32001D0183Rozhodnutí Komise ze dne 22. února 2001, kterým se stanoví plány odběru vzorků a diagnostických metod pro zjišťování a potvrzování některých nákaz ryb a kterým se zrušuje rozhodnutí 92/532/EHS (oznámeno pod číslem K (2001) 426)Text s významem pro EH

Rozhodnutí Komise

ze dne 22. února 2001,

kterým se stanoví plány odběru vzorků a diagnostických metod pro zjišťování a potvrzování některých nákaz ryb a kterým se zrušuje rozhodnutí 92/532/EHS

(oznámeno pod číslem K (2001) 426)

Text s významem pro EHP

(2001/183/ES)

KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,

s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,

s ohledem na směrnici Rady 91/67/EHS ze dne 28. ledna 1991 o veterinárních předpisech pro uvádění živočichů pocházejících z akvakultury a produktů akvakultury na trh [1], naposledy pozměněnou směrnicí 98/45/ES [2], a zejména na článek 15 uvedené směrnice,

vzhledem k těmto důvodům:

(1) plány odběru vzorků a diagnostické metody pro zjišťování a potvrzování některých nákaz ryb byly stanoveny v rozhodnutí Komise 92/532/EHS [3] ve znění rozhodnutí Komise 96/240/ES [4];

(2) od doby přijetí rozhodnutí 92/532/EHS došlo k novému praktickému a vědeckému vývoji a směrnice 91/67/EHS byla pozměněna. To vyžaduje aktualizaci plánů odběru vzorků a diagnostických metod;

(3) takováto aktualizace se vztahuje k vyšetření a identifikaci virů způsobujících virovou hemoragickou septikémii (VHS) a infekční nekrózu krvetvorné tkáně (IHN) a k úpravám v souladu s posledními změnami směrnice 91/67/EHS;

(4) byla konzultována referenční laboratoř Společenství pro nákazy ryb zřízená směrnicí Rady 93/53/EHS [5];

(5) plány odběru vzorků a diagnostické metody pro zjišťování a potvrzování některých nákaz ryb zavedené směrnicí 92/532/EHS musejí být z důvodu srozumitelnosti zrušeny;

(6) opatření tohoto rozhodnutí jsou v souladu se stanoviskem Stálého veterinárního výboru,

PŘIJALA TOTO ROZHODNUTÍ:

Článek 1

Plány odběru vzorků a diagnostické metody pro zjišťování a potvrzování virové hemoragické septikémie (VHS) a infekční nekrózy krvetvorné tkáně (IHN) jsou stanoveny v příloze.

Článek 2

Rozhodnutí 92/532/EHS se tímto rozhodnutím zrušuje.

Článek 3

Toto rozhodnutí je určeno členským státům.

V Bruselu dne 22. února 2001.

Za Komisi

David Byrne

člen Komise

[1] Úř. věst. L 46, 19.2.1991, s. 1.

[2] Úř. věst. L 189, 3.7.1998, s. 12.

[3] Úř. věst. L 337, 21.11.1992, s. 18.

[4] Úř. věst. L 79, 29.3.1996, s. 19.

[5] Úř. věst. L 175, 19.7.1993, s. 23.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA

PLÁNY ODBĚRU VZORKŮ A DIAGNOSTICKÉ METODY PRO ZJIŠŤOVÁNÍ A POTVRZOVÁNÍ VIROVÉ HEMORAGICKÉ SEPTIKÉMIE (VHS) A INFEKČNÍ NEKRÓZY KRVETVORNÉ TKÁNĚ (IHN).

ÚVOD

Tato příloha:

a) obsahuje zásady a minimální požadavky na plány odběru vzorků a diagnostické metody pro zjišťování a potvrzování virové hemoragické septikémie (VHS) a infekční nekrózy krvetvorné tkáně (IHN),

b) zahrnuje ustanovení příloh B a C a směrnice 91/67/EHS pro schvalování a udržení statusu oblastí a hospodářství v neschválených oblastech,

c) stanovuje předpisy pro řádnou diagnózu VSH a IHN a úřední uznávání statusu oblastí a hospodářství v neschválených oblastech v souladu s články 5 a 6 směrnice 91/67/EHS;

d) je určena jak pro orgány odpovědné za zdolávání VHS a IHN, tak pro laboratorní personál provádějící testy na tyto nákazy. Proto je důraz kladen na postupy odběru vzorků, zásady a použití laboratorních testů a hodnocení jejich výsledků, jakož i podrobné laboratorní postupy. Avšak ve vhodných případech mohou laboratoře modifikovat testy popsané v této příloze či použít odlišné testy, pokud může být prokázána rovnocenná citlivost a specifičnost.

Část I obsahuje plány odběru vzorků a diagnostické metody pro dozor nad VHS a IHN, aby byl získán a udržen schválený status oblasti či hospodářství v neschválené oblasti.

Část II popisuje diagnostické postupy pro potvrzení VHS a IHN v případě podezření.

Část III stanovuje kritéria a zásady pro program úřední kontroly zdravotní nezávadnosti prokazující nepřítomnost VHS a/nebo IHN.

Část IV obsahuje doporučený postup pro titraci virů VHS a IHN za účelem ověření citlivosti buněčných kultur na infekci.

Akronymy a zkratky jsou obsaženy v části V.

ČÁST I Plány odběru vzorků a diagnostické metody dozoru nad VHS a IHN za účelem získání a udržení schváleného statusu oblasti nebo hospodářství v neschválené oblasti.

I. Kontroly a odběr vzorků

1. Obecná ustanovení o klinické kontrole zdravotní nezávadnosti, sběru a výběru vzorků pro dozor nad oblastmi nebo hospodářstvími v neschválených oblastech za účelem dosažení a udržení schváleného statutu pro VHS a/nebo IHN.

Klinické kontroly zdravotní nezávadnosti a odběr vzorků tkáně ryb a/nebo ovariální kapaliny prováděný v oblastech či v hospodářstvích v neschválených oblastech za účelem dosažení či udržení schváleného statusu pro VHS a/nebo IHN v souladu s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS jsou shrnuty v tabulkách 1A, 1B a 1C. Další podrobnosti jsou stanoveny v částech I.I.2 až I.I.4. Tabulky 1A a 1B neplatí pro nová hospodářství a hospodářství, které obnovují činnost s rybami, jikrami či gametami ze schválené oblasti či schváleného hospodářství v neschválené oblasti, pokud splňují požadavky stanovené ve směrnici 91/67/EHS, příloze C, části I.A.6 písm. a) nebo I.A.6 písm. b) nebo II.A.3 písm. a) nebo II.A.3 písm. b).

Klinické kontroly musejí být prováděny od října do června nebo po dobu, kdy je teplota vody nižší než 140 °C. Pokud mají být hospodářství podrobena klinickým kontrolám alespoň dvakrát ročně, musejí být intervaly mezi kontrolami minimálně čtyři měsíce. Všechny výrobní jednotky (rybníky, nádrže, síťové klece atd.) musejí být kontrolovány, jestli se zde nenacházejí mrtvé, slabé či abnormálně se chovající ryby. Zvláštní pozornost musí být věnována oblasti odtoku vody, kde se zpravidla shromažďují slabé ryby, protože zde proudí voda.

Ryby jako vzorky se vyberou takto:

- Pokud jsou přítomni pstruzi duhoví, měly by být pro odběr vzorků vybírány pouze ryby tohoto druhu. Pokud pstruzi duhoví přítomni nejsou, musí být vzorek získán z ryb všech ostatních přítomných druhů náchylných na VHSV a/nebo IHNV (podle přílohy A směrnice 91/67/EHS). Druhy musí být ve vzorku zastoupeny poměrně.

- Pokud je pro produkci ryb využíván více než jeden vodní zdroj, musejí být do vzorku zahrnuty ryby reprezentující všechny vodní zdroje.

- Pokud jsou přítomny slabé, abnormálně se chovající či čerstvě uhynulé (nerozkládající se) ryby, musejí být vybrány převážně takovéto ryby. Pokud takovéto ryby přítomny nejsou, musí vzorek zahrnovat normálně vypadající, zdravé ryby vybrané takovým způsobem, aby ve vzorku byly poměrně zastoupeny všechny části hospodářství a všechny ročníky.

2. Zvláštní ustanovení včetně odběru vzorků pro dozor nad oblastmi nebo hospodářství v neschválených oblastech za účelem dosažení nebo udržení schváleného statusu pro VHS a/nebo IHN.

1. Oblast nebo hospodářství v neschválené oblasti, která je pod úředním dohledem, může získat schválený status pro VHS a/nebo IHN takto:

a) Model "A" – dvouletý program dohledu

Poté, co se po nejméně dva roky nevyskytly žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN, musejí být všechna hospodářství v oblasti či jakékoli hospodářství v neschválené oblasti, které mají být schváleny, kontrolovány dvakrát ročně po dobu dvou let. Během tohoto dvouletého kontrolního období před prvním schválením se nesmějí vyskytnout žádné klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro testy musejí být odebrány podle tabulky 1A. Vzorky musejí být vybrány, připraveny a zkontrolovány podle částí I.I až I.IV a nálezy laboratorních testů na VHS a/nebo IHN musejí být negativní; nebo

b) Model "B" – dvouletý program dohledu se sníženým množstvím vzorků

Podle úředního programu kontroly zdravotní nezávadnosti, který prokáže, že se v posledních čtyřech letech nevyskytla VHS a/nebo IHN, musejí být všechna hospodářství v oblasti nebo jakékoli hospodářství v neschválené oblasti, které mají být schváleny, kontrolována z hlediska zdravotní nezávadnosti dvakrát ročně po dobu dvou let. Během tohoto dvouletého období, které předchází získání schválení, se nesmějí vyskytnout klinické či jiné příznaky VHS a/nebo IHN a vzorky pro kontrolu musejí být odebrány podle tabulky 1B. Dále musejí být vzorky vybrány, připraveny a vyšetřeny dle popisu v částech I.I až I.IV a laboratorní zkoušky na přítomnost VHS a/nebo IHN musí vykázat negativní výsledky. Aby mohl být program kontroly zdravotní nezávadnosti uznán úředními útvary jako důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN, musí splňovat kritéria a zásady stanovené v části III.

2. Zvláštní ustanovení pro schválení nových hospodářství nebo hospodářství, které obnovují činnost s rybami, jikrami nebo gametami ze schválené oblasti nebo ze schváleného hospodářství v neschválené oblasti.

Nová hospodářství nebo hospodářství, které obnovují činnost s rybami, jikrami nebo gametami ze schválené oblasti nebo ze schváleného hospodářství v neschválené oblasti, mohou získat status podle požadavků směrnice 91/67/EHS přílohy C oddílu I písm. A bodu 6 písm. a)/písm. b) nebo oddílu II písm. A bodu 3 písm. a)/písm. b). Předpisy o odběru vzorků, stanovené výše v modelech A a B (částech I.I.2.1 písm. a) a I.I.2.1 písm. b) proto pro tato hospodářství neplatí.

3. Program dohledu pro udržení schváleného statusu pro VHS a/nebo IHN.

K udržení statusu schválené oblasti či hospodářství v neschválené oblasti pro VHS a/nebo IHN musejí být kontroly a odběr vzorků pro testy prováděny podle tabulky 1C. Vzorky musí být vybírány, připraveny a testovány dle popisu v částech I.I. až I.IV a laboratorní zkoušky na VHS a/nebo IHN musejí být negativní.

3. Příprava a zaslání vzorků ryb

Před zasláním či přepravou do kontrolní laboratoře musí být rybě sterilními resekčními nástroji odebrány orgány, které musejí být uloženy do sterilních plastových trubiček obsahujících transportní médium (médium buněčných kultur s 10 % telecím sérem a antibiotiky). Doporučuje se směs 200 IE penicilinu, 200 μg streptomycinu a 200 μg kanamycinu na ml; mohou být však použita také jiná vyzkoušená antibiotika. Zkoumají se slezina, přední ledvina a srdce nebo mozek. V některých případech musí být vyšetřena též ovariální tekutina (tabulky 1A až C).

Ovariální tekutina nebo části orgánů maximálně deseti ryb (tabulky 1 A až C) mohou být naplněny do jedné sterilní trubičky obsahující minimálně 4 ml transportního média a reprezentují jeden společný vzorek. Každý vzorek tkáně by měl vážit nejméně 0,5 g.

Trubičky by měly být umístěny do izolačních nádob (např. polystyrenových krabic se silnými stěnami), které obsahují dostatečné množství ledu nebo chladících prvků, aby bylo zajištěno chlazení vzorků během přepravy do laboratoře. Je třeba se vyhnout zmrazení. Během transportu by neměla teplota vzorku překročit 10 0C, a při příjezdu by v transportní nádobě měl být ještě přítomen led nebo minimálně jeden chladící prvek musí být úplně případně částečně zmrzlý.

S virologickými testy je třeba začít co nejdříve, nejpozději 48 hodin po odběru vzorků. Ve výjimečných případech [1] se může začít s virologickým průzkumem do 72 hodin po odběru materiálu, pokud byl výzkumný materiál chráněn transportním médiem a během transportu byly splněny teplotní požadavky (bod I.I.3 odstavec 3).

Celé ryby mohou být zasílány do laboratoře, pokud mohou být během transportu splněny teplotní požadavky. Celá ryba může být zabalena do savého papíru a nakonec musí být zaslána v plastovém sáčku a musí být chlazena, jak je popsáno výše. Ryby mohou být zasílány i živé.

Zásilky je třeba zabalit a opatřit štítkem podle platných vnitrostátních a mezinárodních dopravních předpisů.

4. Odběr doplňkového diagnostického materiálu

Podle dohody s dotyčnou diagnostickou laboratoří může být odebrán dodatečný tkáňový materiál a připraven pro další výzkum.

II. Příprava vzorků pro virologické vyšetření

1. Zmrazení ve výjimečných případech

Pokud se vyskytnou praktické problémy (např. špatné počasí, svátky, problémy v laboratoři, atd.), které znemožní očkování buněk během 48 hodin po odběru vzorků tkáně, mohou být vzorky tkáně v médiu buněčných kultur zmraženy při minimálně –20 °C a virologický test může být proveden během příštích 14 dnů. Tkáň smí být však zmražena a před testem opět rozmražena pouze jednou. O důvodech zmražení tkáňových vzorků (např. bouře, odumřelé buněčné linie atd.) je třeba vést podrobné záznamy.

2. Homogenizace orgánů

V laboratoři je úplně homogenizován vzorek tkáně (stomacherem, mixérem nebo hmoždířem a paličkou se sterilním pískem) a poté suspendován v původním transportním médiu.

Pokud se jedná o vzorek celé ryby kratší než 4 cm, měl by být připraven s pomocí sterilních nůžek nebo sterilního skalpelu po odstranění části těla, která se nachází za střevním otvorem. Pokud se jedná o vzorek z celé ryby o délce 4 až 6 cm, měly by být vyňaty vnitřnosti včetně ledvin. Pokud se jedná o vzorek z celé ryby o délce více než 6 cm, měly by být odňaty vzorky tkáně, jak je popsáno v bodu I.I.3. Vzorky tkáně by měly být nakrájeny nadrobno s pomocí sterilních nůžek nebo sterilního skalpelu, homogenizovány výše uvedeným způsobem a suspendovány v transportním médiu.

Konečný poměr mezi tkáňovým materiálem a transportním médiem je třeba v laboratoři upravit na 1:10.

3. Odstřeďování homogenátu

Homogenát se odstřeďuje v odstředivce ochlazené na 2 až 5 °C při 2000 až 4000 x g 15 minut. Supernatant je zachycen a ošetřován antibiotiky buď čtyři hodiny při 15 °C nebo přes noc při 4 °C (v tomto stadiu se doporučuje například 1 mg/ml gentamycinu).

Pokud byl transport vzorků proveden v transportním médiu (tj. s vystavením působení antibiotik), může se ošetření supernatantu antibiotiky vynechat.

Protože ošetření antibiotiky zabrání bakteriální infekci vzorků, není nutná membránová filtrace.

Pokud je zachycený supernatant uskladněn 48 hodin po odběru vzorku při –80 °C, může být použit znovu k virologickému testu, ale pouze jednou.

Pokud se vyskytnou praktické těžkosti (např. výpadek inkubátoru, problémy s buněčnými kulturami atd.), které znemožní očkování buněk během 48 hodin po odběru vzorků tkáně, může být supernatant zmražen při –80 °C a virologický test se provede během příštích 14 dnů.

Před buněčným očkováním se supernatant smísí ve stejném poměru s přiměřeně zředěnou směsí antisér, obsahujících protilátky proti domácím sérotypům IPN, a je inkubován minimálně hodinu při 15 °C nebo maximálně 18 hodin při 4 °C. Při 50 % testu neutralizace plaku musí titr antiséra činit minimálně 1:2000.

Ošetření všech očkovacích látek antisérem viru IPN (v některých částech Evropy je kontaminováno 50 % rybích vzorků IPN virem), slouží k prevenci výskytu cytopatického efektu (CPE) iniciovaného virem IPN u očkovaných buněčných kultur. Tím se snižuje doba trvání virologických zkoušek a počet případů, u kterých by měl být výskyt CPE/cytopatický účinek hodnocen jako možný důkaz přítomnosti VHSV nebo IHNV.

Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek považovaných za prosté IPN, může být ošetření očkovací látky antisérem viru IPN vynecháno.

III. Virologický test

1. Buněčné kultury a média

BF-2 nebo RTG-2 a buď EPC nebo FHM buňky jsou pěstovány při 20 až 30 °C ve vhodném médiu, např. Eagle‘s MEM (či jeho modifikaci), s doplňkem 10 % fetálního séra skotu a antibiotik ve standardních koncentracích.

Pokud jsou buňky kultivovány v uzavřených skleněných trubičkách, doporučuje se pufrovat médium hydrouhličitanem. Médium používané pro kultivaci buněk v otevřených jednotkách může být pufrováno Tris-HCl (23 mM) a hydrouhličitanem sodným (6 mM). pH musí být 7,6 ± 0,2.

Buněčné kultury, které se očkují tkáňovým materiálem, by měly být v době očkování čerstvé (4 až 48 hodin staré) a aktivně rostoucí (nesrostlé).

2. Očkování buněčných kultur

Orgánová suspenze ošetřená antibiotiky se očkuje do buněčných kultur ve dvou stupních ředění, tj. primárním ředění a dále tímto roztokem zředěným 1:10, čímž je dosaženo konečného zředění tkáňového materiálu v médiu buněčných kultur 1:100 popř. 1:1000 (abychom zabránili homologické interferenci). Je třeba naočkovat minimálně dvě buněčné linie (viz část I.III.1). Poměr mezi očkovací látkou a objemem média buněčné kultury by měl činit asi 1:10.

Pro každé zředění a každou buněčnou linii je nutno použít plochu buněčných kultur o velikosti minimálně 2 cm2; což odpovídá jedné sběrné misce jedné desky s 24 kulturami. Použití kultivačních desek se sice doporučuje, ale mohou být použity též jiné podobné nebo větší jednotky.

3. Inkubace buněčných kultur

Naočkované buněčné kultury jsou inkubovány sedm až deset dnů při 150 C. Pokud se výživné médium buněčné kultury zbarví od červena do žluta jako důkaz překyselení, je třeba pH hodnotu sterilním roztokem bikarbonátu nebo jinými látkami s rovnocenným účinkem upravit tak, aby byla zajištěna citlivost buněk na virovou infekci.

Pro přezkoušení citlivosti buněčných kultur se titruje hluboko zmrazený zásobní roztok VHSV nebo IHNV minimálně každých šest měsíců nebo při podezření na sníženou citlivost. Doporučený postup je popsán v části IV.

4. Mikroskopický test

U naočkovaných buněčných kultur je třeba pravidelně kontrolovat (minimálně třikrát týdně) pod mikroskopem se 40-150 násobným zvětšením výskyt cytopatického efektu (CPE). V případě zřejmého CPE je třeba okamžitě provést postup identifikace viru podle části IV.

5. Subkultivace

Pokud se po první sedmi až desetidenní inkubaci nevyskytne cytopatický efekt, provede se subkultivace čerstvých buněčných kultur, přičemž je třeba použít podobnou buněčnou plochu jako u kmenové (primární) kultury.

Alikvotní množství výživného média (supernatant) veškerých misek kmenové kultury se podle buněčné linie spojí do jednoho hromadného vzorku sedm až deset dnů po očkování. Hromadné vzorky jsou potom naočkovány do homologovaných buněčných kultur, nezředěných a zředěných 1:10 (čímž se dosáhne konečného zředění supernatantu 1:10 popř. 1:100) jak je popsáno v části I.III.2. Alternativně mohou být naočkována alikvotní množství 10 % výživného média kmenové kultury přímo v misce čerstvou buněčnou kulturou (subkultivace od misky k misce). Před očkováním může být provedena preinkubace roztoků antisérem viru IPN v příslušném roztoku, jak je popsáno v části I.II.3.

Očkované kultury jsou potom inkubovány sedm až deset dnů při 150 °C a zkoumány podle části I.III.4.

Pokud se během prvních tří dnů inkubace vyskytne toxický CPE, může být v této fázi provedena subkultivace. Buňky musí být však potom inkubovány sedm dní a opět subkultivovány se sedmidenní inkubací. Pokud se ale po třech dnech vyvine toxický CPE, je možno buňky přenášet pouze jednou a inkubovat, aby se dosáhlo celkové doby 14 dnů od prvního očkování. V posledních sedmi dnech inkubace by se neměla vyskytnout žádná známka toxicity.

Pokud se přes ošetření antibiotiky vyskytne bakteriální kontaminace, musí subkultivaci předcházet odstředění 2000 až 4000 x g po 15 až 30 minut při 2 až 50 C, a/nebo filtrace supernatantu přes 0,45 μm filtr (membrána s nízkou tvorbou protein). Navíc jsou postupy subkultivace stejné jako u toxického CPE.

IV. Identifikace viru

1. Testy identifikace viru

Při zřejmém výskytu cytopatického efektu v buněčné kultuře se živné médium (supernatant) shromáždí/zachytí a prozkoumá podle jednoho následujícího postupu či několika postupů: neutralizace, IF, ELISA. Pokud tyto testy neumožní během týdne definitivní identifikaci viru, je třeba supernatant předat národní referenční laboratoři nebo referenční laboratoři EU pro nákazy ryb k okamžité identifikaci.

2. Neutralizace

Ze zachyceného supernatantu se odstřeďováním (2000-4000 x g) nebo membránovou filtrací (0,45 μm) odeberou buňky membránou s nízkou tvorbou proteinu, a supernatant se zředí v médiu buněčné kultury 1:100 a 1:10000.

Alikvotní množství dvou roztoků supernatantu se smíchají a inkubují po 60 minut při 15 °C rovnými díly následujících činidel odděleně:

- sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti VHSV ve zředění 1:50 (obj.:obj.) [2]

- sérum obsahující skupinově specifickou protilátku proti IHNV ve zředění 1:50 (obj.:obj.) [3]

- spojená antiséra proti domácím sérotypům IPNV ve zředění 1:50 (obj.:obj.) [4]

- pouze médium (pozitivní kontrola)

Minimálně dvě buněčné kultury se očkují 50 μm (každá) a inkubují při 15 °C. Vývoj CPE se kontroluje tak, jak je popsáno v části I.III.4.

Některé kmeny VHSV v neutralizačních testech nereagují. Tyto izoláty musí být identifikovány s pomocí IF nebo ELISA.

Alternativně mohou být provedeny jiné vyzkoušené neutralizační testy.

3. IF

Pro každý izolát viru, který je třeba určit, je nutno osadit buňkami minimálně osm zakrytých sklenic – nositelů objektu, a sice v hustotě, která po 24-hodinové kultivaci zaručuje 60-90 % konfluenci. Pro tento účel se doporučují EPC buňky, z důvodu jejich silné přilnavosti na povrchu skla, ale jiné buněčné linie, jako BF-2, RTG-2 nebo FHM mohou být rovněž použity.

Jakmile se na skle vytvoří buněčný sediment (asi hodinu po osazení), nebo po 24hodinové inkubaci kultur se naočkuje virus, který má být identifikován. Očkují se čtyři kultury v obsahovém poměru 1:10 a čtyři další kultury v obsahovém poměru 1:1000. Ty jsou pak inkubovány 20-30 hodin při 15 °C.

Po inkubaci se kultury oplachují dvakrát Eagle‘s MEM bez séra, fixují 80 % ledově chladným acetonem a barví dvouvrstvým IFAT. První reagenční vrstva sestává z poly- či monoklonálních protilátek jedné referenční kvality. Druhá reagenční vrstva je fluoro-chrómem konjugované antisérum imunoglobulinu, použité v první vrstvě. Pro každé z testovaných antisér je třeba obarvit minimálně jednu očkovací kulturu s vysokou dávkou a jednu s nízkou dávkou. Při výzkumu je třeba provést také vhodné negativní a pozitivní kontroly. K tomu se doporučují fluorochrómy jako FITC nebo TRITC.

Barvené kultury se osadí za použití roztoku glycerinu a soli a pozorují se pod ultrafialovým světlem. K tomu je třeba použít brýle s 10- nebo 12násobným zvětšením a objektivní čočky s 25-40násobným zvětšením a numerickou aperturou od > 0,7 popř. > 1,3.

Výše popsaná technika IF je udána jako příklad. Alternativně mohou být použity (ve vztahu k buněčným kulturám, fixaci a protilátkám referenční kvality) jiné vyzkoušené IF-techniky.

4. ELISA

Jednotlivé misky mikrotitrovacích desek se přes noc pokryjí doporučenými roztoky čištěných imunoglobulinových frakcí protilátek referenční kvality.

Po opláchnutí misek pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se misky potřou virem, který má být určen, ve dvou- nebo čtyřnásobném zředění a 60 minut se nechá reagovat s vrstvou protilátek při 37 °C. Po opláchnutí pufrovacím roztokem PBS-Tween-20 se přidají biotinované protilátky se specifikou odpovídající vrstvě protilátek a nechají se reagovat 60 minut při 20 °C. Po dalším opláchnutí jak je popsáno výše se přidá streptavidin konjugovaný HRP a nechá se reagovat hodinu při 20 °C. Po posledním opláchnutí se vázaný enzym zviditelní s pomocí vhodného substrátu ELISA (OPD či jiné).

Výše popsaný postup ELISA na bázi Biotinu-Avidinu je udán pouze jako příklad. Místo toho mohou být také použity jiné vyzkoušené varianty testu ELISA.

TABULKA 1A

Plán kontroly a odběru vzorků pro oblasti a hospodářství v neschválených oblastech během dvouletého kontrolního období před ziskáním schválením pro VHS- a/nebo IHN.

(v souladu s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS a ustanoveními části I této přílohy)

Nejvyšší počet ryb na sběrný vzorek: 10

[5] [6] [7] [8]

| Počet klinických zkoušek za rok (dva roky) | Počet laboratorních zkoušek za rok (dva roky) | [5]Laboratorní zkoušky přítomnosti viru |

Počet mladých ryb (orgánový materiál) | Počet generačních ryb (ovariální tekutina) |

Kontinentální oblasti a hospodářství

hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 120 (1. kontrola) [6] 150 (2. kontrola) | 30 (1. kontrola) [7] 0 (2. kontrola) |

hospodářství pouze s generačními rybami | 2 | 1 | 0 | 150 (1. nebo 2. kontrola) |

hospodářství bez generačních ryb | 2 | 2 | 150 (1. a 2. kontrola) [7] | 0 |

Pobřežní oblasti a hospodářství

hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 120 (1. kontrola) 150 (2. kontrola) | 30 (1. kontrola) [7] 0 (2. kontrola) |

hospodářství lososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1. a 2. kontrola) [8] | 0 |

hospodářství nelososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 150 (1. nebo2. kontrola) | 0 |

TABULKA 1 B

Plán kontroly a odběru vzorků pro dvouleté kontrolní období před ziskáním schválení pro VHS a/nebo IHN v oblastech a hospodářstvích v neschválených oblastech s úředně uznanou nepřítomností těchto nákaz.

(v souladu s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS a ustanoveními částí I a III této přílohy)

Nejvyšší počet ryb na sběrný vzorek: 10

[9] [10] [11]

| Počet klinických zkoušek za rok (dva roky) | Počet laboratorních zkoušek za rok (dva roky) | Laboratorní zkoušky přítomnosti viru |

Počet mladých ryb (orgánový materiál) | Počet generačních ryb (ovariální tekutina) |

Kontinentální oblasti a hospodářství

a)hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 0 (1. kontrola) [5] 30 (2. kontrola) | 30 (1. kontrola) [6] 0 (2. kontrola) |

b)hospodářství pouze s generačními rybami | 2 | 1 | 0 | 30 (1. nebo 2. kontrola) [6] |

c)hospodářství bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1. a 2. kontrola) | 0 |

Pobřežní oblasti a hospodářství

a)hospodářství s generačními rybami | 2 | 2 | 0 (1. kontrola) 30 (2. kontrola) | 30 (1. kontrola) [6] 0 (2. kontrola) |

b)hospodářství lososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1. a 2. kontrola) [7] | 0 |

c)hospodářství nelososovitých bez generačních ryb | 2 | 2 | 30 (1. nebo 2. kontrola) | 0 |

TABULKA 1 C

Plán kontroly a odběru vzorků pro oblasti a hospodářství v neschválených oblastech pro udržení statusu schválení pro VHS a/nebo IHN.

(v souladu s přílohami B a C směrnice 91/67/EHS a ustanoveními části 1 této přílohy)

Nejvyšší počet ryb na sběrný vzorek: 10

[12] [13] [14]

| Počet klinických zkoušek za rok | [5]Počet ryb ve vzorku pro labor. zkoušku |

Počet mladých ryb (orgánový materiál) | Počet generačních ryb (ovariální tekutina) |

Kontinentální oblasti a hospodářství

a)hospodářství s generačními rybami | 2 | 20 (1. nebo 2. kontrola) | 10 (1. nebo 2. kontrola) [6] |

b)hospodářství pouze s generačními rybami | 2 | 0 | 30 (1. nebo 2. kontrola) [6] |

c)hospodářství bez generačních ryb | 2 | 30 | 0 |

Pobřežní oblasti a hospodářství

a)hospodářství s generačními rybami | 2 | 20 (1. nebo 2. kontrola) | 10 (1. nebo 2. kontrola) [6] |

b)hospodářství bez generačních ryb | 1 | 30 [7] | 0 |

ČÁST II Diagnostické postupy k potvrzení VHS a IHN při podezření nákazy

Pro diagnózu IHN a VHS je třeba provést jeden či několik těchto postupů:

- A. obvyklá izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru,

- B. izolace viru se současnou sérologickou identifikací viru,

- C. jiné diagnostické postupy (IFAT, ELISA).

Potvrzení prvního případu VHS a/nebo IHN v hospodářstvích ve schválených oblastech nesmí být založeno pouze na metodě C. Musí být použita též metoda A nebo B.

Ke tkáňovému materiálu určenému pro virologický test může být v některých případech nutné připojit doplňkový materiál pro bakteriologické, parazitologické, histologické nebo jiné vyšetření, aby mohla být provedena diferenciální diagnóza.

A. Obvyklá izolace viru s následnou sérologickou identifikací viru

I.1. Výběr vzorků

K průzkumu je třeba vybrat minimálně deset ryb s typickými symptomy IHN popř. VHS.

I.2. Příprava a zaslání vzorků ryb

Viz část I.I.3

I.3. Odběr doplňkového diagnostického materiálu

Viz část I.I.4

II. Příprava vzorků pro virologický průzkum

Viz část I.II

III. III.Virologické vyšetření

Viz část I.III

IV. Identifikace viru

Viz část I.IV

B. Izolace viru se současnou sérologickou identifikací viru

I.1. Odběr vzorku

Viz část II.A.I.1

I.2. Příprava a zaslání rybích vzorků

Viz část I.I.3

I.3. Odběr dalšího diagnostického materiálu

Viz část I.I.4

II.1. Homogenizace orgánů

Viz část I.II.2

II.2. Odstředění homogenátu

Homogenát se odstřeďuje v odstředivce ochlazené na 2 až 5 °C při 2000 až 4000 x g po dobu 15 minut. Supernatant se zachytí a ošetřuje čtyři hodiny při 15 °C antibiotiky (např. Gentamycin 1mg/ml) nebo membránově filtruje (0,45 μm) membránou s nízkou tvorbou proteinu.

II.3. Ošetření supernatantu diagnostickými antiséry

Antibiotiky ošetřená či membránou filtrovaná suspenze orgánů je zředěna 1:10 a 1:1000 v médiu buněčné kultury; alikvotní množství jsou smíchána se stejnými díly činidel uvedených v části I.IV.2 a inkubována 60 minut při 15 °C.

III.1. Buněčné kultury a média

Viz část I.III.1

III.2. Očkování buněčných kultur

Z každé směsi virus-sérum (připravené podle části II.B.II.3) jsou očkovány po 50 μl minimálně dvě buněčné kultury na každou buněčnou linii.

III.3. Inkubace buněčných kultur

Viz část I.III.1

III.4. Mikroskopické vyšetření

Očkované buněčné kultury jsou zkoumány denně pod mikroskopem při 40- až 150ti násobném zvětšení, jestli se zde vyskytuje cytopatický efekt (CPE). Pokud jedno z použitých antisér zabrání výskytu cytopatického efektu, může být virus považován za prokázaný.

Pokud jedno z použitých sér zabrání výskytu cytopatického efektu, je třeba uplatnit identifikační postup podle části I.IV.

III.5. Subkultivace

Pokud se po sedmi až deseti dnech nevyskytne žádný CPE, subkultivace musí být provedena z kultur očkovaných supernatantem plus médium (část II.B.II.3) podle části I.III.5.

C. Jiné diagnostické postupy

Supernatant připravený podle části I.II.2 může být podroben testu IFAT popř. ELISA podle části I.IV.3 popřípadě části I.IV.4. Tyto rychlé postupy musejí být doplněny virologickým vyšetřením podle písm. A nebo B do 48 hodin po odběru vzorku, pokud

a) je výsledek negativní,nebo

b) je výsledek pozitivní u materiálu, představujícího první případ vzplanutí IHN nebo VHS ve schválené oblasti.

Tkáňový materiál může být zkoumán podle jiných diagnostických postupů (např. RT-PCR, IF na řezech zmrzlého materiálu či imuno-histochemické analýzy u materiálu fixovaného formalinem). Tyto postupy musí být vždy doplněny očkováním nefixovaného tkáňového materiálu na buněčné kultury.

ČÁST III Důkaz nepřítomnosti VHS a/nebo IHN v oblastech či hospodářstvích v neschválených oblastech

Zásady a kritéria pro úřední program kontroly zdravotní nezávadnosti

1. Program kontroly zdravotní nezávadnosti může být iniciován

- buď podle úředně uznaného programu eradikace nákaz VHSV a/nebo IHNV včetně odstranění všech ryb v hospodářství, čištění, dezinfekce a uchování v tomto stavu před znovuosazením rybami ze schválených hospodářství, nebo

- v rybích hospodářstvích, v nichž se ještě nevyskytla žádná infekce VHSV nebo IHNV.

2. Program kontroly zdravotní nezávadnosti se musí opírat o klinické kontroly a laboratorní testy.

3. Program musí zahrnovat dvě klinické veterinární kontroly ročně podle směrnic v části I.

4. U minimálně jedné kontroly prováděné každoročně je nutno v každém hospodářství odebrat 30 vzorků rybích tkání a/nebo ovariální tekutiny. Vzorky je nutno odebrat, připravit a podrobit laboratorní zkoušce podle částí I, II a IV.

5. Program kontroly zdravotní nezávadnosti je třeba provádět minimálně čtyři roky ve všech hospodářstvích oblasti, která má být schválena, nebo v hospodářství v neschválené oblasti, které má být schváleno.

6. Program je úředně uznán pouze v případě, že se nevyskytly žádné případy VHS a IHN ani nebyly prokázány (klinické infekce ani izolace virů).

ČÁST IV Postup titrace pro ověření vnímavosti buněčných kultur vůči infekcím

Doporučené postupy pro titraci podle bodu I.III.3 jsou uvedeny níže:

Je třeba použít nejméně dva izoláty VHSV a jeden izolát IHNV. Izoláty by měly reprezentovat nejdůležitější skupinu virů v EU. Např. v případě VHSV je třeba vybrat jeden patogenní izolát pstruha duhového ve sladké vodě a jeden patogenní izolát kambaly velké ve slané vodě, v případě IHNV jeden patogenní evropský kmen pstruha duhového. Měly by být použity definované izoláty z členských států. Referenční laboratoř Společenství pro nákazy ryb může dát k dispozici referenční izoláty.

Dávky virů se získávají v několika průchodech buněčných kultur v baňkách s buněčnými kulturami na BF-2 nebo RTG-2 buňkách v případě VHSV a na EPC nebo FHM buňkách pro IHNV. Mělo by být použito médium buněčných kultur s minimálně 10 % séra. Pro očkování použijte nízké MOI. (< 1).

V případě totálního CPE se virus získává 15ti minutovým odstřeďováním supernatantu buněčné kultury při 2000 x g, sterilně membránově filtruje (0,45 μm) a distribuuje v kryotrubičkách se štítkem. Virus se skladuje při teplotě – 80° C.

Týden po zmrazení se tři trubičky s každým virem nechají roztát ve studené vodě a titrují se na jejich příslušné buněčné linie. Každý izolát viru se nechává roztát a titrovat minimálně každých šest měsíců při podezření na sníženou vnímavost buněčných linií.

Postupy titrace je nutno podrobně popsat a pokaždé provést stejným způsobem.

Titrace se zředěním až do konečného bodu by měla zahrnovat minimálně šest opakování každého kroku ředění. Titry se srovnají s titry předtím získanými. Pokud poklesne titr jednoho ze tří izolátů viru o faktor 2 log nebo více ve srovnání s původním titrem, neměla by buněčná linie již být použita pro výzkumné účely.

Pokud jsou v laboratoři přítomny různé buněčné linie, měla by být každá buněčná linie vyšetřena zvlášť.

Záznamy je třeba uchovat minimálně deset let.

ČÁST V Akronymy a zkratky

BF-2 Slunečnice modroskřelá potěr – 2 (buněčná linie)

CPE Cytopatický efekt

CRL Referenční laboratoř Společnosti pro nákazy ryb

ELISA ELISA Imunostanovení, kdy je na protilátku navázán enzym

EPC Epithelioma papulosum cyprinii (buněčná linie)

FHM Střevle (buněčná linie)

FITC Fluorescein-izothiokyanát

HEPES Kyselina sulfonová 2-/4-(2-hydroxyethyl)piperazino/etanolová

HRP Peroxidáza křenu

IF Imunofluorescence

IFAT Nepřímý fluorescenční test protilátek

IHN(V) Infekční nekróza krvetvorné tkáně (virus)

IPN(V) Infekční nekróza slinivky (virus)

MEM Minimální nutné médium

MOI Multiplicita infekce (poměr počtu přidaných infekčních virových částic ke známému počtu buněk v jedné kultuře)

OPD Ortho-fenylendiamin

PBS Fosfátem pufrovaný roztok soli

RTG-2 Gonády pstruha duhového (buněčná linie)

RT-PCR Řetězová reakce reverzní transkriptáza polymeráza

Tris-Hcl Tris(hydroxymetyl)aminometan-HCl

TRITC Tetrametyl-rhodamin-isothiokyanát

VHS(V) Virová hemoragická septikémie (virus)

[1] Ve výjimečných případech, tj. pokud ryby pocházejí z velmi odlehlých oblastí, v nichž každodenní odesílání není možné.

[2] Nebo podle údajů referenční laboratoře v ohledem na možnou cytotoxicitu antisér.

[3] Nebo podle údajů referenční laboratoře v ohledem na možnou cytotoxicitu antisér.

[4] Nebo podle údajů referenční laboratoře v ohledem na možnou cytotoxicitu antisér.

[5] Pokud jsou požadavky, uvedené v bodech I.I.1, I.I.2.1.b a III splněny, může se pracovat alternativně s menší velikostí vzorku podle tabulky 1B.

[6] Klinické kontroly

[7] Pokud nemůže být odebrána žádná ovariální tekutina, smějí být ve výjimečném případě odebrány orgánové vzorky.

[8] Vzorky je možno odebrat nejdříve tři týdny po přepravě ryb ze sladké vody do slané.

[9] Klinické zkoušky

[10] Pokud nemůže být odebrána žádná ovariální tekutina, smějí být ve výjimečném případě odebrány orgánové vzorky.

[11] Vzorky je možno odebrat nejdříve tři týdny po přepravě ryb ze sladké vody do slané.

[12] Ve schválených oblastech musejí být každý rok odebírány vzorky střídavě pouze v 50 % rybích hospodářství. Ve schválených hospodářstvích v neschválených oblastech musejí být odebírány vzorky každý rok.

[13] Pokud nemůže být odebrána žádná ovariální tekutina, smějí být ve výjimečném případě odebrány orgánové vzorky.

[14] Vzorky je možno odebrat nejdříve tři týdny po přepravě ryb ze sladké vody do slané.

--------------------------------------------------