2000, kterým se stanoví referenční metody Společenství používané pro rozbor lihovin [2], jsou popsány příslušné metody.

(2) Čtyři metody rozboru pro stanovení trans-anetholu v anýzových lihovinách, stanovení glycyrrhizové kyseliny a chalkonů v pastisu a vaječného žloutku ve vaječném likéru a v likéru s přídavkem vajec byly validovány podle mezinárodně uznávaných postupů v rámci výzkumného projektu podporovaného Komisí.

(3) Tyto čtyři metody lze uznat za referenční metody Společenství a musí být doplněny do nařízení (ES) č. 2870/2000.

(4) Opatření tohoto nařízení jsou v souladu se stanoviskem Prováděcího výboru pro lihoviny,

PŘIJALA TOTO NAŘÍZENÍ:

Článek 1

Příloha nařízení (ES) č. 2870/2000 se mění takto:

1. v obsahu přílohy se v kapitolách V, VI, VII a IX zrušují slova "(p.m.)";

2. za kapitolu III se vkládají kapitoly V, VI, VII a IX uvedené v příloze tohoto nařízení.

Článek 2

Toto nařízení vstupuje v platnost sedmým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

V Bruselu dne 26. listopadu 2002.

Za Komisi

Franz Fischler

člen Komise

[1] Úř. věst. L 160, 12.6.1989, s. 1.

[2] Úř. věst. L 333, 29.12.2000, s. 20.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA

V. ANETHOL. STANOVENÍ trans-ANETHOLU V LIHOVINÁCH PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. Oblast použití

Tato metoda je vhodná pro stanovení trans-anetholu v anýzových lihovinách kapilární plynovou chromatografií.

2. Odkazy na normy

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

3. Podstata metody

Koncentrace trans-anetholu v lihovině se stanoví plynovou chromatografií (GC). Ke zkušebnímu vzorku a k referenčnímu roztoku trans-anetholu o známé koncentraci se přidá stejné množství vnitřního standardu, např. 4-allylanisolu (estragolu), pokud vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu; zkušební roztok i referenční roztok se zředí 45 % roztokem ethanolu a přímo se nastříknou do plynového chromatografu. U likérů, které obsahují velké množství cukrů, je nezbytné provést extrakci před přípravou vzorku a rozborem.

4. Reakční činidla a materiál

Při rozboru se použijí pouze reakční činidla o čistotě nejméně 98 %. Použije se voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.

Referenční materiály se skladují v chladu (při 4 °C), chráněny před světlem, v hliníkových nádobách nebo tmavých (hnědých) skleněných reagenčních láhvích. Zátky by měly být překryty nejlépe hliníkovou fólií. Před použitím musí být krystalický anethol převeden táním do kapalné fáze, teplota však při tom nesmí v žádném případě překročit 35 °C.

4.1 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

4.2 1-methoxy-4-(prop-1-en-1-yl)benzen, (trans-anethol) (CAS 4180-23-8).

4.3 4-allylanisol, (estragol) (CAS 140-67-0), doporučený vnitřní standard (IS).

4.4 Ethanol o 45 % objemových

K 378 g ethanolu o 96 % objemových se přidá 560 g destilované vody.

4.5 Příprava standardních roztoků

Všechny standardní roztoky se skladují při laboratorní teplotě (15 až 35 °C), chráněny před světlem, v hliníkových nádobách nebo tmavých (hnědých) skleněných reagenčních láhvích. Zátka by měla být překryta nejlépe hliníkovou fólií.

trans-Anethol a 4-allylanisol jsou prakticky nerozpustné ve vodě a před přidáním ethanolu o 45 % objemových (4.4) musí být rozpuštěny v malém množství ethanolu o 96 % objemových(4.1).

Zásobní roztoky musí být každý týden čerstvě připraveny.

4.5.1 Standardní roztok A

Zásobní roztok trans-anetholu (koncentrace: 2 g/l)

Do odměrné baňky na 20 ml se odváží 40 mg trans-anetholu (4.2) (nebo 400 mg do odměrné baňky na 200 ml, atd.). Přidá se malé množství ethanolu o 96 % objemových (4.1), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

4.5.2 Roztok vnitřního standardu B

Zásobní roztok vnitřního standardu, např. estragolu (koncentrace: 2 g/l)

Do odměrné baňky na 20 ml se odváží 40 mg estragolu (4.3) (400 mg do odměrné baňky na 200 ml, atd.). Přidá se malé množství ethanolu o 96 % objemových (4.1), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

4.5.3 Roztoky pro kontrolu linearity odezvy plamenově-ionizačního detektoru (FID)

Pro účely rozboru musí být kontrolována linearita odezvy FID, přičemž musí být zohledněn rozsah koncentrací trans-anetholu v lihovinách, který je 0 až 2,5 g/l. Při rozboru se neznámé vzorky lihovin, u nichž má být prováděn rozbor, ředí 10krát (8.3). Pro podmínky rozboru popsané v této metodě se následujícím způsobem připraví zásobní roztoky odpovídající těmto koncentracím trans-anetholu ve vzorku, u něhož má být prováděn rozbor: 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 a 0,25 g/l: do jednotlivých odměrných baněk na 20 ml se pipetou odměří 0,5, 1, 1,5, 2 a 2,5 ml zásobního roztoku A (4.5.1); do každé baňky se pipetou odměří 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

Jako roztok o koncentraci 0 g/l se použijí roztoky určené pro slepý pokus (8.4).

4.5.4 Standardní roztok C

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml standardního roztoku A (4.5.1), poté se přidají 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

5. Přístroje a vybavení

5.1 Kapilární plynový chromatograf vybavený plamenově-ionizačním detektorem (FID), integrátorem nebo jiným zařízením pro zpracování dat, které umožňuje měřit plochy píků nebo výšky píků, a automatickým dávkovačem nebo nezbytným zařízením pro ruční nástřik vzorku.

5.2 Nástřikový systém split/splitless

5.3 Kapilární kolona, například:

Délka: 50 m

Vnitřní průměr: 0,32 mm

Tloušťka filmu: 0,2 μm

Stacionární fáze: FFAP – zesítěný porézní modifikovaný TPA polyethylenglykol.

5.4 Obvyklé laboratorní vybavení: Kalibrované odměrné laboratorní sklo, analytické váhy (přesnost: ±0,1 mg).

6. Chromatografické podmínky

Typ kolony, její rozměry a chromatografické podmínky se zvolí tak, aby došlo k oddělení anetholu od vnitřního standardu a od jakýchkoli rušivých látek. Typické podmínky pro kolonu uvedenou jako příklad v bodě 5.3 jsou tyto:

6.1 Nosný plyn: helium p. a.

6.2 Průtok: 2 ml/min

6.3 Teplota nástřiku: 250 °C

6.4 Teplota detektoru: 250 °C

6.5 Teplotní podmínky pece: isotermní, 180 °C, doba analýzy (běhu) 10 minut

6.6 Nastřikovaný objem: 1 μl, dělicí poměr 1: 40.

7. Vzorky

Vzorky se skladují při laboratorní teplotě, chráněny před světlem a chladem.

8. Postup

8.1 Orientační zkouška vzorku na přítomnost estragolu

Pro ujištění, že vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu, se provede rozbor vzorku bez přídavku jakéhokoli vnitřního standardu. Obsahuje-li vzorek přirozené množství estragolu, musí být zvolen jiný vnitřní standard (například menthol).

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml vzorku, objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

8.2 Příprava neznámých vzorků

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml vzorku, poté se přidají 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

8.3 Roztok určený pro slepý pokus

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml roztoku vnitřního standardu B (4.5.2), objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

8.4 Test linearity

Před zahájením rozboru se zkontroluje linearita odezvy FID tak, že se třikrát po sobě proměří každý ze standardních roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).

Z hodnot ploch píků nebo výšek píků získaných z integrátoru pro každý nástřik se sestrojí graf závislosti poměru R na koncentraci jejich mateřského roztoku v g/l.

R; = výška nebo plocha píku trans-anetholu dělená výškou nebo plochou píku estragolu.

Měla by být získána lineární závislost.

8.5 Stanovení

V dále uvedeném pořadí se provede nástřik roztoku určeného pro slepý pokus (8.3), standardního roztoku C (4.5.4), jednoho ze standardních roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3), který bude sloužit jako vzorek pro řízení jakosti (může být zvolen podle pravděpodobné koncentrace trans-anetholu v neznámém vzorku) a pěti neznámých vzorků (8.2); po každých pěti neznámých vzorcích se nastříkne standard pro kontrolu linearity odezvy (řízení jakosti), aby byla potvrzena stabilita rozboru.

9. Výpočet odezvového faktoru

Změří se plochy píků (integrátorem nebo jiným systémem zpracování dat) nebo (ručně) výšky píků trans-anetholu a vnitřních standardů.

9.1 Výpočet odezvového faktoru (RFi)

Odezvový faktor se vypočte takto:

RFi = (Ci/(plochai nebo výškai))*((plochais nebo výškais)/Cis)

kde:

Ci je koncentrace trans-anetholu ve standardním roztoku A (4.5.1)

Cis je koncentrace vnitřního standardu ve standardním roztoku B (4.5.2)

plochai je plocha (nebo výška) píku trans-anetholu

plochais je plocha (nebo výška) píku vnitřního standardu

RFi se vypočte z pěti vzorků roztoku C (4.5.4).

9.2 Rozbor roztoků pro kontrolu linearity odezvy

Nastříknou se roztoky pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).

9.3 Rozbor vzorku

Nastříkne se roztok neznámého vzorku (8.2).

10. Výpočet výsledků

Vzorec pro výpočet koncentrace trans-anetholu zní takto:

ci=Cis*((plochai nebo výškai)/(plochais nebo výškais))*RFi

kde:

ci je neznámá koncentrace trans-anetholu

Cis je koncentrace vnitřního standardu v neznámém vzorku (4.5.2)

plochai nebo výškai je plocha nebo výška píku trans-anetholu

plochais nebo výškais je plocha nebo výška píku vnitřního standardu

RFi je odezvový faktor (vypočtený podle bodu 9.1)

Koncentrace trans-anetholu se vyjadřuje v gramech na litr na jedno desetinné místo.

11. Zabezpečení a řízení jakosti

Na chromatogramech musí být anethol oddělen od vnitřního standardu a od ostatních rušivých látek. Hodnota RFi se vypočte z výsledků pro pět po sobě jdoucích nástřiků roztoku C (4.5.4). Leží-li variační koeficient (CV % = (směrodatná odchylka/průměr)*100)) v intervalu ± 1 %, je průměrná hodnota RFi přijatelná.

Výše uvedený výpočet se použije pro výpočet koncentrace trans-anetholu ve vzorku pro řízení jakosti vybraného z roztoků pro kontrolu linearity odezvy (4.5.3).

Nacházejí-li se vypočtené průměrné výsledky z rozboru roztoků pro kontrolu linearity odezvy zvolených jako vzorky pro vnitřní řízení jakosti (IQC) v intervalu ± 2,5 % kolem jejich teoretické hodnoty, lze výsledky neznámých vzorků přijmout.

12. Zpracování vzorků lihovin obsahujících velké množství cukru a zpracování vzorků likérů před rozborem GC

Extrakce alkoholu z lihovin obsahujících velké množství cukru s cílem umožnit stanovení koncentrace trans-anetholu kapilární plynovou chromatografií.

12.1 Podstata metody

K alikvotnímu množství vzorku likéru se přidá vnitřní standard v koncentraci, která je srovnatelná s koncentrací analytu (trans-anetholu) v likéru. Poté se přidá fosforečnan sodný dodekahydrát a bezvodý síran amonný. Výsledná směs se dobře protřepe a ochladí, přičemž se vytvoří dvě fáze; horní alkoholová fáze se oddělí. Z této alkoholové fáze se odebere alikvot, který se zředí ethanolem o 45 % objemových (4.4) (Poznámka: na tomto stupni se nepřidává žádný vnitřní standard, neboť již byl přidán). U výsledného roztoku se provádí rozbor plynovou chromatografií.

12.2 Reakční činidla a materiál

Při extrakci se používají pouze reakční činidla o čistotě vyšší než 99 %.

12.2.1 Síran amonný bezvodý, (CAS 7783-20-2).

12.2.2 Hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát, (CAS 10039-32-4).

12.3 Přístroje a vybavení

Erlenmeyerovy baňky, dělicí nálevky, lednička.

12.4 Postup

12.4.1 Orientační zkouška vzorku na estragol

Pro ujištění, že vzorek neobsahuje přirozené množství estragolu, se provede extrakce roztoku pro slepý pokus (12.6.2) a rozbor se provede bez přídavku jakéhokoli vnitřního standardu. Obsahuje-li vzorek přirozené množství estragolu, musí být zvolen jiný vnitřní standard.

12.4.2 Extrakce

Do Erlenmeyerovy baňky se pipetou odměří 5 ml ethanolu o 96 % objemových (4.1), odváží se 50 mg vnitřního standardu (4.3) a přidá se 50 ml vzorku. Přidá se 12 g bezvodého síranu amonného (12.2.1) a 8,6 g hydrogenfosforečnanu sodného dodekahydrátu (12.2.2). Erlenmeyerova baňka se uzavře zátkou.

Baňka se alespoň 30 minut protřepává. Může být použita mechanická třepačka, nikoli však teflonové magnetické míchadlo, neboť teflon může adsorbovat malé množství analytu. Je třeba poznamenat, že se přidaná sůl nerozpustí beze zbytku.

Erlenmeyerova baňka uzavřená zátkou se umístí alespoň na dvě hodiny do ledničky (T < 5 °C).

Za tuto dobu se vytvoří dvě oddělené kapalné fáze a pevný zbytek. Alkoholová fáze by měla být čirá; v opačném případě se baňka opět umístí do ledničky, dokud nebude dosaženo úplného oddělení.

Poté, co se alkoholová fáze vyčeří, se opatrně odebere alikvot (např. 10 ml), aniž se poruší vodná fáze, převede se do tmavé ampulky a bezpečně se uzavře.

12.4.3 Příprava extrahovaného vzorku určeného k rozboru

Extrakt se nechá (12.4.2) temperovat na laboratorní teplotu.

Do odměrné baňky na 20 ml se pipetou odměří 2 ml temperované alkoholové fáze extrahovaného vzorku, objem se doplní ethanolem o 45 % objemových (4.4) a důkladně se promíchá.

12.5 Stanovení

Použije se postup uvedený v bodě 8.5.

12.6 Výpočet výsledků

Výsledky se vypočtou pomocí následujícího vzorce:

Ci = (mis/V)*(plochai/plochais)*RFi

kde:

mis je hmotnost vnitřního standardu (4.3) použitého v bodě 12.4.2 (v miligramech)

V je objem neznámého vzorku (50 ml)

RFi je odezvový faktor (9.1)

plochai je plocha píku trans-anetholu

plochais je plocha píku vnitřního standardu

Výsledky se vyjádří v gramech na litr na jedno desetinné místo.

12.7 Zabezpečení a řízení jakosti

Použije se postup uvedený výše v bodě 11.

13. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)

Statistické výsledky mezilaboratorního testu:

v následujících tabulkách jsou uvedeny hodnoty pro anethol.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |

Počet laboratoří | 16 |

Počet vzorků | 10 |

Analyt | anethol |

Pastis:

Vzorky | A | B | C | D | E | F |

Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 |

Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | 1 | 1 | 1 | 3 | — | — |

Počet zahrnutých výsledků | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 |

Střední hodnota g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 |

Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | — | — |

Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | — | — |

Mez opakovatelnosti (r) g/l | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | — | — |

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 |

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 |

Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 |

Druhy vzorků:

A pastis, neoznačené duplikáty

B pastis, neoznačené duplikáty

C pastis, neoznačené duplikáty

D pastis, neoznačené duplikáty

E pastis, jeden vzorek

F pastis, jeden vzorek.

Další anýzové lihoviny:

Vzorky | G | H | I | J |

Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 16 | 14 | 14 | 14 |

Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | — | 2 | 1 | 1 |

Počet zahrnutých výsledků | 32 | 28 | 28 | 28 |

Střední hodnota g/l | 0,7780,530 (*) | 1,742 | 0,351 | 0,599 |

Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 |

Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 |

Mez opakovatelnosti (r) g/l | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 |

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 |

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 |

Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 |

Druhy vzorků:

G ouzo, rozdělená úroveň (*)

H anýzová lihovina, neoznačené duplikáty

I anýzový likér, duplikátní vzorky

J anýzový likér, duplikátní vzorky.

VI. GLYCYRRHIZOVÁ KYSELINA. STANOVENÍ GLYCYRRHIZOVÉ KYSELINY VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. Oblast použití

Tato metoda je vhodná pro stanovení glycyrrhizové kyseliny v anýzových lihovinách vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Podle nařízení (EHS) č. 1576/89 musí lihoviny aromatizované anýzem, které jsou nazývány "pastis", obsahovat od 0,05 do 0,5 gramů glycyrrhizové kyseliny na litr.

2. Odkazy na normy

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

3. Podstata metody

Koncentrace glycyrrhizové kyseliny se stanoví vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s UV detekcí. Standardní roztok a zkušební vzorek se zfiltrují a samostatně se přímo nastříknou do systému HPLC.

4. Reakční činidla a materiál

Při rozboru se použijí pouze reakční činidla čistoty pro HPLC, čistý ethanol a voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.

4.1 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

4.2 Glycyrrhizát amonný, C42H62O16 · NH4 (amonná sůl glycyrrhizové kyseliny)

(Mol. hmotnost: 839,98) (CAS 53956-04-0): čistota alespoň 90 %

(Mol. hmotnost: glycyrrhizová kyselina 822,94).

4.3 Ledová octová kyselina, CH3COOH, (CAS 64-19-7).

4.4 Methanol, CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5 Ethanol o 50 % objemových

Příprava 1000 ml při 20 °C:

- ethanol o 96 % objemových (4.1): 521 ml

- voda (2.0): 511 ml.

4.6 Příprava elučních roztoků pro HPLC

4.6.1 Eluční roztok A (příklad)

80 (objemových) dílů vody (2.0)

20 (objemových) dílů octové kyseliny (4.3).

Eluční roztok se nechá pět minut odplynit.

Poznámka:

Pokud nebyla použitá voda filtrována přes mikrofiltr, doporučuje se zfiltrovat připravený eluční roztok přes filtr pro organická rozpouštědla s velikostí pórů 0,45 μm nebo menší.

4.6.2 Eluční roztok B

Methanol (4.4).

4.7 Příprava standardních roztoků

Všechny standardní roztoky musí být každé dva měsíce čerstvě připraveny.

4.7.1 Referenční roztok C

Do odměrné baňky na 100 ml se s přesností na 0,1 mg odváží 25 mg glycyrrhizátu amonného (4.2). Přidá se malé množství ethanolu o 50 % objemových (4.5) a glycyrrhizát amonný se rozpustí. Po jeho rozpuštění se objem doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5).

Roztok se zfiltruje přes filtr pro organická rozpouštědla.

4.7.2 Standardní roztoky pro kontrolu linearity odezvy přístroje

Pro přípravu zásobního roztoku o koncentraci 1,0 g/l se do odměrné baňky na 100 ml odváží s přesností na 0,1 mg 100 mg glycyrrhizátu amonného. Přidá se malé množství ethanolu o 50 % objemových (4.5) a glycyrrhizát amonný se rozpustí. Po jeho rozpuštění se objem doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5).

Připraví se nejméně čtyři další roztoky s koncentrací glycyrrhizátu amonného 0,05, 0,1, 0,25 a 0,5 g/l: do samostatných odměrných baněk na 100 ml se pipetou odměří 5 ml, 10 ml, 25 ml a 50 ml zásobního roztoku o koncentraci 1,0 g/l. Poté se objem roztoků doplní po rysku ethanolem o 50 % objemových (4.5) a roztoky se důkladně promíchají.

Všechny roztoky se zfiltrují přes filtr pro organická rozpouštědla.

5. Přístroje a vybavení

5.1 Separační systém

5.1.1 Vysokoúčinný kapalinový chromatograf.

5.1.2 Čerpadlo umožňující s velkou přesností dosáhnout a udržet konstantní nebo programovatelný průtok.

5.1.3 Spektrofotometrický detekční systém s UV detekcí: nastavený na 254 nm.

5.1.4 Systém pro odplynění rozpouštědla.

5.2 Integrátor nebo zapisovač s výpočetním zařízením, provozně kompatibilní se zbytkem systému.

5.3 Kolona (příklad):

Materiál: korozivzdorná ocel nebo sklo

Vnitřní průměr: 4 až 5 mm

Délka: 100 až 250 mm

Stacionární fáze: zesítěný polymerně vázaný oktadecyl (C18) na silikagelu (přednostně sférickém), maximální velikost částic: 5 μm.

5.4 Laboratorní vybavení

5.4.1 Analytické váhy s přesností na 0,1 mg

5.4.2 Odměrné sklo třídy A

5.4.3 Zařízení pro membránovou mikrofiltraci malých objemů.

6. Chromatografické podmínky

6.1 Eluční charakteristiky: (příklad)

- průtok: 1 ml/min,

- eluční roztok A = 30 %,

- eluční roztok B = 70 %.

6.2 Detekce:

- UV = 254 nm.

7. Postup

7.1 Příprava vzorku lihoviny

Podle potřeby se zfiltruje přes filtr pro organická rozpouštědla (průměr pórů: 0,45 μm).

7.2 Stanovení

Po ustavení chromatografických podmínek se provede

- nástřik 20 μl referenčního roztoku C (4.7.1),

- nástřik 20 μl roztoku vzorku,

- a oba chromatogramy se porovnají. Píky glycyrrhizové kyseliny se identifikují podle jejich retenčních časů. Změří se jejich plochy (nebo výšky) a z následující rovnice se vypočte koncentrace v g/l na dvě desetinná místa:

c =

c ×h × P × 823H × 100 × 840

kde:

c je koncentrace glycyrrhizové kyseliny v gramech na litr analyzované lihoviny

C je koncentrace glycyrrhizátu amonného v referenčním roztoku v gramech na litr

h je plocha (nebo výška) píku glycyrrhizové kyseliny v analyzované lihovině

H je plocha (nebo výška) píku glycyrrhizové kyseliny v referenčním roztoku

P je čistota referenčního glycyrrhizátu amonného (v %)

823 je molární hmotnost glycyrrhizové kyseliny

840 je molární hmotnost glycyrrhizátu amonného

8. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)

Statistické výsledky mezilaboratorního testu:

v následující tabulce jsou uvedeny hodnoty pro glycyrrhizovou kyselinu.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |

Počet laboratoří | 16 |

Počet vzorků | 5 |

Analyt | glycyrrhizová kyselina |

Vzorky | A | B | C | D | E |

Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 |

Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | 3 | 2 | 1 | — | — |

Počet zahrnutých výsledků | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 |

Střední hodnota g/l | 0,046 | 0,092(*) 0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 |

Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 |

Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 |

Mez opakovatelnosti (r) g/l | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 |

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 |

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 |

Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 |

Druhy vzorků:

A pastis, neoznačené duplikáty

B pastis, rozdělená úroveň (*)

C pastis, neoznačené duplikáty

D pastis, neoznačené duplikáty

E pastis, neoznačené duplikáty.

VII. CHALKONY. METODA PRO POTVRZENÍ PŘÍTOMNOSTI CHALKONŮ V PASTISU VYSOKOÚČINNOU KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1. Oblast použití

Touto metodou lze zjistit, zda jsou v anýzových lihovinách přítomny chalkony. Chalkony jsou přírodní barviva ze skupiny flavonoidů přítomná v kořenu lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra).

Anýzové lihoviny mohou být nazývány "pastis", pokud obsahují chalkony (podle nařízení (EHS) č. 1576/89).

2. Odkazy na normy

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

3. Podstata metody

Připraví se referenční výtažek lékořice. Přítomnost nebo nepřítomnost chalkonů se zjistí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s UV detekcí.

4. Reakční činidla a materiál

Při rozboru se použijí pouze činidla čistoty pro HPLC. Použije se ethanol o 96 % objemových. Použije se pouze voda o čistotě alespoň 3 podle normy ISO 3696.

4.1 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

4.2 Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8).

4.3 Referenční látka: Lékořice lysá (Glycyrrhiza glabra): lékořice, "sladký kořen"

Hrubě nadrcené kořeny lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra). Průměrné rozměry podlouhlých částic: délka: 10 až 15 mm, tloušťka: 1 až 3 mm.

4.4 Octan sodný, CH3COONa, (CAS 127-09-3).

4.5 Ledová octová kyselina, CH3COOH, (CAS 64-19-7).

4.6 Příprava roztoků

4.6.1 Ethanol o 50 % objemových.

Příprava 1000 ml při 20 °C:

- ethanol o 96 % objemových (4.1): 521 ml,

- Voda (2.0): 511 ml.

4.6.2 Eluční roztok A: acetonitril

Acetonitril (4.2) čistoty pro HPLC.

Odplynit

4.6.3 Eluční roztok B: Pufr 0,1M roztok octanu sodného, pH 4,66.

Do odměrné baňky se odváží 8,203 g octanu sodného (4.4), přidá se 6,005 g ledové octové kyseliny (4.5) a objem se doplní vodou (2) do 1000 ml.

5. Příprava referenčního extraktu z lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra) (4.3)

5.1 Odváží se 10 g drceného kořene lékořice lysé (Glycyrrhiza glabra) (4.3) a vpraví se do destilační baňky s kulatým dnem,

- přidá se 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1),

- vaří se pod zpětným chladičem jednu hodinu,

- zfiltruje se,

- a filtrát se uchová pro pozdější použití.

5.2 Zbytek po filtraci extraktu z lékořice se oddělí z filtru

- vpraví se do destilační baňky s kulatým dnem,

- přidá se 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1),

- vaří se pod zpětným chladičem jednu hodinu,

- zfiltruje se. Filtrát se uchová pro pozdější použití.

5.3 Extrakce kořene lékořice se provede třikrát po sobě.

5.4 Tři filtráty se spojí.

5.5 Rozpouštědlová fáze (z filtrátu v bodě 5.4) se odpaří na rotační odparce.

5.6 Zbylý extrakt (z úkonu v bodě 5.5) se rozpustí v 100 ml ethanolu o 50 % objemových (4.6.1).

6. Přístroje a vybavení

6.1 Separační systém.

6.1.1 Vysokoúčinný kapalinový chromatograf.

6.1.2 Čerpadlo umožňující dosáhnout a udržet konstantní nebo programovatelný průtok při vysokém tlaku.

6.1.3 Spektrofotometrický detekční systém s UV/Vis detekcí nastavitelný na 254 a 370 nm.

6.1.4 Systém pro odplynění rozpouštědla.

6.1.5 Kolonový termostat nastavitelný na teplotu 40 ± 0,1 °C.

6.2 Integrátor nebo zapisovač s výpočetním zařízením, provozně kompatibilní se zbytkem separačního systému.

6.3 Kolona

Materiál: korozivzdorná ocel nebo sklo

Vnitřní průměr: 4 až 5 mm

Stacionární fáze: zesítěný polymerně vázaný oktadecyl (C18) na silikagelu, velikost částic: nejvýše 5 μm (zesítěná fáze).

6.4 Obvyklé laboratorní vybavení včetně:

6.4.1 analytických vah (přesnost: ± 0,1 mg);

6.4.2 destilační aparatury se zpětným chladičem skládající se například:

- z destilační baňky s kulatým dnem na 250 ml s normalizovaným zábrusem,

- zpětného chladiče o délce 30 cm a

- zdroje tepla (pyrogenní reakci destilovaného materiálu musí být zabráněno vhodným prvkem).

6.4.3 Rotační odparka.

6.4.4 Filtrační zařízení (např. Büchnerova nálevka).

6.5 Chromatografické podmínky (příklad).

6.5.1 Eluční charakteristiky rozpouštědel A (4.6.2) a B (4.6.3):

- gradientová změna z 20/80 (V/V) na 50/50 (V/V) během 15 minut,

- gradientová změna z 50/50 (V/V) na 75/25 (V/V) během pěti minut,

- isokratická eluce při 75/25 (V/V) pět minut,

- stabilizace kolony mezi nástřiky,

- isokratická eluce při 20/80 (V/V) po dobu pěti minut,

6.5.2 Průtok: 1 ml/min.

6.5.3 Nastavení UV detektoru:

detektor musí být nastaven na 370 nm pro detekci chalkonů a poté na 254 nm pro detekci glycyrrhizové kyseliny.

Poznámka:

změna vlnové délky (z 370 nm na 254 nm) musí být provedena 30 sekund před začátkem eluce píku odpovídajícího glycyrrhizové kyselině.

7. Postup

7.1 Příprava vzorku lihoviny

Zfiltruje se přes filtr pro organická rozpouštědla (průměr pórů: 0,45 μm).

7.2 Příprava zbytkového extraktu z lékořice (5.6)

Extrakt se před rozborem zředí ethanolem o 50 % objemových (4.6.1) v poměru jedna ku deseti.

7.3 Stanovení

7.3.1 Nastříkne se 20 μl připraveného extraktu z lékořice (7.2). Provede se rozbor za za výše uvedených chromatografických podmínek (6.5).

7.3.2 Nastříkne se 20 μl vzorku (7.1) (vzorek anýzové lihoviny). Provede se rozbor za výše uvedených chromatografických podmínek (6.5).

7.3.3 Oba chromatogramy se porovnají. Oba chromatogramy si musí být velmi podobné v oblasti eluce chalkonů (detekce při 370 nm za výše popsaných podmínek rozboru) (viz obrázek 1).

8. Charakteristický chromatogram pastisu

+++++ TIFF +++++

9. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)

Výsledky mezilaboratorního testu:

v následující tabulce jsou uvedeny výsledky zjišťování přítomnosti chalkonů v pastisu a v anýzových lihovinách.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |

Počet laboratoří | 14 |

Počet vzorků | 11 |

Analyt | chalkony |

Vzorky | A | B | C | D | E | F |

Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 |

Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | — | — | — | — | — | 1 [1] |

Počet zahrnutých výsledků | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | 26 |

Počet výsledků: chalkony nalezeny | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 |

Počet výsledků: chalkony nenalezeny | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 |

Počet správných výsledků (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Vzorky | G | H | I | J | K |

Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 |

Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | — | — | — | — | — |

Počet zahrnutých výsledků | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |

Počet výsledků: chalkony nalezeny | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |

Počet výsledků: chalkony nenalezeny | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 |

Počet správných výsledků (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Druhy vzorků:

A pastis, neoznačené duplikáty

B pastis, jeden vzorek

C pastis, jeden vzorek

D "pastis" (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty

E "pastis" (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty

F anýzový likér (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty

G anýzový likér (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty

H ouzo (neobsahující chalkony), jeden vzorek

I ouzo (neobsahující chalkony), jeden vzorek

J anýzová lihovina (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty

K "pastis" (neobsahující chalkony), neoznačené duplikáty.

IX. VAJEČNÝ ŽLOUTEK. STANOVENÍ KONCENTRACE VAJEČNÉHO ŽLOUTKU V LIHOVINÁCH – FOTOMETRICKÁ METODA

1. Oblast použití

Tato metoda je vhodná pro stanovení koncentrace vaječného žloutku v rozsahu od 40 do 250 g/l ve vaječném likéru a v likéru s přídavkem vajec.

2. Odkazy na normy

ISO 3696: 1987, Voda pro použití v analytických laboratořích – Specifikace a zkušební metody.

3. Podstata metody

Extrahují se sloučeniny fosforu obsažené ve vaječném žloutku, které jsou rozpustné v ethanolu, a stanoví se fotometricky jako fosfato-molybdenanový komplex.

4. Reakční činidla a materiál

4.1 Redestilovaná voda.

4.2 Křemelina.

4.3 Ethanol o 96 % objemových (CAS 64-17-5).

4.4 15 % roztok octanu hořečnatého (CAS 16674-78-5).

4.5 10 % kyselina sírová (CAS 7664-93-9).

4.6 1N kyselina sírová.

4.7 Roztok dihydrogenfosforečnanu draselného (CAS 778-77-0), KH2PO4 o koncentraci 0,16 g/l.

4.8 Reakční činidla pro stanovení fosforečnanů:

20 g molybdenanu amonného (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24 · 4H2O se rozpustí ve 400 ml vody při 50 °C;

v jiné nádobě se rozpustí 1 g vanadičnanu amonného (CAS 7803-55-6), NH4VO3, v 300 ml horké vody, roztok se nechá vyhladnout a poté se přidá 140 ml koncentrované kyseliny dusičné (CAS 7697-37-2). Vychladlé roztoky se spojí v odměrné baňce na 1000 ml a objem se doplní po rysku 1000 ml.

5. Přístroje a vybavení

5.1 Erlenmeyerova baňka na 100 ml

5.2 Ultrazvuková lázeň (nebo magnetická míchačka)

5.3 Odměrná baňka na 100 ml

5.4 Vodní lázeň temperovaná na 20 °C

5.5 Filtr (Whatman č. 4 nebo rovnocenný)

5.6 Porcelánový (nebo platinový) kelímek

5.7 Vroucí vodní lázeň

5.8 Topná deska

5.9 Muflová pec

5.10 Odměrná baňka na 50 ml

5.11 Odměrná baňka na 20 ml

5.12 Spektrofotometr nastavený na 420 nm

5.13 1cm kyveta.

6. Vzorky

Vzorky se před rozborem uchovávají při laboratorní teplotě.

7. Postup

7.1 Příprava vzorku

7.1.1 Do Erlenmeyerovy baňky (5.1) na 100 ml se odváží 10 g vzorku.

7.1.2 Postupně po malých dávkách se přidá 70 ml ethanolu (4.3), přičemž se při každém přídavku intenzivně míchá, a roztok se umístí na 15 minut do ultrazvukové lázně (5.2) (nebo se při laboratorní teplotě míchá 10 minut na magnetické míchačce (5.2)).

7.1.3 Obsah Erlenmeyerovy baňky se převede za současného vyplachování ethanolem (4.3) do odměrné baňky na 100 ml (5.3). Objem se doplní ethanolem (4.3) po rysku a baňka se umístí do vodní lázně temperované na 20 °C (5.4). Objem se doplní po rysku při 20 °C.

7.1.4 Přidá se malé množství křemeliny (4.2) a roztok se zfiltruje (5.5); prvních 20 ml se odstraní.

7.1.5 25 ml filtrátu se převede do porcelánového (nebo platinového) kelímku (5.6). Filtrát se poté musí za přídavku 5 ml 15 % roztoku octanu hořečnatého (4.4) zkoncentrovat opatrným odpařováním na vroucí vodní lázni (5.7).

7.1.6 Kelímky se umístí na topnou desku (5.8) a zahřívají se, dokud se obsah neodpaří právě do sucha.

7.1.7 Zbytek se zpopelní a žíhá v muflové peci (5.9) při 600 °C do bílého popela nejméně jednu a půl hodiny, může se však také žíhat přes noc.

7.1.8 Popel se spolu s oplachovou destilovanou vodou převede pomocí 10 ml 10 % kyseliny sírové (4.5) do odměrné baňky na 50 ml (5.10) a objem se při laboratorní teplotě doplní po rysku destilovanou vodou (4.1). 5ml alikvot tohoto roztoku popela se použije k přípravě roztoku pro stanovení fosforečnanů fotometricky.

7.2 Stanovení fosforečnanů fotometricky

7.2.1 Srovnávací roztok

7.2.1.1 Do odměrné baňky na 50 ml (5.10) se odměří 10 ml 10 % kyseliny sírové (4.5) a objem se doplní po rysku destilovanou vodou (4.1).

7.2.1.2 K 5ml alikvotu tohoto roztoku (7.2.1.1) se v odměrné baňce na 20 ml (5.11) přidá 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní do 20 ml destilovanou vodou (4.1).

7.2.1.3 Baňka se volně uzavře zátkou, protřepe a zahřívá se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4).

7.2.1.4 Tímto srovnávacím roztokem se naplní 1cm kyveta (5.13).

7.2.2 Roztok vzorku

7.2.2.1 K 5ml alikvotu roztoku popela (7.1.8) se v odměrné baňce na 20 ml (5.11) přidá 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní do 20 ml destilovanou vodou (4.1).

7.2.2.2 Baňka se volně uzavře zátkou, protřepe a zahřívá se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4).

7.2.2.3 Vznikne žlutý roztok, který se ihned proměří spektrofotometricky (5.12) v 1cm kyvetě (5.13) při 420 nm proti srovnávacímu roztoku (7.2.1.4).

7.2.3 Kalibrační křivka

7.2.3.1 Za účelem sestrojení kalibrační křivky se do odměrných baněk na 20 ml (5.11) obsahujících po 1 ml 1N kyseliny sírové (4.6) a jednotlivě 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml dihydrogenfosforečnanu draselného (4.7) přidá po 2 ml činidla pro stanovení fosforečnanů (4.8) a objem se doplní po 20ml rysku destilovanou vodou (4.1).

7.2.3.2 Baňky se volně volně uzavřou zátkou, protřepou se a zahřívají se 10 minut ve vroucí vodní lázni (5.7), poté se 20 minut chladí ve vodní lázni temperované na 20 °C (5.4) a proměří se spektrofotometricky (5.12) v 1cm kyvetě (5.13) při 420 nm proti srovnávacímu roztoku (7.2.1.4).

7.2.3.3 Sestrojení kalibrační křivky:

roztok dihydrogenfosforečnanu (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |

P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 |

8. Vyjádření výsledků

Obsah vaječného žloutku v g/l se vypočte pomocí tohoto vzorce:

g/l vaječný žloutek = mg P

O

×

110 × hustotaE/40

kde:

110 přepočítávací faktor pro celkový obsah P2O5 v gramech ve 100 g vaječného žloutku

mg P2O5 hodnota odečtená z kalibrační křivky

hustota hmotnost vztažená na jednotku objemu likéru obsahujícího vaječný žloutek při 20 °C (g/ml)

E hmotnost likéru obsahujícího vaječný žloutek v g

40 faktor ředění 5ml alikvotu roztoku popela.

9. Pracovní charakteristiky metody (přesnost)

Statistické výsledky mezilaboratorního testu:

v následující tabulce jsou uvedeny hodnoty pro vaječný žloutek.

Následující údaje byly získány při mezinárodním mezilaboratorním experimentu zaměřeném na parametry metody prováděném mezinárodně dohodnutým postupem.

Rok provedení mezilaboratorního testu | 1998 |

Počet laboratoří | 24 |

Počet vzorků | 5 |

Analyt | vaječný žloutek |

Vzorky | A | B | C | D | E |

Počet zahrnutých laboratoří po vyloučení odlehlých výsledků | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 |

Počet odlehlých výsledků (laboratoří) | 3 | 4 | 2 | 4 | 2 |

Počet zahrnutých výsledků | 38 | 40 | 44 | 40 | 44 |

Střední hodnota g/l | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9 (*)72,8 (*) | 191,1 |

Směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 |

Relativní směrodatná odchylka za podmínek opakovatelnosti (RSDr) (%) | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 |

Mez opakovatelnosti (r) g/l | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 |

Směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (SR) g/l | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 |

Relativní směrodatná odchylka reprodukovatelnosti (RSDR) (%) | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 |

Mez reprodukovatelnosti (R) g/l | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 |

Druhy vzorků

A Advocaat, neoznačené duplikáty

B Advocaat, neoznačené duplikáty

C Advocaat, neoznačené duplikáty

D Advocaat (zředěný), rozdělená úroveň (*)

E Advocaat, neoznačené duplikáty

[1] Nekonzistentní výsledky mezi dvěma duplikátními vzorky způsobené chybou při odběru.

--------------------------------------------------