2000/32/ESSměrnice Komise 2000/32/ES ze dne 19. května 2000, kterou se po dvacáté šesté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek* (Text s významem pro EHP)

Směrnice Komise 2000/32/ES

ze dne 19. května 2000,

kterou se po dvacáté šesté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek [1]

(Text s významem pro EHP)

KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,

s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství,

s ohledem na směrnici Rady 67/548/EHS ze dne 27. června 1967 o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek [2], naposledy pozměněnou směrnicí Evropského parlamentu a Rady 1999/33/ES [3], a zejména na článek 28 uvedené směrnice,

vzhledem k těmto důvodům:

(1) Příloha I směrnice 67/548/EHS obsahuje seznam nebezpečných látek společně s podrobnými údaji o klasifikaci a označování každé látky. Současné vědecké a technické poznatky ukazují, že by měl být seznam nebezpečných látek v uvedené příloze přizpůsoben. Některé jazykové verze směrnice vyžadují opravy určitých oddílů předmluvy a tabulky A v příloze I.

(2) Příloha III směrnice 67/548/EHS obsahuje seznam vět udávajících povahu zvláštních rizik spojených s nebezpečnými látkami a přípravky. Příloha IV směrnice 67/548/EHS obsahuje seznam vět s bezpečnostními pokyny týkajícími se nebezpečných látek a přípravků. Příloha VI směrnice 67/548/EHS obsahuje návod ke klasifikaci a k označování nebezpečných látek a přípravků. Některé jazykové verze směrnice vyžadují opravy určitých oddílů příloh III, IV a VI.

(3) V příloze V směrnice 67/548/EHS se stanoví metody pro stanovení fyzikálně-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látek a přípravků. Je nezbytné přizpůsobit tuto přílohu technickému pokroku.

(4) Příloha IX směrnice 67/548/EHS obsahuje předpisy týkající se uzávěrů odolných proti otevření dětmi. Tyto předpisy by měly být přizpůsobeny a aktualizovány. Je nezbytné rozšířit oblast, kde se uzávěry odolné proti otevření dětmi používají.

(5) Opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Výboru pro přizpůsobení technickému pokroku směrnic pro odstranění technických překážek obchodu na úseku nebezpečných látek a přípravků,

PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:

Článek 1

Směrnice 67/548/EHS se mění takto:

1. Příloha I se mění takto:

a) odpovídající poznámka v předmluvě se nahrazuje poznámkou Q v příloze 1A této směrnice;

b) odpovídající řádky v tabulce A se nahrazují řádky v příloze 1B této směrnice;

c) odpovídající položky se nahrazují položkami v příloze 1C této směrnice;

d) vkládají se položky v příloze 1D této směrnice.

2. Odpovídající věta v příloze III se nahrazuje standardní větou označující specifickou rizikovost v příloze 2 této směrnice.

3. Příloha IV se mění takto:

a) odpovídající pokyny v příloze IV se nahrazují standardními pokyny pro bezpečné zacházení v příloze 3A této směrnice;

b) odpovídající pokyny v příloze IV se nahrazují kombinovanými standardními pokyny pro bezpečné zacházení v příloze 3B této směrnice.

4. Část B přílohy V se mění takto:

a) kapitola B.10 se nahrazuje textem v příloze 4A této směrnice;

b) kapitola B.11 se nahrazuje textem v příloze 4B této směrnice;

c) kapitola B.12 se nahrazuje textem v příloze 4C této směrnice;

d) kapitoly B.13 a B.14 se nahrazují textem v příloze 4D této směrnice;

e) kapitola B.17 se nahrazuje textem v příloze 4E této směrnice;

f) kapitola B.23 se nahrazuje textem v příloze 4F této směrnice. Název kapitoly B.23 ve vysvětlivce se mění odpovídajícím způsobem;

g) vkládá se text v příloze 4G této směrnice.

5. Zrušuje se čtvrtá odrážka obecného úvodu k části C přílohy V.

6. Odpovídající texty v příloze VI se nahrazují texty v příloze 5 této směrnice.

7. Příloha IX se mění způsobem uvedeným v příloze 6 této směrnice.

Článek 2

1. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 1. června 2001. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.

Tyto předpisy přijaté členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí takový odkaz být učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy.

2. Členské státy sdělí Komisi znění hlavních ustanovení vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice, a srovnávací tabulku mezi směrnicí a přijatými vnitrostátními ustanoveními.

Článek 3

Tato směrnice vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Článek 4

Tato směrnice je určena členským státům.

V Bruselu dne 19. května 2000.

Za Komisi

Margot Wallström

členka Komise

[1] Přijato po přizpůsobení po dvacáté sedmé.

[2] Úř. věst. 196, 16.8.1967, s. 1.

[3] Úř. věst. L 199, 30.7.1999, s. 57.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 1A

PŘEDMLUVA K PŘÍLOZE I

Vysvětlení poznámek týkajících se identifikace, klasifikace a označování látek

(Netýká se českého znění)

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 1B

"TABULKA A

Z | Symbol | ES | DA | DE | EL | EN | FI | FR | IT | NL | PT | SV |

18 | Ar | Argón | Argon | Argon | Αργό | Argon | Argon | Argon | Argon | Argon | Árgon | Argon |

64 | Gd | Gadolinio | Gadolinium | Gadolinium | Γαδολίνιο | Gadolinium | Gadolinium | Gadolinium | Gadolinio | Gadolinium | Gadolínio | Gadolinium" |

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 1C

Indexové číslo | Chemický název | Poznámky k látkám | Číslo ES | Číslo CAS | Klasifikace | Označení | Koncentrační limity | Poznámky k přípravkům |

006–011–00–7 | karbaryl (ISO) 1-naftyl-N-methylkarbamát | | 200–555–0 | 63–25–2 | Karc. kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50 | Xn; N R: 22–40–50 S: (2-)22–24–36/37–46–61 | | |

006–013–00–8 | metham-natrium (ISO) natrium-N-methyldithiokarbamát | | 205–293–0 | 137–42–8 | Xn; R22 R31 C; R34 R43 N; R50–53 | C; N R: 22–31–34–43–50/53 S: (1/2-)26–36/37/39–45–60–61 | | |

006–015–00–9 | diuron (ISO) 3-(3,4-dichlorfenyl)-1,1-dimethylmočovina | | 206–354–4 | 330–54–1 | Karc. kat. 3; R40 Muta. kat. 3; R40 Xn; R22–48/22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–40–48/22–50/53 S: (2-)13–22–23–37–46–60–61 | | |

006–016–00–4 | propoxur (ISO) 2- isopropoxyfenyl-N-methylkarbamát | | 204–043–8 | 114–26–1 | T; R25 N; R50–53 | T; N R: 25–50/53 S: (1/2-)37–45–60–61 | | |

006–017–00-X | aldikarb (ISO) 2-methyl-2-(methylsulfanyl)propanal-O-(N-methylkarbamoyl)oxim | | 204–123–2 | 116–06–3 | T+; R26/28 T; R24 N; R50–53 | T+; N R: 24–26/28–50/53 S: (1/2-)22–36/37–45–60–61 | | |

006–018–00–5 | aminokarb (ISO) 4-(dimethylamino)-3-methylfenyl-N-methylkarbamát | | 217–990–7 | 2032–59–9 | T; R24/25 N; R50–53 | T; N R: 24/25–50/53 S: (1/2-)28–36/37–45–60–61 | | |

006–019–00–0 | di-allát (ISO) S-(2,3-dichlorallyl)-N,N-diisopropylthiokarbamát | | 218–961–1 | 2303–16–4 | Karc. kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–40–50/53 S: (2-)25–36/37–60–61 | | |

006–020–00–6 | barban (ISO) 4-chlorbut-2-yn-1-yl-N -(3-chlorfenyl)karbamát | | 202–930–4 | 101–27–9 | Xn; R22 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 22–43–50/53 S: (2-)24–36/37–60–61 | | |

006–023–00–2 | merkaptodimethur (ISO) methiokarb 3,5-dimethyl-4-(methylsulfanyl)fenyl-N -methylkarbamát | | 217–991–2 | 2032–65–7 | T; R25 N; R50–53 | T; N R: 25–50/53 S: (1/2-)22–37–45–60–61 | | |

006–024–00–8 | proxan-natrium (ISO) natrium-O-isopropyl-dithiokarbonát | | 205–443–5 | 140–93–2 | Xn; R22 Xi; R38 N; R51–53 | Xn; N R: 22–38–51/53 S: (2-)13-61 | | |

006–026–00–9 | karbofuran (ISO) 2,2-dimethyl-2,3-dihydro-1-benzofuran-7-yl-N-methylkarbamát | | 216–353–0 | 1563–66–2 | T+; R26/28 N; R50–53 | T+; N R: 26/28–50/53 S: (1/2-)36/37–45–60–61 | | |

006–028–00-X | dinobuton (ISO) 2-(1-methylpropyl)-4,6-dinitrofenyl-isopropyl-karbonát 2-sek-butyl-4,6-dinitrofenyl-isopropyl-karbonát | | 213–546–1 | 973–21–7 | T; R25 N; R50–53 | T; N R: 25–50/53 S: (1/2-)37–45–60–61 | | |

006–029–00–5 | dioxakarb (ISO) 2-(1,3-dioxolan-2-yl)fenyl-N-methylkarbamát | | 230–253–4 | 6988–21–2 | T; R25 N; R51–53 | T; N R: 25–51/53 S: (1/2-)37–45–61 | | |

006–033–00–7 | metoxuron (ISO) 3-(3-chlor-4-methoxyfenyl)-1,1-dimethylmočovina | | 243–433–2 | 19937–59–8 | N; R50–53 | N R: 5 0/ 5 3 S: 60-61 | | |

006–034–00–2 | pebulát (ISO) S-propyl-N-butyl-N-ethylthiokarbamát | | 214–215–4 | 1114–71–2 | Xn; R22 N; R51–53 | Xn; N R: 22–51/53 S: (2-)23-61 | | |

006–035–00–8 | pirimikarb (ISO) 2-(dimethylamino)- 5,6-dimethyl pyrimidin-4-yl-N,N-dimethylkarbamát | | 245–430–1 | 23103–98–2 | T; R25 N; R50–53 | T; N R: 25–50/53 S: (1/2)22–37–45–60–61 | | |

006–037–00–9 | promekarb (ISO) 3-isopropyl-5-methylfenyl-N-methylkarbamát | | 220–113–0 | 2631–37–0 | T; R25 N; R50–53 | T; N R: 25–50/53 S: (1/2-)24–37–45–60–61 | | |

006–038–00–4 | sulfallát (ISO) 2-chlorallyl-N,N-dimethyldithiokarbamát | E | 202–388–9 | 95–06–7 | Karc. kat. 2; R45 Xn; R22 N; R50–53 | T; N R: 45–22–50/53 S: 53–45–60–61 | | |

006–039–00-X | tri-allát (ISO) S-(2,3,3-trichlorallyl)-N,N-diisopropylthiokarbamát | | 218–962–7 | 2303–17–5 | Xn; R22–48/22 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 22–43–48/22–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

006–042–00–6 | monuron (ISO) 3-(4-chlorfenyl)-1,1-dimethylmočovina | | 205–766–1 | 150–68–5 | Karc. kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–40–50/53 S: (2-)36/37–60–61 | | |

006–043–00–1 | monuron-TCA 3-(4-chlorfenyl)-1,1-dimethyluronium-trichloracetát | | — | 140–41–0 | Xi; R36/38 Karc. kat. 3; R40 N; R50–53 | Xn; N R: 36/38–40–50/53 S: (2-)36/37–60–61 | | |

006–045–00–2 | methomyl (ISO) methyl-N-[(N-methylkarbamoyl)oxy]thioacetimidát | | 240–815–0 | 16752–77–5 | T+; R28 N; R50–53 | T+; N R: 28–50/53 S: (1/2-)22–36/37–45–60–61 | | |

006–046–00–8 | bendiokarb (ISO) 2,2-dimethyl-1,3-benzodioxol-4-yl-N-methylkarbamát | | 245–216–8 | 22781–23–3 | T; R23/25 Xn; R21 N; R50–53 | T; N R: 21–23/25–50/53 S: (1/2-)22–36/37–45–60–61 | | |

006–047–00–3 | bufenkarb (ISO) směs: 3-(1-methylbutyl)fenyl-N-methylkarbamátu a 3-(1-ethylpropyl)fenyl-N-methylkarbamátu | | — | 8065–36–9 | T; R24/25 N; R50–53 | T; N R: 24/25–50/53 S: (1/2-)28–36/37–45–60–61 | | |

006–048–00–9 | ethiofenkarb (ISO) 2-[(ethylsulfanyl)methyl]fenyl-N-methylkarbamát | | 249–981–9 | 29973–13–5 | Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–50/53 S: (2-)60-61 | | |

006–050–00–X | fenuron-TCA 3-fenyl-1,1-dimethyluronium-trichloracetát | | — | 4482–55–7 | Xi; R38 N; R50–53 | Xi; N R: 38–50/53 S: (2-)60-61 | | |

006–053–00–6 | isoprokarb (ISO) 2-isopropylfenyl-N-methylkarbamát | | 220–114–6 | 2631–40–5 | Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–50/53 S: (2-)60-61 | | |

006–054–00–1 | mexakarbát (ISO) 4-(dimethylamino)-3,5-dimethylfenyl-N-methylkarbamát | | 206–249–3 | 315–18–4 | T+; R28 Xn; R21 N; R50–53 | T+; N R: 21–28–50/53 S: (1/2-)36/37–45–60–61 | | |

006–057–00–8 | nitrapyrin (ISO) 2-chlor-6-(trichlormethyl)pyridin | | 217–682–2 | 1929–82–4 | Xn; R22 N; R51–53 | Xn; N R: 22–51/53 S: (2-)24-61 | | |

006–060–00–4 | oxykarboxin (ISO) 2-methyl-4,4-dioxo-5,6-dihydro-4λ4-1,4-oxathiin-3-karboxanilid | | 226–066–2 | 5259–88–1 | Xn; R22 R52–53 | Xn R:22–52/53 S: (2-)61 | | |

006–069–00–3 | thiofanát-methyl (ISO) 1,2-di[3-(methoxykarbonyl)thioureido]benzen | | 245–740–7 | 23564–05–8 | Muta. kat. 3; R40 N; R50–53 | Xn; N R: 40–50/53 S: (2-)36/37–60–61 | | |

006–070–00–9 | furmecyklox N-cyklohexyl-N-methoxy-2,5-dimethyl-3-furamid | | 262–302–0 | 60568–05–0 | Karc. kat. 3; R40 N; R50–53 | Xn; N R: 40–50/53 S: (2-)36/37–60–61 | | |

006–088–00–7 | benfurakarb (ISO) ethyl-N -[({[(2,2-dimethyl-2,3-dihydro-1-benzofuran-7-yl)oxy]karbonyl}methylamino)sulfanyl]-N-isopropyl-β-alaninát(2,2-dimethyl-2,3-dihydro-1-benzofuran-7-yl)-N-({[2-(ethoxykarbonyl)ethyl]isopropylamino}sulfanyl)-N-methylkarbamát | | — | 82560–54–1 | T; R23/25 N; R50–53 | T; N R: 23/25–50/53 S: (1/2-)36/37–45–60–61 | | |

007–012–00–5 | N,N-dimethylhydrazin 1,1-dimethylhydrazin | E | 200–316–0 | 57–14–7 | F; R11 Karc. kat. 2; R45 T; R23/25 C; R34 N; R51–53 | F; T; N R: 45–11–23/25–34–51/53 S: 53–45–61 | | |

007–013–00–0 | N,N-dimethylhydrazin 1,2-dimethylhydrazin | E | — | 540–73–8 | Karc. kat. 2; R45 T; R23/24/25 N; R51–53 | T; N R: 45–23/24/25–51/53 S: 53–45–61 | C ≥ 25 %: T; R45–23/24/25 3 % < C < 25 %: T; R45–20/21/22 0,01 % < C < 3 %: T; R45 | |

009–003–00–1 | kyselina fluorovodíková … % | B | 231–634–8 | 7664–39–3 | T+; R26/27/28 C; R35 | T+; C R: 26/27/28–35 S: (1/2-)7/9–26–36/37–45 | C ≥ 7 %: T+; C; R26/27/28–35 1 % ≤ C < 7 %: T; R23/24/25–34 0,1 % ≤ C < 1 %: Xn; R20/21/22–36/37/38 | |

015–039–00–9 | azinfos-methyl (ISO) O,O-dimethyl-S -[(4(3 H)-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)methyl]-fosforodithioát | | 201–676–1 | 86–50–0 | T+; R26/28 T; R24 R43 N; R50–53 | T+; N R: 24–26/28–43–50/53 S: (1/2-)28–36/37–45–60–61 | | |

015–048–00–8 | fenthion (ISO) O,O-dimethyl-O-[3-methyl-4-(methylsulfanyl)fenyl]-fosforothioát | | 200–231–9 | 55–38–9 | Muta. kat. 3; R40 T; R23–48/25 Xn; R21/22 N; R50–53 | T; N R: 21/22–23–40–48/25–50/53 S: (1/2-)36/37–45–60–61 | | |

015–056–00–1 | azinfos-ethyl (ISO) O,O-diethyl-S-[(4(3 H)-oxo-1,2,3-benzotriazin-3-yl)methyl]-fosforodithioát | | 220–147–6 | 2642–71–9 | T+; R28 T; R24 N; R50–53 | T+; N R: 24–28–50/53 S: (1/2-)28–36/37–45–60–61 | | |

015–140–00–8 | triazofos (ISO) O,O-diethyl-O-(1-fenyl-1 H- 1,2,4-triazol-3-yl)-fosforothioát | | 245–986–5 | 24017–47–8 | T; R23/25 Xn; R21 N; R50–53 | T; N R: 21–23/25–50/53 S: (1/2-)36/37–45–60–61 | | |

016–013–00-X | chlorid sirnatý | | 234–129–0 | 10545–99–0 | R14 C; R34 N; R50 | C; N R: 14–34–50 S: (1/2-)26–36/37/39–45–61 | C ≥ 10 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38 | |

016–014–00–5 | chlorid siřičitý | | — | 13451–08–6 | R14 C; R34 N; R50 | C; N R: 14–34–50 S: (1/2-)26–36/37/39–45–61 | C ≥ 10 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38 | |

016–023–00–4 | dimethyl-sulfát | E | 201–058–1 | 77–78–1 | Karc. kat. 2; R45 Muta. kat. 3; R40 T+; R26 T; R25 C; R34 R43 | T+ R: 45–25–26–34–43 S: 53-4 5 | C ≥ 25 %: T+; R45–25–26–34–43 10 % ≤ C < 25 %: T+; R45–22–26–34–43 7 % ≤ C < 10 %: T+; R45–22–26–36/ 37/38–43 5 % ≤ C < 7 %: T; R45–22–23–36/37/38–43 3 % ≤ C < 5 %: T; R45–22–23–43 1 % ≤ C < 3 %: T; R45–23–43 0,1 % ≤ C < 1 %: T; R45–20 0,01 % ≤ C < 0,1 %:T; R45 | |

016–024–00-X | dimexano (ISO) bis(methoxythiokarbonyl)disulfid | | O,O′-dimethyl-disulfanbis(karbothioát)215–993–8 | 1468–37–7 | Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–50/53 S: (2-)60-61 | | |

016–071–00–6 | 3-amino-6,13-dichlor-10-[(3-{[4-chlor-6-(2-sulfonatoanilino)- 1,3,5-triazin-2-yl]amino}propyl)amino][1,4]benzoxazino[2,3-b]fenoxazin-4,11-disulfonát trisodný | | 410–130–3 | 136248–03–8 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22–24–37 | | |

022–001–00–5 | chlorid titaničitý | | 231–441–9 | 7550–45–0 | R14 C; R34 | C R: 14-34 S: (1/2-)7/8–26–36/37/39–45 | C ≥ 10 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38 | |

030–004–00–8 | dimethylzinek [1] diethylzinek [2] | | 208–884–1 [1] 209–161–3 [2] | 544–97–8 [1] 557–20–0 [2] | R14 F; R17 C; R34 N; R50–53 | F; C; N R: 14–17–34–50/53 S: (1/2-)16–43–45–60–61 | | |

050–002–00–0 | cyhexatin (ISO) tricyklohexyl(hydroxy)stannan tricyklohexylstannium-hydroxid | | 236–049–1 | 13121–70–5 | Xn; R20/21/22 N; R50–53 | Xn; N R: 20/21/22–50/53 S: (2-)13–60–61 | | |

050–012–00–5 | tetracyklohexylstannan [1] chlor(tricyklohexyl)stannan [2] butyl(tricyklohexyl)stannan [3] | | 215–910–5 [1] 221–437–5 [2] 230–358–5 [3] | 1449–55–4 [1] 3091–32–5 [2] 7067–44–9 [3] | Xn; R20/21/22 N; R50–53 | Xn; N R: 20/21/22–50/53 S: (2-)26–28–60–61 | C ≥ 1 %: Xn; R20/21/22 | 1 |

050–017–00–2 | fenbutatinoxid (ISO) 1,1,1,3,3,3-hexakis(2-fenyl-2-methylpropyl)distannoxan | | 236–407–7 | 13356–08–6 | T+; R26 Xi; R36/38 N; R50/53 | T+; N R: 26–36/38–50/53 S: (1/2-)28–36/37–45–60–61 | | |

082–009–00–X | žluť (sulfochromát olovnatý) CI Pigment Yellow 34 (CI 77603) CI pigmentová žluť 34 (CI 77603) | | 215–693–7 | 1344–37–2 | Karc. kat. 3; R40 Repr. kat. 1; R61 Repr. kat. 3; R62 R33 N; R50–53 | T; N R: 61–33–40–50/53–62 S: 53–45–60–61 | | 1 |

082–010–00–5 | červeň (chroman-molybdenan-síran olovnatý) CI Pigment Red 104 (CI 77605) CI pigmentová červeň 104 (CI 77605) | | 235–759–9 | 12656–85–8 | Karc. kat. 3; R40 Repr. kat. 1; R61 Repr. kat. 3; R62 R33 N; R50–53 | T; N R: 61–33–40–50/53–62 S: 53–45–60–61 | | 1 |

601–024–00-X | kumen [1] propylbenzen [2] | | 202–704–5 [1] 203–132–9 [2] | 98–82–8 [1] 103–65–1 [2] | R10 Xn; R65 Xi; R37 N; R51–53 | Xn; N R: 10–37–51/53–65 S: (2-)24–37–61–62 | | 4 |

601–032–00–3 | benzo[a]pyren benzo[def]chrysen | | 200–028–5 | 50–32–8 | Karc. kat.2; R45 Muta. kat. 2; R46 Repr. kat. 2; R60–61 N; R50–53 | T; N R: 45–46–60–61–50/53 S: 53–45–60–61 | | |

601–034–00–4 | benzo[e]acefenanthrylen | | 205–911–9 | 205–99–2 | Karc. kat.2; R45 N; R50–53 | T; N R: 45–50/53 S: 53–45–60–61 | | |

602–035–00–2 | 1,4-dichlorbenzen p-dichlorbenzen | | 203–400–5 | 106–46–7 | Xi; R36 N; R50–53 | Xi; N R: 36–50/53 S: (2-)24/25–46–60–61 | | |

602–054–00–6 | 3-jodprop-1-en allyljodid | | 209–130–4 | 556–56–9 | R10 C; R34 | C R: 10-34 S: (1/2-)7–26–45 | | |

603–076–00–9 | but-2-yn-1,4-diol | | 203–788–6 | 110–65–6 | T; R23/25 Xn; R21–48/22 C; R34 | T R: 21–23/25–34–48/22 S: (1/2-)26–36/37/39–45 | C ≥ 50 %: T; R21–23/25–34–48/22 25 % ≤ C < 50 %: T; R21–23/25–36/38–48/22 10 % ≤ C < 25 %: Xn; R20/22–48/22 3 % ≤ C < 10 %: Xn; R20/22 | |

603–091–00–0 | exo-4-isopropyl-1-methyl-7-oxabicyklo[2.2.1]heptan-2-ol | | 402–470–6 | 87172–89–2 | O; R8 Xn; R22 Xi; R36 | O; Xn R: 8–22–36 S: (2-)26 | | |

603–093–00–1 | exo-(±)-4-isopropyl-1-methyl-2-[(2-methylbenzyl)oxy]-7-oxabicyklo[2.2.1]heptan | | 402–410–9 | 87818–31–3 | Xn; R20 N; R51–53 | Xn; N R: 20–51/53 S: (2-)23-61 | | |

603–097–00–3 | 1,1', 1′′-nitrilotripropan-2-ol triisopropanolamin | | 204–528–4 | 122–20–3 | Xi; R36 R52–53 | Xi R:36–52/53 S: (2-)26-61 | | |

603–117–00–0 | propan-2-ol isopropylalkohol isopropanol | | 200–661–7 | 67–63–0 | F; R11 Xi; R36 R67 | F; Xi R: 11–36–67 S: (2-)7–16–24/25–26 | | 6 |

604–020–00–6 | bifenyl-2-ol 2-hydroxybifenyl 2-fenylfenol (ISO) | | 201–993–5 | 90–43–7 | Xi; R36/37/38 N; R50 | Xi; N R: 36/37/38–50 S: (2-)22-61 | | |

604–021–00–1 | 2-fenylfenol, sodná sůl natrium-2-fenylfenolát 2-bifenylát sodný natrium-bifenyl-2-olát | | 205–055–6 | 132–27–4 | Xn; R22 Xi; R37/38–41 N; R50 | Xn; N R: 37/38–41–50 S: (2-)22–26–61 | | |

604–024–00–8 | 4,4'-(4-methylpentan-2,2-diyl)difenol 2,2-bis(4-hydroxyfenyl)-4-methylpentan | | 401–720–1 | 6807–17–6 | Repr. kat. 2; R60 Xi; R36 N; R50–53 | T; N R: 60–36–50/53 S: 53–45–60–61 | | |

604–041–00–0 | acifluorfen [1] acifluorfen-natrium [2] 5-[2-chlor-4-(trifluormethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina [1] natrium-5-[2-chlor-4-(trifluormethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoát [2] | | 256–634–5 [1] 263–560–7 [2] | 50594–66–6 [1] 62476–59–9 [2] | Xn; R22 Xi; R38–41 N; R50–53 | Xn; N R: 22–38–41–50/53 S: (2-)24–39–60–61 | | |

604–043–00–1 | monobenzonbenzyl (4-hydroxyfenyl)ether hydrochinonmonobenzylether 4-(benzyloxy)fenol | | 203–083–3 | 103–16–2 | Xi; R36 R43 | Xi R: 36-43 S: (2-)24/25–26–37 | | |

604–044–00–7 | mechinol 4-methoxyfenol hydrochinonmonomethylether | | 205–769–8 | 150–76–5 | Xn; R22 Xi; R36 R43 | Xn R: 22–36–43 S: (2-)24/25–26–37/39–46 | | |

605–016–00–7 | glyoxal… % ethandial… % | B | 203–474–9 | 107–22–2 | Muta. kat. 3; R40 Xn; R20 Xi; R36/38 R43 | Xn R: 20–36/38–40–43 S: (2-)36/37 | C ≥ 10 %: Xn; R20–36/38–40–43 1 % ≤ C < 10 %: Xn; R40–43 | |

606–016–00-X | pindon (ISO) 2-(trimethylacetyl)indan-1,3-dion | | 201–462–8 | 83–26–1 | T; R25–48/25 N; R50–53 | T; N R: 25–48/25–50/53 S: (1/2-)37–45–60–61 | | |

606–018–00–0 | dichlon (ISO) 2,3-dichlor-1,4-naftochinon | | 204–210–5 | 117–80–6 | Xn; R22 Xi; R36/38 N; R50–53 | Xn; N R: 22–36/38–50/53 S: (2-)26–60–61 | | |

606–019–00–6 | chlordekon (ISO) perchlorpentacyklo[5.3.0.02,6.03,9.04,8]dekan-5-on dekachlorpentacyklo[5.2.1.02,6.03,9.05,8]dekan-4-on 1,2,4,5,6,7,8,8,9,10-dekachlorpentacyklo[5.3.0.02,6.04,10.05,9]dekan-3-on | | 205–601–3 | 143–50–0 | Karc. kat. 3; R40 T; R24/25 N; R50–53 | T; N R: 24/25–40–50/53 S: (1/2-)22–36/37–45–60–61 | | |

606–034–00–8 | metribuzin (ISO) 4-amino-6-terc-butyl-3-(methylsulfanyl)-1,2,4-triazin-5(4 H)-on 4-amino-6-terc-butyl-3-(methylsulfanyl)-4,5-dihydro-1,2,4-triazin-5-on | | 244–209–7 | 21087–64–9 | Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–50/53 S: (2-)60-61 | | |

606–035–00–3 | chloridazon (ISO) 5-amino-4-chlor-2-fenylpyridazin-3(2H)-on pyrazon | | 216–920–2 | 1698–60–8 | R43 N; R50–53 | Xi; N R: 43–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

606–036–00–9 | chinomethionát (ISO) 6-methyl-2 H-[1,3]dithiolo[4,5-b]chinoxalin-2-on | | 219–455–3 | 2439–01–2 | Repr. kat. 3; R62 Xn; R20/21/22–48/22 Xi; R36 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 20/21/22–36–43–48/22–50/53–62 S: (2-)24–37–60–61 | | |

606–037–00–4 | triadimefon (ISO) 1-(4-chlorfenoxy)- 3,3-dimethyl-1-(1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-on | | 256–103–8 | 43121–43–3 | Xn; R22 N; R51–53 | Xn; N R: 22–51/53 S: (2-)61 | | |

606–044–00–2 | 2,4,6-trimethylbenzofenon fenyl(2,4,6-trimethylfenyl)methanon | | 403–150–9 | 954–16–5 | Xn; R22 Xi; R36 N; R50–53 | Xn; N R: 22–36–50/53 S: (2-)26–60–61 | | |

607–043–00-X | dikamba (ISO) 3,6-dichlor-2-methoxybenzoová kyselina | | 217–635–6 | 1918–00–9 | Xn; R22 Xi; R41 R52–53 | Xn; N R: 22–41–52/53 S: (2-)26-61 | | |

607–057–00–6 | kumachlor (ISO) 3-[1-(4-chlorfenyl)-3-oxobutyl]-4-hydroxykumarin3-[1-(4-chlorfenyl)-3-oxobutyl]-4-hydroxy-2 H-chromen-2-on | | 201–378–1 | 81–82–3 | Xn; R48/22 R52–53 | Xn R:48/22–52/53 S: (2-)37-61 | | |

607–058–00–1 | kumafuryl (ISO) fumarin (RS)-3-[1-(2-furyl)-3-oxobutyl)]-4-hydroxykumarin (RS)-3-[1-(2-furyl)-3-oxobutyl)]-4-hydroxy-2 H -chromen-2-on 3-[1-(2-furyl)-3-oxobutyl]-4-hydroxykumarin 3-[1-(2-furyl)-3-oxobutyl]-4-hydroxy-2 H -chromen-2-on | | 204–195–5 | 117–52–2 | T; R25–48/25 R52–53 | T R:25–48/25–52/53 S: (1/2-)37–45–61 | | |

607–079–00–6 | kelevan (ISO) ethyl-4-oxo-5-(perchlor-5-hydroxypentacyklo[5.3.0.02,6.03,9.04,8]dekan-5-yl)pentanoát ethyl-5-(1,2,3,5,6,7,8,9,10,10-dekachlor-4-hydroxypentacyklo[5.2.1.02,6.03,9.05,8]dekan-4-yl)-4-oxopentanoát ethyl-5-(1,2,4,5,6,7,8,8,9,10-dekachlor-3-hydroxypentacyklo[5.3.0.02,6.04,10.05,9]dekan-3-yl)-4-oxopentanoát | | — | 4234–79–1 | T; R24 Xn; R22 N; R51–53 | T; N R: 22–24–51/53 S: (1/2-)36/37–45–61 | | |

607–097–00–4 | benzen-1,2,4-trikarbox-1,2-anhydrid 1,2-anhydrid benzen-1,2,4-trikarboxylové kyseliny trimellitanhydrid | | 209–008–0 | 552–30–7 | Xi; R37–41 R42/43 | Xn R: 37–41–42/43 S: (2-)22–26–36/37/39 | | |

607–143–00–3 | pentanová kyselina valerová kyselina | | 203–677–2 | 109–52–4 | C; R34 R52–53 | C R:34–52/53 S: (1/2-)26–36–45–61 | | |

607–152–00–2 | 2,3,6-TBA (ISO) 2,3,6-trichlorbenzoová kyselina | | 200–026–4 | 50–31–7 | Xn; R22 N; R51–53 | Xn; N R: 22–51/53 S: (2-)61 | | |

607–153–00–8 | benazolin (ISO) (4-chlor-2-oxo-2,3-dihydro-1,3-benzothiazol-3-yl)octová kyselina | | 223–297–0 | 3813–05–6 | Xi; R36/38 R52–53 | Xi R:36/38–52/53 S: (2-)22-61 | | |

607–156–00–4 | chlorfenson (ISO) 4-chlorfenyl-4-chlorbenzen-1-sulfonát | | 201–270–4 | 80–33–1 | Xn; R22 Xi; R38 N; R50–53 | Xn; N R: 22–38–50/53 S: (2-)37–60–61 | | |

607–158–00–5 | sodná sůl chloroctové kyseliny chloroctan sodný | | 223–498–3 | 3926–62–3 | T; R25 Xi; R38 N; R50 | T; N R: 25–38–50 S: (1/2-)22–37–45–61 | | |

607–159–00–0 | chlorobenzilát (ISO) ethyl-2,2-bis(4-chlorfenyl)-2-hydroxyacetát ethyl-4,4'-dichlorbenzilát | | 208–110–2 | 510–15–6 | Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–50/53 S: (2-)60-61 | | |

607–176–00–3 | Směs: α-{3-[3-(2 H-benzotriazol-2-yl)-5-terc-butyl-4-hydroxyfenyl]propionyl}-ω-hydroxypoly(oxyethylen);α-{3-[3-(2 H-benzotriazol-2-yl)-5-terc-butyl-4-hydroxyfenyl]propionyl}-ω-({3-[3-(2 H-benzotriazol-2-yl)-5-terc-butyl-4-hydroxyfenyl]propionyl}oxy)poly(oxyethylen) | | 400–830–7 | — | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)36/37–61 | | |

607–188–00–9 | natrium-hydrogen-N-(2-karboxyethyl)-N-(oktadec-9-en-1-yl)maleinamát | | 402–970–4 | — | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24/37–61 | | |

607–209–00–1 | Směs: O,O′-diisopropyl-trisulfanbis(karbothioát); O,O′-diisopropyl-tetrasulfanbis(karbothioát); O,O′-diisopropyl-pentasulfanbis(karbothioát) | | 403–030–6 | — | Xn; R22 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 22–43–50/ 53 S: (2-)36/37–60–61 | | |

607–213–00–3 | ethyl-3,3-bis(terc-pentylperoxy)butanoát | | 403–320–2 | 67567–23–1 | E; R2 O; R7 R10 N; R51–53 | E; N R: 2–7–10–51/53 S: (2-)3/7–14–33–36/37/39–61 | | |

607–217–00–5 | 2-ethoxyethyl-[4-(7-fenyl-2,6-dioxo-2,6-dihydro-1,5-dioxa-s-indacen-3-yl)fenoxy]acetát | | 403–960–2 | — | R43 R53 | Xi R: 43-53 S: (2-)24–37–61 | | |

607–243–00–7 | natrium-3,6-dichlor-2-methoxybenzoát [1] natrium-3,6-dichlor-o-anisát [1] bis(2-hydroxyethyl)amonium-3,6-dichlor-2-methoxybenzoát [2] bis(2-hydroxyethyl)amonium-3,6-dichloranisát [2] (2-hydroxyethyl)amonium-3,6-dichlor-2-methoxybenzoát [3] (2-hydroxyethyl)amonium-3,6-dichloranisát [3] | | 217–846–3 [1] 246–590–5 [2] 258–527–9 [3] | 1982–69–0 [1] 25059–78–3 [2] 53404–28–7 [3] | R52–53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607–248–00–4 | Naftalam-natrium Natrium-N-(1-naftyl)ftalamát | | 205–073–4 | 132–67–2 | Xn; R22 | Xn R: 22 S: (2) | | |

607–249–00-X | (methylethylen)bis[oxy(methylethylen)]-diakrylát tripropylenglykol-diakrylát TPGDA | | 256–032–2 | 42978–66–5 | Xi; R36/37/38 R43 N; R51–53 | Xi; N R:36/37/38–43–51/53 S: (2-)24–37–61 | C ≥ 10 %: Xi; R36/37/38–43 1 % ≤ C < 10 %: Xi; R43 | |

607–252–00–6 | λ-cyhalothrin (ISO) Směs (1:1): (S)-[(3-fenoxyfenyl)kyanmethyl]-(1 R)-cis-3-((Z)-2-chlor-3,3,3-trifluorprop-1-en-1-yl)-2,2-dimethylcyklopropan-1-karboxylát a(R)-[(3-fenoxyfenyl)kyanmethyl]-(1 S)-cis-3-((Z)-2-chlor-3,3,3-trifluorprop-1-en-1-yl)-2,2-dimethylcyklopropan-1-karboxylát | | 415–130–7 | 91465–08–6 | T+; R26 T; R25 Xn; R21 N; R50–53 | T+; N R: 21–25–26–50/53 S: (1/2-)28–36/37/39–38–45–60–61 | | |

607–255–00–2 | fluroxypyr (ISO) [(4-amino-3,5-dichlor-6-fluor-2-pyridyl)oxy]octová kyselina | | — | 69377–81–7 | R52–53 | R: 52/53 S: 61 | | |

608–003–00–4 | akrylonitril | D E | 203–466–5 | 107–13–1 | F; Rll Karc. kat. 2; R45 T; R23/24/25 Xi; R37/38–41 R43 N; R51–53 | F; T; N R: 45–11–23-/24/25–37/38–41–43–51/53 S: 9–16–53–45–61 | C ≥ 20 %: T; R45–23/24/25–37/38–41–43 10 % ≤ C < 20 %: T; R45–23/24/25–41–43 5 % ≤ C < 10 %: T; R45–23/24/25–36–43 1 % ≤ C < 5 %:T; R45–23/24/25–43 0,2 % ≤ C < 1 %:T; R45–20/21/22 0,1 % ≤ C < 0,2 %: T; R45 | |

608–016–00–5 | 2,3,5,6-tetrachlor-1,4-dikyanbenzen tetrachlortereftalonitril | | 401–550–8 | 1897–41–2 | R43 N; R50–53 | Xi; N R: 43–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

609–030–00–4 | dinoterb (ISO) 2-terc-butyl-4,6-dinitrofenol | E | 215–813–8 | 1420–07–1 | Repr. kat. 2; R61 T+; R28 T; R24 R44 N; R50–53 | T+; N R: 61–24–28–44–50/53 S: 53–45–60–61 | | |

609–040–00–9 | nitrofen (ISO) (2,4-dichlorfenyl)(4-nitrofenyl)ether | E | 217–406–0 | 1836–75–5 | Karc. kat. 2; R45 Repr. kat. 2; R61 Xn; R22 N; R50–53 | T; N R: 45–61–22–50/53 S: 53–45–60–61 | | |

609–044–00–0 | teknazen (ISO) 1,2,4,5-tetrachlor-3-nitrobenzen | | 204–178–2 | 117–18–0 | Xn; R22 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 22–43–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

611–008–00–4 | 4-aminoazobenzen 4-(fenylazo)anilin | | 200–453–6 | 60–09–3 | Karc. kat. 2; R45 N; R50–53 | T; N R: 45–50/53 S: 53–45–60–61 | | |

611–013–00–1 | 4-hydroxy-3-{4-[2-methoxy-4-(3-sulfonatofenylazo)fenylazo]-3-methylfenylazo}-6-(3-sulfonatoanilino)naftalen-2-sulfonát trilithný | | 403–650–7 | 117409–78–6 | E; R2 N; R51–53 | E; N R: 2–51/53 S: (2-)35-61 | | |

611–031–00-X | 4,4'-[(4-iminocyklohexa-2,5-dien-1-yliden)methylen]dianilin-hydrochlorid CI Basic Red 9 CI basická červeň 9 | | 209–321–2 | 569–61–9 | Karc. kat. 2; R45 | T R: 45 S: 53-45 | | |

612–035–00–4 | 2-methoxyanilin o-anisidin | E | 201–963–1 | 90–04–0 | Karc. kat. 2; R45 Muta. kat. 3; R40 T; R23/24/25 | T R: 45–23/24/25 S: 53-45 | | |

612–042–00–2 | benzidin bifenyl-4,4'-diamin 4,4'-diaminobifenyl bifenyl-4,4'-diyldiamin | E | 202–199–1 | 92–87–5 | Karc. kat. 1; R45 Xn; R22 N; R50–53 | T; N R: 45–22–50/53 S: 53–45–60–61 | C ≥ 25 %: T; R45–22 0,01 % ≤ C < 25 %: T; R45 | |

612–051–00–1 | 4,4'-diaminodifenylmethan bis(4-aminofenyl)methan 4,4'-methylendianilin | E | 202–974–4 | 101–77–9 | Karc. kat. 2; R45 Muta. kat. 3; R40 T; R39/23/24/25Xn; R48/20/21/22 R43 N; R51–53 | T; N R: 45–39/23/24/25–43–48/20/21/22–51/53 S:53–45–61 | | |

612–081–00–5 | 3,3'-dimethylbenzidin, soli o-tolidin, soli | A E | 210–322–5 265–294–7 277–985–0 | 612–82–8 64969–36–4 74753–18–7 | Karc. kat. 2; R45 Xn; R22 N; R51–53 | T; N R: 45–22–51/53 S: 53–45–61 | | |

612–099–00–3 | 4-methyl-m-fenylendiamin4-methyl-1,3-fenylendiamin4-methylbenzen-1,3-diamin 2,4-toluendiamin | E | 202–453–1 | 95–80–7 | Karc. kat. 2; R45 T; R25 Xn; R21 Xi; R36 R43 N; R51–53 | T; N R: 45–21–25–36–43–51/53 S: 53–45–61 | | |

612–105–00–4 | 2-(piperazin-1-yl)ethylamin2-(piperazin-1-yl)ethan-1-amin | | 205–411–0 | 140–31–8 | Xn; R21/22 C; R34 R43 R52–53 | C R: 21/22–34–43–52/53 S: (1/2-)26–36/37/39–45–61 | | |

612–111–00–7 | 2-methyl-m-fenylendiamin2-methyl-1,3-fenylendiamin2-methylbenzen-1,3-diamin 2,6-toluendiamin | | 212–513–9 | 823–40–5 | Muta. kat. 3; R40 Xn; R21/22 R43 N; R51–53 | Xn; N R: 21/22–40–43–51/53 S: (2-)24–36/37–61 | | |

612–125–00–3 | 2-methyl-p-fenylendiamin2-methyl-1,4-fenylendiamin2-methylbenzen-1,4-diamin 2,5-toluendiamin | | 202–442–1 | 95–70–5 | T; R25 Xn; R20/21 R43 N; R51–53 | T; N R: 20/21–25–43–51/53 S: (1/2-)24–37–45–61 | | |

612–144–00–7 | flumetralin (ISO) N-(2-chlor-6-fluorbenzyl)-N-ethyl-2,6-dinitro-4-(trifluormethyl)anilin | | — | 62924–70–3 | Xi; R36/38 R4 3 N; R50–53 | Xi; N R: 36/38–43–50/53 S: (2-)36/37–60–61 | | |

612–151–00–5 | diaminotoluen toluendiamin methylfenylendiamin methylbenzendiamin | E | 246–910–3 | 25376–45–8 | Karc. kat. 2; R45 T; R25 Xn; R20/21 Xi; R36 R43 N; R51–53 | T; N R: 45–20/21–25–36–43–51/53 S: 53–45–61 | | |

613–018–00–4 | morfamkvat (ISO) 1,1'-bis[(3,5-dimethylmorfolin-4-karbonyl)methyl]-4,4'-bipyridin-1,1'-diium | | — | 7411–47–4 | Xn; R22 Xi; R36/37/38 R52–53 | Xn R: 22–36/37/38–52/53 S: (2-)22–36–61 | | |

613–031–00–5 | symklosen trichlorisokyanurová kyselina trichlor-1,3,5-triazintrion 1,3,5-trichlor-1,3,5-triazin-2(1H), 4(3H), 6(5H)-trion | | 201–782–8 | 87–90–1 | O; R8 Xn; R22 R31 Xi; R36/37 N; R50–53 | O; Xn; N R: 8–22–31–36/37–50/53 S: (2-)8–26–41–60–61 | | |

613–038–00–3 | 6-fenyl-1,3,5-triazin-2,4-diyldiamin 6-fenyl-1,3,5-triazin-2,4-diamin benzoguanamin | | 202–095–6 | 91–76–9 | Xn; R22 R52–53 | Xn R:22–52/53 S: (2-)61 | | |

613–042–00–5 | imazalil (ISO) 1-[2-(allyloxy)-2-(2,4-dichlorfenyl)ethyl]- 1 H-imidazol | | 252–615–0 | 35554–44–0 | Xn; R20/22 N; R41 N; R50–53 | Xn; N R: 20/22–41–50/53 S: (2-)26–39–60–61 | | |

613–043–00–0 | imazalil-sulfát (ISO) 1-[2-(allyloxy)-2-(2,4-dichlorfenyl)ethyl]- 1H -imidazol-1-ium-hydrogensulfát [1] (±)-1-[2-(allyloxy)-2-(2,4-dichlorfenyl)ethyl]-1H-imidazol-1-ium-hydrogensulfát | | 261–351–5 [1] 281–291–3 [2] | 58594–72–2 [1] 83918–57–4 [2] | Xn; R20/22 Xi; R41 N; R50–53 | Xn; N R: 20/22–41–50/53 S: (2-)26–39–60–61 | | |

613–066–00–6 | terbumeton (ISO) 2-(terc-butylamino)-4-(ethylamino)-6-methoxy-1,3,5-triazin | | 251–637–8 | 33693–04–8 | Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–50/53 S: (2-)60-61 | | |

613–091–00–2 | morfamkvat-dichlorid [1] morfamkvat-sulfát [2] 1,1'-bis[(3,5-dimethylmorfolin-4-karbonyl)methyl]-4,4'-bipyridin-1,1'-diium-dichlorid [1] 1,1'-bis[(3,5-dimethylmorfolin-4-karbonyl)methyl]-4,4'-bipyridin-1,1'-dium-disulfát [2] | | 225–062–8 [1] | 4636–83–3 [1] 29873–36–7 [2] | Xn; R22 Xi; R36/37/38 R52–53 | Xn; R: 22–36/37/38–52/53 S: (2-)22–36–61 | | |

613–098–00–0 | 1-oktylpyrrolidin-2-on 1-oktyl-2-pyrrolidon | | 403–700–8 | 2687–94–7 | C; R34 N; R51–53 | C; N R: 34–51/53 S: (1/2-)23–26–36/37/39–45–61 | | |

613–130–00–3 | hexakonazol (ISO) (RS)-2-(2,4-dichlorfenyl)-1-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)hexan-2-ol | | — | 79983–71–4 | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24–37–61 | | |

613–131–00–9 | pyrochilon (ISO) 1,2,5,6-tetrahydro-4 H-pyrrolo[3,2,1-ij]chinolin-4-on | | — | 57369–32–1 | Xn; R22 R52–53 | Xn R:22–52/53 S: (2-)61 | | |

613–134–00–5 | myklobutanil (ISO) 2-(4-chlorfenyl)-2-[(1 H-1,2,4-triazol-1-yl)methyl]hexannitril | | — | 88671–89–0 | Repr. kat. 3; R63 Xn; R22 Xi; R36 N; R51–53 | Xn; N R: 22–36–51/53–63 S: (2-)36/37–46–61 | | |

613–137–00–1 | methabenzthiazuron (ISO) 1-(1,3-benzothiazol-2-yl)-1,3-dimethylmočovina | | 242–505–0 | 18691–97–9 | N; R50–53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

613–139–00–2 | metsulfuron-methyl methyl-2-{N —[N-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)karbamoyl]sulfamoyl}benzoát | | — | 74223–64–6 | N; R50–53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

614–001–00–4 | nikotin (ISO) 3-(1-methylpyrrolidin-2-yl)pyridin | | 200–193–3 | 54–11–5 | T+; R27 T; R25 N; R51–53 | T+; N R: 25–27–51/53 S: (1/2-)36/37–45–61 | | |

614–006–00–1 | brucin 2,3-dimethoxystrychnidin-10-on | | 206–614–7 | 357–57–3 | T+; R26/28 R52–53 | T+ R:26/28–52/53 S: (1/2-)13–45–61 | | |

614–007–00–7 | brucin-sulfát [1] brucin-nitrát [2] brucin-(R)-(1-methylheptyl)-hydrogen-ftalát [3] brucin-(S)-(1-methylheptyl)-hydrogen-ftalát [4] | | 225–432–9 [1] 227–317–9 [2] 269–439–5 [3] 269–710–8 [4] | 4845–99–2 [1] 5786–97–0 [2] 68239–26–9 [3] 68310–42–9 [4] | T+; R26/28 R52–53 | T+ R: 26/28–52/53 S: (1/2-)13–45–61 | | |

615–006–00–4 | 2-methyl-m-fenylendiisokyanát [1] 2-methyl-1,3-fenylendiisokyanát [1] 4-methyl-m-fenylendiisokyanát [2] 4-methyl-1,3-fenylendiisokyanát [2] m-tolylidendiisokyanát [3] 5-methyl-1,3-fenylendiisokyanát [3] toluen-2,6-diisokyanát [1] toluen-2,4-diisokyanát [2] toluen-3,5-diisokyanát [3] | C | 202–039–0 [1] 209–544–5 [2] 247–722–4 [3] | 91–08–7 [1] 584–84–9 [2] 26471–62–5 [3] | Karc. kat. 3; R40 T+; R26 Xi; R36/37/38 R42/43 R52–53 | T+ R: 26–36/37/38–40–42/43–52/53 S: (1/2-)23–36/37–45–61 | C320 %: T+; R26–36/37/38–40–42/43 7 % ≤ C < 20 %: T+; R26–40–42/43 1 % ≤ C < 7 %: T; R23–40–42/43 0,1 % ≤ C < 1 %:Xn; R20–42 | 2 |

616–010–00–9 | natrium-tosylchloramid N-chlor-4-methylbenzen-1-sulfonamid, sodná sůl | | 204–854–7 | 127–65–1 | Xn; R22 R31 C; R34 R42 | C R: 22–31–34–42 S: (1/2-)7–22–26–36/37/39–45 | | |

616–034–00-X | pyrakarbolid (ISO) 6-methyl-3,4-dihydro-2H-pyran-5-karboxanilid | | 246–419–4 | 24691–76–7 | R52–53 | R: 52/53 S: 61 | | |

616–035–00–5 | cymoxanil N -[(ethylamino)karbonyl]-2-kyan-2-(methoxyimino)acetamid 1-ethyl-3-[2-kyan-2-(methoxyimino)acetyl]močovina | | 261–043–0 | 57966–95–7 | Xn; R22 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 22–43–50/53 S: (2-)36/37–60–61 | | |

617–004–00–9 | (1,2,3,4-tetrahydro-1-naftyl)hydroperoxid tetralinhydroperoxid | | 212–230–0 | 771–29–9 | O; R7 Xn; R22 C; R34 N; R50–53 | O; C; N R: 7–22–34–50/53 S:(1/2-)3/7–14–26–36/37/39–45–60–61 | C325 %: C; R22–34 10 % ≤ C < 25 %: C; R34 5 % ≤ C < 10 %: Xi; R36/37/38 | |

617–006–00-X | bis(α, α-dimethylbenzyl)peroxid bis(2-fenylpropan-2-yl)peroxid bis(1-fenyl-1-methylethyl)peroxid dikumylperoxid | | 201–279–3 | 80–43–3 | O; R7 Xi; R36/38 N; R51–53 | O; Xi; N R: 7–36/38–51/53 S: (2-)3/7–14–36/37/39–61 | | |

617–008–00–0 | dibenzoylperoxid | | 202–327–6 | 94–36–0 | E; R2 Xi; R36 R43 | E; Xi; R: 2–36–43 S: (2-)3/7–14–36/37/39 | | |

650–007–00–3 | chlordimeform (ISO) N2-(4-chlor-2-methylfenyl)-N1,N1-dimethylformimidamid N2-(4-chlor-o-tolyl)-N1,N1-dimethylformamidin | | 228–200–5 | 6164–98–3 | Karc. kat. 3; R40 Xn; R21/22 N; R50–53 | Xn; N R: 21/22–40–50/53 S: (2-)22–36/37–60–61 | | |

650–008–00–9 | drazoxolon (ISO) 4-[(2-chlorfenyl)hydrazono]-3-methylisoxazol-5(4 H)-on | | 227–197–8 | 5707–69–7 | T; R25 N; R50–53 | T; N R: 25–50/53 S: (1/2-)22–24–36/37–45–60–61 | | |

650–009–00–4 | chlordimeform-hydrochlorid N'-(4-chlor-o-tolyl)-N,N-dimethylformamidin-hydrochlorid N2-(4-chlor-2-methylfenyl)-N1,N1-dimethylformimidamid-hydrochlorid N2-(4-chlor-o-tolyl)-N1,N1-dimethylformamidin-hydrochlorid | | 243–269–1 | 19750–95–9 | Karc. kat. 3; R40 Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–40–50/53 S: (2-)22–36/37–60–61 | | |

650–033–00–5 | esfenvalerát (ISO) [(S)-(3-fenoxyfenyl)kyanmethyl]-(S)-2-(4-chlorfenyl)-3-methylbutanoát (S)-3-fenoxy-α-kyanbenzyl-(S)-2-(4-chlorfenyl)-3-methylbutanoát | | — | 66230–04–4 | T; R23/25 R43 N; R50–53 | T; N R: 23/25–43–50/53 S: (1/2-)24–36/37/39–45–60–61 | | |

650–041–00–9 | triasulfuron (ISO) 1-[2-(2-chlorethoxy)benzen-1-sulfonyl]-3-(4-methoxy-6-methyl-1,3,5-triazin-2-yl)močovina | | — | 82097–50–5 | N; R50–53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 1D

Indexové číslo | Chemický název | Poznámky k látkám | Číslo ES | Číslo CAS | Klasifikace | Označení | Koncentrační limity | Poznámky k přípravkům |

006–090–00–8 | 2-[(3-jodprop-2-yn-1-yl)oxy]ethyl-N-fenylkarbamát | | 408–010–0 | 88558–41–2 | Xn; R20 Xi; R41 R52–53 | Xn R: 20–41–52/53 S: (2-)22–26–39–61 | | |

014–016–00–0 | Směs: 1,3-di(hex-5-en-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyldisiloxan a 1,3-di(hex-x-en-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyldisiloxan | | 406–490–6 | — | N; R51–53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

015–164–00–9 | kalcium-dihydrogen-(1-hydroxyethylen)bisfosfonát dihydrát | | 400–480–5 | 36669–85–9 | R52–53 | R:52/53 S: 61 | | |

015–165–00–4 | Směs: S, S, S', S''-tetrafenyl-4,4'-sulfandiylbis(fenylsulfonium)-bis(hexafluorofosfát) a difenyl[4-(fenylsulfanyl)fenyl]sulfonium-hexafluorofosfát | | 404–986–7 | — | Xi; R41 N; R50–53 | Xi; N R: 41–50/53 S: (2-)15–26–39–60–61 | | |

015–166–00-X | 3,9-bis(2,6-di-terc-butyl-4-methylfenoxy)-2,4,8,10-tetraoxa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan | | 410–290–4 | 80693–00–1 | R53 | R:53 S: 61 | | |

015–167–00–5 | 3-[hydroxy(fenyl)fosfinoyl]propanová kyselina | | 411–200–6 | 14657–64–8 | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

601–050–00–1 | C10-C13-alkylderiváty benzenu | | 267–051–0 | 67774–74–7 | N; R50 | N R: 50 S: 61 | | |

601–051–00–7 | 4-fenylbut-1-en | | 405–980–7 | 768–56–9 | Xi; R38 N; R51–53 | Xi; N R: 38–51/53 S: (2-)37-61 | | |

602–083–00–4 | pentabromderivát difenyletheru pentabromdifenylether | | 251–084–2 | 32534–81–9 | Xn; R48/21/22 R64 N; R50–53 | Xn; N R: 48/21/22–50/53–64 S: (1/2-)36/37–45–60–61 | | |

602–084–00-X | 1,1-dichlor-1-fluorethan | | 404–080–1 | 1717–00–6 | N; R52–53–59 | N R: 52/53–59 S: 59-61 | | |

603–128–00–0 | 2-(fenylmethoxy)naftalen | | 405–490–3 | 613–62–7 | R53 | R:53 S: 61 | | |

603–129–00–6 | 1-terc-butoxypropan-2-ol | | 406–180–0 | 57018–52–7 | R10 Xi; R41 | Xi R: 10-41 S: (2-)26-39 | | |

603–130–00–1 | Směs isomerů: α-(dimethylbifenylyl)-ω-hydroxypoly(oxyethylen) | | 406–325–8 | — | Xn; R22 R52–53 | Xn R:22–52/53 S: (2-)39-61 | | |

603–131–00–7 | Směs (3:1):1-deoxy-1-[methyl(1-oxododecyl)amino]-D-glucitol; 1-deoxy-1-[methyl(1-oxotetradecyl)amino]-D-glucitol | | 407–290–1 | — | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

603–132–00–2 | 2-(hydroxymethyl)-6-isopropyl-9-methyl-1,4-dioxaspiro[4.5]dekan | | 408–200–3 | 63187–91–7 | Xi; R38–41 R52–53 | Xi R:38–41–52/53 S: (2-)26–37/39–61 | | |

603–133–00–8 | Směs:3-(4-amino-2-chlor-5-nitroanilino)propan-1,2-diol a 3,3'-[(2-chlor-5-nitro-1,4-fenylen)diimino]di(propan-1,2-diol) | | 408–240–1 | — | Xn; R22 R52–53 | Xn R:22–52/53 S: (2-)22–36–61 | | |

603–134–00–3 | Směs: alkyl(C1-C10)-dodecyldifenylethery a alkyl(C1-C10)-tetradecyldifenylethery (dodecyl a tetradecyl nerozvětvené) | | 410–450–3 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

603–135–00–9 | bis[2-(2-methoxyethoxy)ethanolato]bis(2,2', 2-nitrilotriethan-1-olato-N,O)titaničitý komplex | | 410–500–4 | — | Xi; R41 N; R51–53 | Xi; N R: 41–51/53 S: (2-)26–39–61 | | |

603–136–00–4 | 3-{4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-nitroanilino}propan-1-ol | | 410–910–3 | 104226–19–9 | R43 R52–53 | Xi R:43–52/53 S: (2-)24–37–61 | | |

603–137–00-X | Směs:1-deoxy-1-[methyl(1-oxohexadecyl)amino]-D-glucitol a 1-deoxy-1-[methyl(1-oxooktadecyl)amino]-D-glucitol | | 411–130–6 | — | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

603–138–00–5 | 3-(2,2-dimethyl-3-hydroxypropyl)toluen 2,2-dimethyl-3-(3-methylfenyl)propan-1-ol | | 403–140–4 | 103694–68–4 | R52–53 | R:52/53 S: 61 | | |

604–050–00-X | 4-chlor-o-kresol 4-chlor-2-methylfenol | | 216–381–3 | 1570–64–5 | T; R23 C; R 35 N; R50 | T; C; N R: 23–35–50 S: (1/2-)26–36/37/39–45–61 | C ≥ 25 %: T; C; R23–35 10 % ≤ C < 25 %: C;R20–35 5 % ≤ C < 10 %: C;R20–34 3 % ≤ C < 5 %: Xn;R20–36/37/38 1 % ≤ C < 3 %:Xi;R36/37/38 | |

604–051–00–5 | 3,5-bis(3,5-di-terc-butyl-4-hydroxybenzyl)-2,4,6-trimethylfenol | | 401–110–5 | 87113–78–8 | R52–53 | R:52/53 S: 61 | | |

604–052–00–0 | 2,2'-methylenbis[6-(2 H - benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)fenol] 6,6'-bis(2H -benzotriazol-2-yl)- 4,4'-bis(1,1,3,3-tetramethylbutyl)- 2,2'-methylendifenol | | 403–800–1 | 103597–45–1 | R53 | R:53 S: 61 | | |

604–053–00–6 | 4-terc - butyl-2-methyl-6-(1-methylpentadecyl)fenol | | 410–760–9 | 157661–93–3 | Xi; R38 R43 N; R50–53 | Xi; N R: 38–43–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

604–054–00–1 | Směs:2-methoxy-4-(4-methylidentetrahydropyran-2-yl)fenol a 2-methoxy-4-(4-methyl-3,6-dihydro-2H -pyran-2-yl)fenol | | 412–020–0 | — | R43 R52–53 | Xi R:43–52/53 S: (2-)24–37–61 | | |

604–055–00–7 | 4,4'-bis[(2,3-epoxypropyl)oxy]-3,3', 5,5'-tetramethylbifenyl | | 413–900–7 | 85954–11–6 | Muta. Kat.3; R40 | Xn R: 40 S: (2-)22–36–37 | | |

605–027–00–7 | Směs:3a, 4,5,6,7,7a-hexahydro-4,7-methano-1H-inden-6-karbaldehyd a 3a, 4,5,6,7,7a-hexahydro-4,7-methano-1H - inden-5-karbaldehyd | | 410–480–7 | — | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24–37–61 | | |

606–051–00–0 | 4-pentylcyklohexanon pentylcyklohexan-1-on | | 4–406–670–4 | 61203–83–6 | N; R51–53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

606–052–00–6 | 4-(N, N-dibutylamino)-2-hydroxy-2'-karboxybenzofenon 2-[4-(dibutylamino)-2-hydroxybenzoyl]benzoová kyselina | | 410–410–5 | 54574–82–2 | R52–53 | R:52/53 S: 61 | | |

607–272–00–5 | fluoroxypyr-meptyl (ISO) [1] fluroxypyr-butometyl (ISO) [2] methylheptyl-[(4-amino-3,5-dichlor-6-fluor-2-pyridyl)oxy]acetát [1] (2-butoxy-1-methylethyl)-[(4-amino-3,5-dichlor-6-fluor-2-pyridyl)oxy]acetát [2] | | 279–752–9 [1] — | 81406–37–3 [1] 154486–27–8 [2] | N; R50–53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

607–273–00–0 | amonium-7-{2,6-dimethyl-8-[(2,2-dimethylbutanoyl)oxy]- 1,2,6,7,8,8a-hexahydro-1-naftyl}-3,5-dihydroxyheptanoát | | 404–520–2 | — | R52–53 | R:52/53 S: 61 | | |

607–274–00–6 | {2-[benzyl(methyl)amino]ethyl}-3-aminobut-2-enoát | | 405–350–1 | 54527–73–0 | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24–37–61 | | |

607–275–00–1 | natrium-4-(benzoyloxy)benzen-1-sulfonát | | 405–450–5 | 66531–87–1 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

607–276–00–7 | [bis(2-ethylhexanoato) bis(1-methylimidazol)]zinečnatý komplex | | 405–635–0 | — | Xi; R38–41 N; R50–53 | Xi; N R: 38–41–50/53 S: (2-)26–37/39–60–61 | | |

607–277–00–2 | Směs:2-(hexylsulfanyl)ethylamin-hydrochlorid a natrium-propionát | | 405–720–2 | — | Xn; R22 Xi; R41 R43 N; R51–53 | Xn; N R: 22–41–43–51/53 S: (2-)24–26–37/39–61 | | |

607–278–00–8 | Směs:alkyl(C7-C9 rozvětvené a nerozvětvené)-3-[3-(2 H - benzotriazol-2-yl)-5-terc-butyl-4-hydroxyfenyl]propanoáty | | 405–760–0 | — | Xi; R41 R43 R52–53 | Xi R: 41–43–52/53 S: (2-)24–26–37/39–61 | | |

607–279–00–3 | Směs:(oktadecylimino)diethylen-bis(hydrogen-maleinát) a (oktadecylimino)diethylen-(hydrogen-ftalát)-(hydrogen-maleinát) | | 405–960–8 | — | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24–37–61 | | |

607–280–00–9 | 4-chlor-1-hydroxybutan-1-sulfonát sodný natrium-4-chlor-1-hydroxybutan-1-sulfonát | | 406–190–5 | 54322–20–2 | Xn; R22 Xi; R36 R43 | Xn R: 22–36–43 S: (2-)22–26–36/37 | | |

607–281–00–4 | Směs:alkyl(C7-C9 rozvětvené a lineární)-3-[3-(2H-benzotriazol-2-yl)-5-terc-butyl-4-hydroxyfenyl]propanoáty | | 407–000–3 | 127519–17–9 | N; R51–53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

607–282–00-X | 2-(acetoxymethyl)-4-(benzyloxy)butyl-acetát | | 407–140–5 | 131266–10–9 | R52–53 | R: 52/53 S: 61 | | |

607–283–00–5 | ethyl-(E)-4-fenyl-4-oxobut-2-enoátethyl-(E)-4-fenyl-4-oxokrotonát | | 408–040–4 | 15121–89–8 | Xn; R21/22 Xi; R38–41 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 21/22–38–41–43–50/53 S: (2-)26–36/37/39–60–61 | | |

607–284–00–0 | Směs (9:1):natrium-3,3'-{(1,4-fenylen)bis[(karbonylimino)(propan-3,1-diyl)imino]}bis(10-amino-6,13-dichlor[1,4]benzoxazino[2,3-b]fenoxazin-4,11-disulfonát) a lithium-3,3'-{(1,4-fenylen)bis[(karbonylimino)(propan-3,1-diyl)imino]}bis(10-amino-6,13-dichlor[1,4]benzoxazino[2,3-b]fenoxazin-4,11-disulfonát) | | 410–040–4 | 136213–76–8 | N; R51–53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

607–285–00–6 | Směs:7-(3-aminobenzensulfonamido)naftalen-1,3-disulfonová kyselina, kalium-7-(3-aminobenzensulfonamido)naftalen-1,3-disulfonát a natrium-7-(3-aminobenzensulfonamido)naftalen-1,3-disulfonát | | 410–065–0 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22–24–37 | | |

607–286–00–1 | Směs:kalium- a natrium-7-[4-({4-[(2-hydroxy-1-naftyl)azo]fenyl}azo)benzensulfonamido]naftalen-1,3-disulfonát | | 410–070–8 | 141880–36–6 | R43 R52–53 | Xi R:43–52/53 S: (2-)22–24–37–61 | | |

607–287–00–7 | methyl-[1-methyl-2-(methakryloyloxy)ethyl]-1,2,3,6-tetrahydroftalát | | 410–140–8 | — | R52–53 | R:52/53 S: 61 | | |

607–288–00–2 | [c-(N -{3-[(1-{3-[(2,6(4,6)-dichlor-5-kyanpyrimidin-4(2)-yl)methylamino]propyl}-2-hydroxy-4-methyl-6-oxo-1,6-dihydro-3-pyridyl)azo]-4-sulfonatofenyl}sulfamoyl)-a,b,d -trisulfonatoftalocyanin]nikelnatý komplex, tetrasodná sůl; c = 15, 16, 17 nebo 18, a = 1, 2, 3 nebo 4, b = 8, 9, 10 nebo 11, d = 22, 23, 24 nebo 25 | | 410–160–7 | 148732–74–5 | Xi; R36 R43 R52–53 | Xi R: 36–43–52/53 S: (2-)22–26–36/37–61 | | |

607–288–00–8 | 3-[(3-{N —[4-(2,4-di-terc-pentylfenoxy)butyl]karbamoyl}-4-hydroxy-1-naftyl)sulfanyl]propanová kyselina | | 410–370–9 | 105488–33–3 | R53 | R:53 S: 61 | | |

607–290–00–3 | Směs (o neznámém poměru):amonium-1-alkyl(C14-C18)-4-[3-(allyloxy)-2-hydroxypropyl]-2-sulfonatobutandioát a amonium-4-alkyl(C14-C18)-1-[3-(allyloxy)-2-hydroxypropyl]-2-sulfonatobutandioát | | 410–540–2 | — | Xi; R38 R43 N; R50–53 | Xi; N R: 38–43–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

607–291–00–9 | dodecyl-ω-cyklopentyl(nebo cyklohexyl)alkanoát | | 410–630–1 | 104051–92–5 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

607–292–00–4 | Směs:[2-(alkyl(C12)oxy)-1-(methoxymethyl)ethoxy]octová kyselina a [2-(alkyl(C14)oxy)-1-(methoxymethyl)]octová kyselina | | 410–640–6 | — | Xi; R38–41 N; R50–53 | Xi; N R: 38–41–50/53 S: (2-)26–37/39–60–61 | | |

607–293–00-XSměs: | 1-(2-aminoethyl)piperazin-1,4-diium-[(2,4,6-trimethylnonyl)fenoxy]benzendisulfonát a 1-(2-aminoethyl)piperazin-1,4-diium-[bis(2,4,6-trimethylnonyl)fenoxy]benzendisulfonát | | 410–650–0 | — | Xi; R41 R43 N; R51–53 | Xi; N R: 41–43–51/53 S: (2-)26–36/37/39–61 | | |

607–294–00–5 | natrium-2-(benzoyloxy)-1-hydroxyethan-1-sulfonát | | 410–680–4 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

607–295–00–0 | Směs:tetranatrium-fosfonobutandioát a hexanatrium-fosfonobutan-1,2,3,4-tetrakarboxylát | | 410–800–5 | — | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24–37–61 | | |

607–296–00–6 | Směs:tetraestery pentaerythritolu, heptanová kyselina a 2-ethylhexanová kyselina | | 410–830–9 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

607–297–00–1 | 3,3'-(1,4-fenylendimethyliden)bis(2-oxobornan-10-sulfonová kyselina)2,2'-dioxo-3,3'-(1,4-fenylendimethyliden)bis(1,7,7-trimethylbicyklo[2.2.1]heptan-1-methansulfonová kyselina) | | 410–960–6 | 92761–26–7 | Xi; R41 | Xi R: 41 S: (2-)26-39 | | |

607–298–00–7 | [2-(trimethylamonio)ethyl]-4-sulfonatobenzoát | | 411–010–3 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22–36/37 | | |

607–299–00–2 | methyl-3-(acetylsulfanyl)-2-methylpropanoát | | 411–040–7 | 97101–46–7 | Xn; R22 R43 N; R50–53 | Xn; N R: 22–43–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

607–300–00–6 | [a-(N-{4-[(5-chlor-2,6-difluorpyrimidin-4-yl)amino]-3-karboxylatofenyl}sulfamoyl)-b-sulfamoyl-c, d-sulfonatoftalocyanin]měďnatý komplex, trisodná sůl; a = 1,2,3 nebo 4, b = 8, 9, 10 nebo 11, c = 15, 16, 17 nebo 18, d = 22, 23, 24 nebo 25 | | 411–430–7 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)22–24–37 | | |

607–301–00–1 | Směs:dodekanová kyselina a dodekanoáty oligo(1-7)laktátů | | 411–860–5 | — | Xi; R38–41 R43 N; R51–53 | Xi; N R: 38–41–43–51/53 S: (2-)24–26–37/39–61 | | |

607–302–00–7 | Směs:tetradekanová kyselina a tetradekanoáty oligo(1-7)laktátů | | 411–910–6 | — | Xi; R38–41 R43 N; R51–53 | Xi; N R: 38–41–43–51/53 S: (2-)24–26–37/39–61 | | |

607–303–00–2 | 1-cyklopropyl-6,7-difluor-4-oxo-1,4-dihydrochinolin-3-karboxylová kyselina | | 413–760–7 | 93107–30–3 | Repr. kat.3; R62 R52–53 | Xn R: 62–52/53 S: (2-)22–36/37–61 | | |

608–023–00–3 | 4-(4-chlorfenyl)-2-fenyl-2-[(1H- 1,2,4-triazol-1-yl)methyl]butannitril | | 406–140–2 | 114369–43–6 | N; R50–53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

608–024–00–9 | 2-{4-[butyl(fenethyl)amino]fenyl}ethen-1,1,2-trikarbonitril | | 407–650–8 | 97460–76–9 | R53 | R:53 S: 61 | | |

608–025–00–4 | [2-nitro-4,5-bis(benzyloxy)fenyl]acetonitril | | 410–970–0 | 117568–27–1 | R53 | R:53 S: 61 | | |

609–053–00-X | hydrazinium-trinitromethanid | | 414–850–9 | — | E; R3 O; R8 Karc. kat. 2; R45 T; R23/25 R43 | E; T R: 45–3–8–23/25–43 S: 53-45 | | |

610–010–00–2 | 1-brom-2-(2-furyl)-1-nitroethen | | 406–110–9 | 35950–52–8 | Xn; R22–48/22 C; R34 R43 N; R50–53 | C; N R: 22–34–43–48/22–50/53 S: (1/2-)22–26–36/37/39–45–60–61 | | |

611–043–00–5 | Směs (2:1:1):[bis(6-{[1-(N-fenylkarbamoyl)-2-hydroxyprop-1-en-1-yl]azo}-5-sulfamoyl-3-sulfonatonaftalen-2-azo-1'-benzen-1,2'-diolato)]chromitan trisodný, [bis{6-[(2-amino-4-hydroxyfenyl)azo]- nebo 6-[(2-amino-6-hydroxyfenyl)azo]- nebo 6-[(4-amino-2-hydroxyfenyl)azo]-5-sulfamoyl-3-sulfonatonaftalen-2-azo-1'-benzen-1,2'-diolato}]chromitan trisodný a[{6-[(2-amino-4-hydroxyfenyl)azo]- nebo 6-[(2-amino-6-hydroxyfenyl)azo]- nebo 6-[(4-amino-2-hydroxyfenyl)azo]-5-sulfamoyl-3-sulfonatonaftalen-2-azo-1'-benzen-1,2'-diolato}(6-{[1-(N-fenylkarbamoyl)-2-hydroxyprop-1-en-1-yl]azo}-5-sulfamoyl-3-sulfonatonaftalen-2-azo-1'-benzen-1,2'-diolato)]chromitan trisodný | | 402–850–1 | | Xi; R41 R52–53 | Xi R: 41–52/53 S: (2-)26–39–61 | | |

611–044–00–0 | Směs:[bis(5-nitrobenzen-1-azo-1'-naftalen-2,2'-diolato)]chromitan terc-alkyl(C12-C14)amonný, [bis(4-nitrobenzen-1-azo-1'-naftalen-2,2'-diolato)]chromitan terc-alkyl(C12-C14)amonný, [bis(5-terc-butyl-3-nitrobenzen-1-azo-1'-naftalen-2,2'-diolato)]chromitan terc-alkyl(C12-C14)amonný, [(5-terc-butyl-3-nitrobenzen-1-azo-1'-naftalen-2,2'-diolato)(5-nitrobenzen-1-azo-1'-naftalen-2,2'-diolato)]chromitan terc-alkyl(C12-C14)amonný a[(4(5)-nitrobenzen-1-azo-1'-naftalen-2,2'-diolato) (3-nitro-5-pentylbenzen-1-azo-1'-naftalen-2,2'-diolato)]chromitan terc-alkyl(C12-C14)amonný | | 403–720–7 | 117527–94–3 | N; R51–53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

611–045–00–6 | 2-({4-[(4-acetoxybutyl)ethylamino]-2-methylfenyl}azo)-3-acetyl-5-nitrothiofen | | 404–830–8 | — | R53 | R:53 S: 61 | | |

611–046–00–1 | 4,4'-diamino-2-methylazobenzen2-methylazobenzen-4,4'-diamin | | 407–590–2 | 43151–99–1 | T; R25 Xn; R48/22 R43 N; R50–53 | T; N R: 25–43–48/22–50/53 S: (1/2-)22–28–36/37–45–60–61 | | |

611–047–00–7 | Směs (1:1):2-({4-[(2-acetoxyethyl)ethylamino]fenyl}azo)-5,6-dichlorbenzothiazol a 2-({4-[(2-acetoxyethyl)ethylamino]fenyl}azo)-6,7-dichlorbenzothiazol | | 407–890–3 | 111381–11–4 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611–048–00–2 | Směs (1:1):2-({4-[bis(2-acetoxyethyl)amino]fenyl}azo)-5,6-dichlorbenzothiazol a 2-({4-[bis(2-acetoxyethyl)amino]fenyl}azo)-6,7-dichlorbenzothiazol | | 407–900–6 | 111381–12–5 | R53 | R: 53 S: 61 | | |

611–049–00–8 | Směs (2:1:1)7-[(4-{[3-(diethylamino)propyl]amino}-6-{[3-(diethylamonio)propyl]amino}-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-3-{[4-(fenylazo)fenyl]azo}-4-hydroxynaftalen-2-sulfonát, kyselina octová a mléčná kyselina (2:1:1) | | 408–000–6 | 118658–98–3 | Xn; R48/22 R43 R52–53 | Xn R: 43–48/22–52/53 S: (2-(22–36/37–61 | | |

611–051–00–9 | 2-({4-[ethyl(2-hydroxyethyl)amino]-2-methylfenyl}azo)-6-methoxy-3-methylbenzothiazolium-chlorid | | 411–110–7 | 136213–74–6 | N; R50–53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

611–052–00–4 | [aqua{4-[(2-hydroxy-3,5-dinitrofenyl) azo]-6-[(6-sulfonato-1-naftyl)azo]benzen-1,3-diolato}]železnatý komplex, sodná sůl | | 400–720–9 | — | R52–53 | R: 52/53 S: 61 | | |

612–156–00–2 | Směs:trihexadecyl(methyl)amonium-chlorid a dihexadecyl(dimethyl)amonium-chlorid | | 405–620–9 | — | Xi; R41 N; R50–53 | Xi; N R: 41–50/53 S: (2-)26–39–60–61 | | |

612–157–00–8 | (Z)-1-(1-benzothiofen-2-yl)ethan-1-on-oxim-hydrochlorid | | 410–780–8 | — | Xn; R22–48/22 Xi; R41 R43 N; R51–53 | Xn; N R: 22–41–43–48/22–51/53 S: (2-)22–26–36/37/39–61 | | |

612–158–00–3 | Směs:[bis(5-alkyl(rozvětvený C12))-2-hydroxybenzaldoximato)]měďnatý komplex a 4-dodecyl-2-hydroxybenzaldoxim[bis(5-alkyl(rozvětvený C12))-2-hydroxybenzaldoximato)]měďnatý komplex a 4-dodecylsalicylaldoxim | | 410–820–4 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

612–159–00–9 | reakční produkty směsi 2,2,4-trimethyl- a 2,4,4-trimethylhexan-1,6-diaminu (v seznamu EINECS), derivátů [(alkyl(C10-C16)oxy)methyl]oxiranu (Epoxid 8) a 4-methylbenzen-1-sulfonové kyseliny | | 410–880–1 | — | Xn; R22 C; R34 N; R50–53 | C; N R: 22–34–50/53 S: (1/2-)23–26–36/37/39–45–60–61 | | |

613–149–00–7 | 2-terc-butyl-5-[(4-terc-butylbenzyl)sulfanyl]-4-chlorpyridazin-3(2H)-on | | 405–700–3 | 96489–71–3 | T; R23/25 N; R50–53 | T; N R: 23/25–50/53 S: (1/2-)36/37–45–60–61 | | |

613–150–00–2 | 2,2'-[piperazin-1,4-diyldi(propan-1,3-diyl)]bis(benzimidazo[2,1-b]benzo[lmn][3,8]fenanthrolin-1,3,6-trion) | | 406–295–6 | — | R53 | R:53 S: 61 | | |

613–151–00–8 | 1-(2-deoxy-3-O-mesyl-5-O-trityl-β-D-threo-pentofuranosyl)-5-methylpyrimidin-2(1H), 4(3 H)-dion | | 406–360–9 | 104218–44–2 | R53 | R:53 S: 61 | | |

613–152–00–3 | fenyl-N-(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)karbamát | | 406–600–2 | 89392–03–0 | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24–37–61 | | |

613–153–00–9 | 2,3,5-trichlorpyridin | | 407–270–2 | 16063–70–0 | R52–53 | R:52/53 S: 61 | | |

613–154–00–4 | 2-amino-4-chlor-6-methoxypyrimidin | | 410–050–9 | 5734–64–5 | Xn; R22 | Xn R: 22 S: (2-)22 | | |

613–155–00-X | 5-chlor-2,3-difluorpyridin | | 410–090–7 | 89402–43–7 | R10 Xn; R22 R52–53 | Xn R: 10–22–52/53 S: (2-)23–36–61 | | |

613–156–00–5 | 2-butyl-4-chlor-5-formylimidazol 2-butyl-5-chlorimidazol-4-karbaldehyd | | 410–260–0 | 83857–96–9 | R43 N; R51–53 | Xi; N R: 43–51/53 S: (2-)24–37–61 | | |

613–157–00–0 | 2,4-diamino-5-(methoxymethyl)pyrimidin 5-(methoxymethyl)pyrimidin-2,4-diamin | | 410–330–0 | 54236–98–5 | Xn; R22–48/22 Xi; R36 | Xn R: 22–36–48/22 S: (2-)22–26–36 | | |

613–158–00–6 | 2,3-dichlor-5-(trifluormethyl)pyridin | | 410–340–5 | 69045–84–7 | Xn; R20/22 Xi; R41 R43 N; R51–53 | Xn; N R: 20/22–41–43–51/53 S: (2-)24–26–37/39–61 | | |

613–159–00–1 | 4-[2-(4-terc-butylfenyl)ethoxy]chinazolin | | 410–580–0 | 120928–09–8 | T; R25 Xn; R20 N; R50–53 | T; N R: 20–25–50/53 S: (1/2-)37–45–60–61 | | |

613–160–00–7 | 2-methyl-2,5-diazabicyklo[2.2.1]heptan-dihydrobromid | | 411–000–9 | 125224–62–6 | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

615–022–00–1 | methyl-3-(isokyanatosulfonyl)thiofen-2-karboxylát | | 410–550–7 | 79277–18–2 | E; R2 R14 Xn; R48/22 R42/43 | E; Xn R: 2–14–42/43–48/22 S: (2-)22–30–35–36/37 | | |

615–023–00–7 | methylester 2-[(isokyanatosulfonyl)methyl]benzoové kyselinymethyl-2-[(isokyanatosulfonyl)methyl]benzoát | | 410–900–9 | 83056–32–0 | R10 R14 Muta. kat. 3; R40 Xn; R20–48/22 Xi; R41 R42 | Xn R: 10–14–20–40–41–42–48/22 S: (2-)23–26–36/37/39 | | |

616–044–00–4 | N-(3,5-dichlor-4-ethyl-2-hydroxyfenyl)-2-(3-pentadecylfenoxy)butanamid | | 402–510–2 | — | N; R51–53 | N R: 51/53 S: 61 | | |

616–045–00-X | 2'-[(4-chlor-5-formyl-3-kyan-2-thienyl)azo]- 5'-(diethylamino)-2-methoxyacetanilid | | 405–190–2 | 122371–93–1 | R43 R53 | Xi R: 43-53 S: (2-)22–24–37–61 | | |

616–046–00–5 | N -[2-(6-chlor-7-methylpyrazolo[1,5-b][1,2,4]triazol-4-yl)propyl]-2-(2,4-di-terc-pentylfenoxy)oktanamid | | 406–390–2 | — | N; R50–53 | N R: 50/53 S: 60-61 | | |

616–047–00–0 | Směs:N,N′,N″,N′′′ - tetraalkyl(C16)-2,2′, 2″, 2′′′ (ethylendinitrilo)tetraacetamid a N, N′,N″,N′′′ - tetraalkyl(C18)- 2,2′, 2′′, 2′′′-(ethylendinitrilo)tetraacetamid | | 406–640–0 | — | R43 | Xi R: 43 S: (2-)24-37 | | |

616–048–00–6 | 3'-(trifluormethyl)isobutyranilid | | 406–740–4 | 1939–27–1 | Xn; R48/22 N; R51–53 | Xn; N R: 48/22–51/53 S: (2-)22–36–61 | | |

616–049–00–1 | 2-(2,4-di-terc-butylfenoxy)-N-(3,5-dichlor-4-ethyl-2-hydroxyfenyl)hexanamid | | 408–150–2 | 99141–89–6 | R53 | R:53 S: 61 | | |

616–050–00–7 | 1-[2,5-dichlor-4-(1,1,2,3,3,3-hexafluorpropoxy)fenyl]-3-(2,6-difluorfenyl)močovina | | 410–690–9 | 103055–07–8 | R43 N; R50–53 | Xi; N R: 43–50/53 S: (2-)24–37–60–61 | | |

616–051–00–2 | Směs:3,3'-bis(4-methylfenyl)- 1,1'-(4-methyl-1,3-fenylen)dimočovina a 3,3'-bis(4-methylfenyl)-1,1'-(2-methyl-1,3-fenylen)dimočovina Směs:2,4-bis[3-(4-methylfenyl)ureido]toluen a 2,6-bis[(3-(4-methylfenyl)ureido]toluen | | 411–070–0 | — | R53 | R: 53 S: 61 | | |

617–015–00–9 | bis(4-methylbenzoyl)peroxid | | 407–950–9 | 895–85–2 | E; R2 O; R7 N; R50–53 | E; N R: 2–7–50/53 S: (2-)7–14–36/37/39–47–60–61 | | |

650–032–00-X | cyprokonazol (ISO) (2R, 3R)-, (2 S, 3 S)-, (2 R, 3 S)-, (2 S, 3 R)-2-(4-chlorfenyl)-3-cyklopropyl-1-(1H- 1,2,4-triazol-1-yl)butan-2-ol | | — | 94361–06–5 | Repr. kat. 3; R63 Xn; R22 N; R50–53 | Xn; N R: 22–50/53–63 S: (2-)36/37–60–61 | | |

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 2

POVAHA SPECIFICKÝCH RIZIK SPOJENÝCH S NEBEZPEČNÝMI LÁTKAMI A PŘÍPRAVKY

Viz směrnice Komise 2001/59/ES,

Úř. věst. L 332, 28.12.2000, s. 81

.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 3A

STANDARDNÍ POKYNY PRO BEZPEČNÉ ZACHÁZENÍ S NEBEZPEČNÝMI LÁTKAMI A PŘÍPRAVKY

Viz směrnice Komise 2001/59/ES,

Úř. věst. L 332, 28.12.2000, s. 81

.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 3B

STANDARDNÍ POKYNY PRO BEZPEČNÉ ZACHÁZENÍ S NEBEZPEČNÝMI LÁTKAMI A PŘÍPRAVKY

Viz směrnice Komise 2001/59/ES,

Úř. věst. L 332, 28.12.2000, s. 81

.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 4A

"B.10 MUTAGENITA — ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ ABERACE U SAVCŮ IN VITRO

1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 473 — Zkouška na chromozomové aberace u savců in vitro (1997).

1.1 ÚVOD

Zkouška na chromozomové aberace u savců in vitro má identifikovat činitele, které způsobují strukturní chromozomové aberace v kultivovaných buňkách savců (1, 2, 3). Rozlišují se dva typy strukturních aberací: chromozomové a chromatidové. U většiny chemických mutagenů jsou indukované aberace chromatidového typu, avšak chromozomové aberace se rovněž vyskytují. Nárůst polyploidie může znamenat, že chemická látka má schopnost indukovat numerické aberace. Tato metoda však není určena ke stanovení numerických aberací a není k tomuto účelu rutinně používána. Chromozomové mutace a podobné jevy jsou příčinou mnoha geneticky podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho důkazů o tom, že chromozomové mutace a s nimi související jevy způsobující změny v onkogenech a v genech somatických buněk tlumících nádory, mají podíl na indukci rakoviny u člověka a u pokusných zvířat.

Ke zkoušce na chromozomové aberace in vitro mohou být použity stabilizované buněčné linie, buněčné kmeny nebo primární buněčné kultury. Použité buňky jsou vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stálosti karyotypu, počtu chromozomů, rozmanitosti chromozomů a spontánní četnosti chromozomových aberací.

Zkoušky prováděné in vitro obecně vyžadují použití vnějšího zdroje metabolické aktivace. Tento metabolický aktivační systém nemůže zcela napodobit podmínky in vivo u savců. Je třeba se zcela vyvarovat podmínek, které by vedly k pozitivním výsledkům, jež neodrážejí vlastní mutagenitu a může k nim dojít změnou pH, osmolality nebo vysokých úrovní cytotoxicity (4, 5).

Tato zkouška se používá ke zjištění možných mutagenů a karcinogenů pro savce. Mnoho sloučenin, pro něž je tato zkouška pozitivní, jsou pro savce karcinogeny; mezi touto zkouškou a karcinogenitou však není absolutní korelace. Korelace závisí na chemické třídě a přibývají důkazy o tom, že existují karcinogeny, které nejsou zjištěny touto zkouškou, neboť zřejmě působí jinými mechanismy než přímým poškozením DNA.

Viz také Obecný úvod, část B.

1.2 DEFINICE

Chromatidová aberace : strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu jednotlivých chromatid nebo zlomu a opětného spojení chromatid.

Chromozomová aberace : strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž místě.

Endoreduplikace : proces, při kterém v jádře po S-fázi replikace DNA nedojde k mitóze, nýbrž následuje další S-fáze. Výsledkem jsou chromozomy se 4, 8, 16… chromatidami.

Gap : achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimální odchylkou chromatid.

Mitotický index : podíl buněk, které se nacházejí v metafázi, z celkového počtu buněk v populaci; udává stupeň proliferace této populace.

Numerická aberace : odchylka počtu chromozomů od normálního počtu obvyklého u použitého typu buněk.

Polyploidie : násobek haploidního počtu chromozomových sad (n), jiný než diploidní (tj. 3 n, 4 n atd.).

Strukturní aberace : mikroskopicky pozorovatelné změny struktury chromozomů při buněčném dělení ve stadiu metafáze; jeví se jako delece a fragmenty, intrachromozomální nebo interchromozomální změny.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Buněčné kultury jsou vystaveny zkoušené látce, a to s metabolickou aktivací a bez ní. V předem stanovených intervalech po zkoušené látce se do buněčných kultur přidá látka zastavující metafázi (např. Colcemid® nebo kolchicin), kultury se sklidí, obarví a přítomnost chromozomových aberací se zjistí mikroskopickým pozorováním buněk.

1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1 Přípravky

1.4.1.1 Buňky

Mohou být použity různé buněčné linie, kmeny nebo primární buněčné kultury, včetně lidských buněčných linií (např. fibroblasty křečka čínského, lymfocyty periferní krve člověka nebo jiných savců).

1.4.1.2 Média a kultivační podmínky

Pro udržování kultur by měla být použita vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentrace CO2, teplota a vlhkost). U stabilizovaných buněčných linií a kmenů by měla být rutinně kontrolována stabilita modální hodnoty počtu chromozomů a mělo by být kontrolováno, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty; v případě kontaminace by neměly být použity. Pro použité buňky a inkubační podmínky by měla být známa normální délka buněčného cyklu.

1.4.1.3 Příprava kultur

Stabilizované buněčné linie a kmeny: buňky se pomnoží z kmenových kultur, nasadí se do kultivačního média v takové hustotě, aby nedosáhly konfluence před sklizením, a inkubují se při 37 °C.

Lymfocyty: krev ošetřená antikoagulantem (např. heparinem) nebo oddělené lymfocyty zdravých probandů se přidají do kultivačního média obsahujícího mitogen (např. fytohemaglutinin) a inkubují se při 37 °C.

1.4.1.4 Metabolická aktivace

Buňky by měly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodnou metabolickou aktivací a bez ní. Nejčastěji používaným systémem je kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců zpracovaná činidlem indukujícím enzymy, jako je Aroclor 1254 (6, 7, 8 a 9), nebo směs fenobarbitonu a β-naftoflavonu (10, 11 a 12).

Postmitochondriální frakce je v konečném testovacím médiu obvykle používána v koncentracích 1 — 10 % obj. Stav metabolického aktivačního systému může záviset na třídě chemické látky, která je zkoušena. V některých případech může být vhodné použít více než jednu koncentraci postmitochondriální frakce.

Řada výsledků vývoje, včetně přípravy geneticky modifikovaných buněčných linií exprimujících specifické aktivační enzymy, poskytuje možnosti pro endogenní aktivaci. Volba použitých buněčných linií by měla být vědecky zdůvodněna (např. důležitostí isoenzymu cytochromu P450 pro metabolismus zkoušené látky).

1.4.1.5 Zkoušená látka/příprava

Pevné zkoušené látky by měly být před aplikací na buňky rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být přidány přímo k testovacím systémům a/nebo mohou být před aplikací zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

1.4.2 Zkušební podmínky

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by mělo být mimo podezření, že reaguje se zkoušenou látkou, a mělo by být slučitelné s přežitím buněk a s aktivitou S9. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul. Při zkoušení látek nestálých ve vodě by měla být použita organická rozpouštědla neobsahující vodu. Vodu lze odstranit přidáním molekulového síta.

1.4.2.2 Expoziční koncentrace

Mezi kritéria, která mají být zohledněna při stanovení nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v testovacím systému a změny pH nebo osmolality.

Cytotoxicita by měla být stanovena s metabolickou aktivací a bez ní v hlavním experimentu za použití vhodných indikátorů buněčné integrity a růstu, jako jsou stupeň konfluence, počet životaschopných buněk nebo mitotický index. Může být výhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžném experimentu.

Měly by být použity alespoň tři analyzovatelné koncentrace. V případě cytotoxicity by měly tyto koncentrace pokrývat rozmezí dané maximální až minimální toxicitou, případně žádnou toxicitou, což obvykle znamená, že by se koncentrace neměly lišit více nežli faktorem 2 až Ö10. V okamžiku sklizně by měla nejvyšší koncentrace vykazovat významné snížení stupně konfluence, počtu buněk nebo mitotického indexu (vše o více než 50 %). Mitotický index je pouze nepřímým měřítkem cytotoxických nebo cytostatických účinků a závisí na době, která uplynula od expozice. Mitotický index je však přijatelný u suspenzních kultur, u nichž mohou být jiné metody stanovení toxicity obtížné a nepraktické. Informace o kinetice buněčného cyklu, například průměrná generační doba (AGT), mohou být použity jako dodatkové informace. V případě AGT však jde o celkovou průměrnou hodnotu, z níž nelze usoudit na existenci zpožděných subpopulací, a i malý přírůstek průměrné generační doby může mít za následek velmi podstatné oddálení okamžiku optimálního výtěžku aberací.

V případě relativně necytotoxických látek by měla být maximální zkušební koncentrace 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M, podle toho, která z nich je nejnižší.

V případě relativně nerozpustných látek, které nejsou toxické při koncentracích nižších, než je jejich rozpustnost, by měla být použita nejvyšší dávka v koncentraci, jež je nad mezí rozpustnosti v konečném kultivačním médiu na konci doby aplikace. V určitých případech (např. projeví-li se toxicita pouze při vyšších koncentracích, než je rozpustnost) se doporučuje vyzkoušet více koncentrací, při nichž dochází ke srážení. Může být užitečné stanovit rozpustnost na začátku a na konci expozice, neboť koncentrace v testovacím systému se může v průběhu expozice měnit v důsledku přítomnosti buněk, séra S9 atd. Nerozpustnost lze zjistit vizuálně. Sraženina by neměla vadit při vyšetřování.

1.4.2.3 Negativní a pozitivní kontroly

Součástí každého experimentu by měly být pozitivní a negativní kontroly (kontroly rozpouštědla nebo vehikula). Při použití metabolické aktivace by měla být pro pozitivní kontrolu použita chemická látka, která k mutagenní reakci vyžaduje aktivaci.

K pozitivní kontrole by měl být použit známý elastogen v expozičních koncentracích, které nejspíše poskytnou reprodukovatelný a detekovatelný nárůst nad pozadí, čímž se prokáže citlivost testovacího systému.

Koncentrace pozitivních kontrol by měly být zvoleny tak, aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo kódovaná identifikace preparátu. Příklady pozitivních a negativních kontrol:

Stav metabolické aktivace | Látka | Číslo CAS | Číslo podle EINECS |

Bez vnější metabolické aktivace | methyl-methansulfonát | 66–27–3 | 200–625–0 |

ethyl-methansulfonát | 62–50–0 | 200–536–7 |

1-ethyl-1-nitrosomočovina | 759–73–9 | 212–072–2 |

mitomycin C | 50–07–7 | 200–008–6 |

4-nitrochinolin-1-oxid | 56–57–5 | 200–281–1 |

S vnější metabolickou aktivací | benzo[a]pyren | 50–32–8 | 200–028–5 |

cyklofosfamid | 50–18–0 | 200–015–4 |

cyklofosfamid monohydrát | 6055–19–2 | |

Pro pozitivní kontrolu mohou být použity i jiné vhodné látky. Pro pozitivní kontrolu by mělo být pokud možno vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy.

V okamžiku sklizení by měly být použity negativní kontroly skládající se ze samotného rozpouštědla nebo vehikula v kultivačním médiu a zpracované stejným způsobem jako kultury. Kromě toho by měly být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud žádné kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní účinky.

1.4.3 Postup

1.4.3.1 Expozice zkoušené látce

Proliferující buňky se vystaví zkoušené látce jak za přítomnosti metabolického aktivačního systému, tak bez něho. Expozice lymfocytů by měla být zahájena asi 48 hodin po mitogenní stimulaci.

1.4.3.2 Pro každou koncentraci by měly být obvykle použity duplicitní kultury, a totéž se důrazně doporučuje u kultur pro negativní kontrolu nebo kontrolu rozpouštědla. Jestliže lze na základě dosavadních údajů prokázat (13, 14), že mezi duplicitními kulturami je minimální rozdíl, může být přípustné použití jediné kultury.

Plynné nebo těkavé látky by měly být zkoušeny vhodnými metodami, např. v těsně uzavřených kultivačních nádobách (15, 16).

1.4.3.3 Doba sklizně kultur

V prvním experimentu by měly být buňky vystaveny zkoušené látce, jak s metabolickou aktivací, tak bez ní, na dobu 3 — 6 hodin, a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (12). Jestliže tento postup dává negativní výsledky jak s aktivací, tak bez aktivace, měl by být proveden dodatečný experiment bez aktivace s nepřetržitou expozicí až do odběru v době, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu. Určité chemické látky lze snáze detekovat při dobách aplikace nebo odběru delších než 1,5násobek délky cyklu. Negativní výsledky při metabolické aktivaci musí být potvrzeny případ od případu. V případech, kdy se nepovažuje potvrzení negativních výsledků za nezbytné, by mělo být podáno zdůvodnění.

1.4.3.4 Příprava preparátů pro analýzu chromozomů

Do buněčné kultury se obvykle 1-3 hodiny před sklizením přidá Colcemid® nebo kolchicin. Pro přípravu preparátů pro analýzu chromozomů se každá buněčná kultura sklízí a zpracovává zvlášť. Příprava preparátů pro analýzu chromozomů zahrnuje hypotonizaci buněk, fixaci a obarvení buněk.

1.4.3.5 Analýza

Všechny preparáty, včetně preparátů pozitivních a negativních kontrol, by měly být před analýzou pod mikroskopem nezávisle kódovány. Poněvadž při fixaci často dochází ke zlomu části buněk v metafázi a ke ztrátě chromozomů, měly by vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu rovném modální hodnotě ± 2 pro všechny typy buněk. Na každou koncentraci a kontrolu by mělo být hodnoceno alespoň 200 dobře rozprostřených metafází, případně rovnoměrně rozdělených mezi duplicitní kultury. Tento počet lze snížit, je-li pozorován velký počet aberací.

Ačkoli je účelem zkoušky detekovat strukturní chromozomové aberace, je důležité zaznamenat polyploidii a endoreduplikace, jsou-li pozorovány.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Experimentální jednotkou je buňka a mělo by tedy být vyhodnoceno množství buněk se strukturní chromozomovou aberací (aberacemi) vyjádřené v procentech. Pro kontrolní a experimentální kultury by měly být uvedeny různé typy strukturních chromozomových aberací s jejich počtem a četností. Gapy se zaznamenávají odděleně a uvádějí se, ale nezahrnují se do celkové četnosti aberací.

Měla by být také zaznamenána opatření, která byla provedena pro stanovení cytotoxicity u všech exponovaných kultur a negativních kultur v hlavních experimentech s aberacemi.

Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé kultury. Dále by měly být všechny údaje shrnuty ve formě tabulky.

Ověření jasně pozitivní odpovědi se nepožaduje. Dvojznačné výsledky by měly být vyjasněny dalším zkoušením, nejlépe s úpravami experimentálních podmínek. Nezbytnost potvrdit negativní výsledky byla diskutována v bodu 1.4.3.3. Změna parametrů studie s cílem rozšířit rozsah posuzovaných podmínek by měla být zvážena v následných experimentech. K parametrům studie, které by mohly být změněny, patří rozmezí koncentrací a podmínky metabolické aktivace.

2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pro stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, např. nárůst počtu buněk s chromozomovými aberacemi v závislosti na koncentraci, nebo reprodukovatelný nárůst tohoto počtu. Nejdříve by měla být uvážena biologická relevance výsledků. Při hodnocení výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prostředek statistické metody (3, 13). Statistická významnost by neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní odpověď.

Nárůst počtu polyploidie buněk může znamenat, že zkoušená látka má schopnost potlačit mitotické procesy a indukovat numerické chromozomové aberace. Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozomy může znamenat, že zkoušená látka má schopnost potlačit progresi buněčného cyklu (17, 18).

Zkoušená látka, jejíž výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

Ačkoli většina experimentů poskytne jasně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech neumožní soubor údajů vyslovit konečný výrok o aktivitě zkoušené látky. Výsledky mohou zůstat dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.

Pozitivní výsledky ze zkoušky na chromozomové aberace in vitro znamenají, že zkoušená látka indukuje v kultivovaných somatických buňkách savců strukturní chromozomové aberace. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky neindukuje v kultivovaných somatických buňkách savců strukturní chromozomové aberace.

3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

- zdůvodnění volby vehikula,

- rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa.

Buňky:

- typ a zdroj buněk,

- vlastnosti karyotypu a vhodnost použitého typu buněk,

- popřípadě nepřítomnost mykoplasmat,

- informace o délce buněčného cyklu,

- pohlaví dárce krve, zda byla použita plná krev nebo separované lymfocyty, použitý mitogen,

- případně počet pasáží,

- případně metody udržování buněčné kultury,

- modální hodnota počtu chromozomů.

Zkušební podmínky:

- identifikace látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka expozice buněk,

- odůvodnění výběru koncentrací a počtu kultur, včetně např. údajů o cytotoxicitě a mezích rozpustnosti, jsou-li k dispozici,

- složení média, případně koncentrace CO2,

- koncentrace zkoušené látky,

- objem vehikula a přidané zkoušené látky,

- inkubační teplota,

- inkubační doba,

- délka expozice,

- případně hustota buněk při nasazení,

- typ a složení použitého metabolického aktivačního systému, včetně kritérií přijatelnosti,

- pozitivní a negativní kontroly,

- metody přípravy preparátů,

- kritéria hodnocení aberací,

- počet analyzovaných metafází,

- metody stanovení toxicity,

- kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou.

Výsledky:

- známky toxicity, např. stupeň konfluence, údaje o buněčném cyklu, počty buněk, mitotický index,

- známky srážení,

- údaje o pH a osmolalitě expozičního média, pokud byly stanoveny,

- definice aberací, včetně gapů,

- počet buněk s chromozomovými aberacemi a typy aberací zvlášť pro každou exponovanou a kontrolní kulturu,

- změny ploidie, pokud byly pozorovány,

- podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

- případné statistické analýzy,

- údaje o souběžné negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole,

- dosavadní údaje o negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami.

Rozbor výsledků.

Závěry.

4. LITERATURA

1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in: Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, 1-29.

2) Ishidate, M. Jr., Sofumi, T. (1985), The In vitro Chromozomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutatation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, 427-432.

3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G., Zeiger E. (1978), Chromozome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environ. Molec. Mutagen. 10 (suppl. 10), 1-175.

4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J., Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutatation Res., 257, 147-204.

5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I., Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutatation Res., 268, 297-305.

6) Ames, B. N., McCann, J., Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, 347-364.

7) Maron, D. M., Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutatation Res., 113, 173-215.

8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M., de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In vitro, I. Induction of Chromozome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutatation Res., 37, 83-90.

9) Matsuoka, A., Hayashi, M., Ishidate, M. Jr. (1979), Chromozomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In vitro, Mutation Res., 66, 277-290.

10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., Wolf, R. C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, 175-177.

11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., Sugimura, T. (1976), A. Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls a. s. an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J., Fouts, J. R. Bend, J. R., Philpot, R. M. (eds), In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, 85-88.

12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J., Morita, T., Mosesso, P., Sofumi, T. (1994), Report from Working Group on In vitro Tests for Chromozomal Aberrations, Mutatation Res., 312, 241-261.

13) Richardson, C., Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O., Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., (ed) Cambridge University Press, Cambridge, 141-154.

14) Soper, K. A., Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In vitro Chromozome Aberration Assays in CHO Cells, Mutatation Res., 312, 139-149.

15) Krahn, D. F., Barsky, F. C., McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, 91-103.

16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagen., 5, 795-801.

17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutatation Res., 119, 403-413.

18) Huang, Y., Change, C., Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, 1362-1364."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 4B

"B.11 MUTAGENITA–ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ ABERACE V BUŇKÁCH KOSTNÍ DŘENĚ SAVCŮ IN VIVO

1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 475 — Zkouška na chromozomové aberace v buňkách kostní dřeně savců (1997).

1.1 ÚVOD

Zkouška na chromozomové aberace u savců in vivo je používána pro detekci strukturních chromozomových aberací indukovaných zkoušenou látkou v buňkách kostní dřeně savců, obvykle hlodavců (1, 2, 3, 4). Rozlišují se dva typy strukturních aberací — chromozomové a chromatidové. Nárůst polyploidie může znamenat, že chemická látka má schopnost indukovat numerické aberace. V případě většiny chemických mutagenů jsou indukované aberace chromatidového typu, avšak chromozomové aberace se rovněž vyskytují. Chromozomové mutace a související jevy jsou příčinou mnoha geneticky podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho důkazů o tom, že chromozomové mutace a související jevy způsobující změny v onkogenech a v genech somatických buněk tlumících nádory, mají podíl na indukci rakoviny u člověka a v experimentálních systémech.

Při této zkoušce jsou rutinně používáni hlodavci. Cílovou tkání je v této zkoušce kostní dřeň, poněvadž je vysoce vaskularizovanou tkání a obsahuje populaci buněk s rychlým cyklem, které se snadno izolují a zpracovávají. Jiné druhy a cílové tkáně nejsou předmětem této metody.

Tato zkouška na chromozomové aberace je zvláště určená k posouzení nebezpečí mutagenese, neboť umožňuje zohlednit faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiku a procesy reparace DNA, třebaže se mohou u různých druhů a tkání měnit. Zkouška in vivo je rovněž užitečná pro další výzkum mutagenních účinků zjištěných zkouškou in vitro.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená látka nebo reaktivní metabolity nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Viz také Obecný úvod, část B.

1.2 DEFINICE

Chromatidová aberace : strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu jednotlivých chromatid nebo zlomu a opětného spojení chromatid.

Chromozomová aberace : strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž místě.

Endoreduplikace : proces, při kterém v jádře po S-fázi replikace DNA nedojde k mitóze, nýbrž následuje další S-fáze. Výsledkem jsou chromozomy se 4, 8, 16,… chromatidami.

Gap : achromatická léze menší než šířka jednoho chromatidu a s minimální odchylkou chromatid.

Numerická aberace : odchylka počtu chromozomů od normální hodnoty obvyklé u použitých buněk.

Polyploidie : násobek haploidního počtu chromozomových sad (n), jiný než diploidní (tj. 3 n, 4 n atd.).

Strukturní aberace : mikroskopicky pozorovatelné změny struktury chromozomů při buněčném dělení ve stadiu metafáze; jeví se jako delece a fragmenty, intrachromozomální nebo interchromozomální změny.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Zvířata jsou vystavena zkoušené látce vhodným způsobem a ve vhodném okamžiku po aplikaci se usmrtí. Před usmrcením se zvířatům podá látka zastavující metafázi (např. kolchicin nebo Colcemid®). Z buněk kostní dřeně se poté připraví preparáty chromozomů, obarví se a analyzují se chromozomové aberace buněk v metafázi.

1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1 Přípravky

1.4.1.1 Výběr druhu zvířete

Běžně je používán potkan, myš a křeček čínský, ačkoli lze použít jakýkoli vhodný savčí druh. Měly by být použity běžně užívané laboratorní kmeny mladých zdravých pohlavně dospělých zvířat. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by u obou pohlaví překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti.

1.4.1.2 Podmínky chovu a strava

Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50 – 60 %.

1.4.1.3 Příprava zvířat

Zdravá mladá pohlavně dospělá zvířata se náhodným výběrem rozdělí na kontrolní skupinu a skupinu, která se vystaví zkoušené látce. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv jejich polohy minimalizován. Zvířata se jednoznačně identifikují. Nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat.

1.4.1.4 Příprava dávek

Pevné zkoušené látky by měly být před aplikací zvířatům rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

1.4.2 Zkušební podmínky

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých úrovních dávek toxické účinky a mělo by být vyloučeno podezření, že reaguje se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul.

1.4.2.2 Kontroly

Součástí každého experimentu by měly být pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly pro obě pohlaví. S výjimkou aplikace zkoušené látky by měla zvířata kontrolní skupiny podstoupit identický proces jako zvířata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.

Pozitivní kontroly by měly poskytovat strukturní aberace in vivo při expozičních úrovních, u nichž se očekává, že poskytnou detekovatelný nárůst nad pozadí. Dávky pozitivní kontroly by měly být zvoleny tak, aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo kódovaná identifikace preparátu. Je přijatelné, aby byla pozitivní kontrola podávána jiným způsobem než zkoušená látka a aby byl odběr v jejím případě prováděn jen jednou. Pro pozitivní kontrolu mohou být použity chemické látky ze stejné chemické třídy, jsou-li k dispozici. Příklady látek pro pozitivní kontrolu:

Látka | Číslo CAS | Číslo podle EINECS |

ethyl-methansulfonát | 62–50–0 | 200–536–7 |

1-ethyl-1-nitrosomočovina | 759–73–9 | 212–072–2 |

mitomycin C | 50–07–7 | 200–008–6 |

cyklofosfamid | 50–18–0 | 200–015–4 |

cyklofosfamid monohydrát | 6055–19–2 | |

2,4,6-tris(aziridin-1-yl)- 1,3,5-triazin | 51–18–3 | 200–083–5 |

V okamžiku každého odběru by měl být proveden odběr u negativních kontrol, jimž je aplikováno pouze rozpouštědlo nebo vehikulum a jež jinak podstupují stejný proces jako exponované skupiny, pokud nejsou z dosavadních kontrolních údajů k dispozici přijatelné údaje o variabilitě zvířat a četnosti buněk s chromozomovými aberacemi. Provádí-li se pro negativní kontrolu jeden odběr, je nejvhodnějším okamžikem doba prvního odběru. Kromě toho by měly být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní účinky.

1.5 POSTUP

1.5.1 Počet a pohlaví zvířat

Každá exponovaná a kontrolní skupina se skládá z alespoň pěti analyzovatelných zvířat pro každé pohlaví. Jestliže jsou v době studie k dispozici údaje ze studií se stejným druhem a za použití stejného způsobu expozice, jež prokazují, že neexistuje mezi pohlavími rozdíl v toxicitě, bude postačující zkoušení jednoho pohlaví. Je-li expozice člověka specifická pro určité pohlaví, jako je tomu například u některých farmaceutických látek, měla by být zkouška provedena se zvířaty odpovídajícího pohlaví.

1.5.2 Plán expozice

Zkoušené látky by měly být pokud možno podávány jednorázově. Zkoušené látky mohou být podávány také ve dvou dávkách, tzn. dvě dávky v týž den v rozmezí ne více než několika hodin, aby bylo usnadněno podávání velkých objemů materiálu. Jiné režimy podávání by měly být vědecky zdůvodněny.

Vzorky by měly být odebrány ve dvou různých intervalech od aplikace podané v jednom dni. U hlodavců se odběr provádí po takové době od aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (jenž trvá obvykle 12 — 18 h). Poněvadž doba nezbytná pro příjem a metabolismus zkoušené látky a rovněž pro účinky na kinetiku buněčného cyklu může mít vliv na optimální okamžik pro stanovení chromozomových aberací, doporučuje se provést další odběr po 24 h od prvního odběru. Je-li aplikace rozložena do více než jednoho dne, měl by být odběr proveden po takové době od poslední aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu.

Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně podá vhodná dávka látky zastavující metafázi (např. Colcemid® nebo kolchicin). Poté se po vhodné době provede u zvířat odběr. U myši je tato doba přibližně 3 — 5 h; u křečka čínského je tato doba přibližně 4 — 5 h. Z kostní dřeně se odeberou buňky a analyzují se na chromozomové aberace.

1.5.3 Dávkování

Provádí-li se kvůli neexistenci vhodných dostupných údajů studie pro zjištění rozsahu dávek, měla by být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, jež se použijí v hlavní studii (5). V případě toxicity se pro první odběr použijí tři úrovně dávky. Tyto úrovně dávky by měly pokrývat rozpětí dané maximální a minimální toxicitou, případně žádnou toxicitou. Při pozdějším odběru stačí, když bude použita pouze nejvyšší dávka. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že vyšší dávky by vedly při stejném režimu dávkování podle očekávání k letalitě. Látky se specifickou biologickou aktivitou při nízkých netoxických dávkách (např. hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení dávky vyhovovat a měly by být hodnoceny případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka vyvolávající v kostní dřeni některé známky toxicity (např. více než 50 % snížení mitotického indexu).

1.5.4 Limitní zkouška

Jestliže zkouška s jednou dávkou alespoň 2000 mg/kg tělesné hmotnosti podanou jednorázově nebo ve dvou dávkách v jednom dni nevykazuje žádné pozorovatelné toxické účinky a není-li na základě údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, očekávána genotoxicita, nepovažuje se úplná studie se třemi úrovněmi dávky za nezbytnou. U déle trvajících studií je limitní dávkou pro 14denní aplikaci 2000 mg/kg tělesné hmotnosti/den a pro delší než 14denní aplikaci je limitní dávkou 1000 mg/kg tělesné hmotnosti/den. Očekávaná expozice člověka může znamenat potřebu použít v limitní zkoušce vyšší úroveň dávky.

1.5.5 Podávání dávek

Zkoušená látka se obvykle podává nitrožaludečně, žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou, nebo intraperitoneální injekcí. Jiné způsoby podávání jsou v odůvodněných případech přijatelné. Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán nitrožaludečně nebo injekčně, závisí na velikosti testovacího zvířete. Objem by neměl překročit 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití vyšších objemů, než je uvedený objem, musí být zdůvodněno. Až na dráždivé a žíravé látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující konstantní objem při všech úrovních dávky.

1.5.6 Příprava preparátů pro analýzu chromozomů

Ihned po usmrcení se odebere kostní dřeň, hypotonizuje se a fixuje. Buňky se nanesou na podložní sklíčka a obarví se.

1.5.7 Analýza

Jako měřítko cytotoxicity by měl být u všech exponovaných zvířat (včetně pozitivních kontrol) a u neexponovaných zvířat pro negativní kontrolu stanoven mitotický index, a to alespoň u 1000 buněk na jedno zvíře.

U každého zvířete by mělo být analyzováno alespoň 100 buněk. Tento počet lze snížit, je-li pozorován velký počet aberací. Všechny preparáty pozitivních a negativních kontrol by měly být před mikroskopickou analýzou nezávisle kódovány. Protože při fixaci často dochází ke chromozomálním zlomům nebo ke ztrátě chromozomů u části buněk v metafázi, měly by vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu odpovídajícímu číslu 2 n ± 2.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. Experimentální jednotkou je zvíře. Pro každé zvíře by měl být vyhodnocen počet buněk, počet aberací na buňku a počet buněk s chromozomovou aberací (chromozomovými aberacemi) vyjádřený v procentech. Pro exponované a kontrolní skupiny by měly být uvedeny různé typy strukturních chromozomových aberací s jejich počtem a četností. Gapy se zaznamenávají odděleně a uvádějí se, ale obecně se nezahrnují do celkové četnosti aberací. Neexistuje-li důkaz o rozdílu v odpovědi mezi pohlavími, mohou být pro statistickou analýzu údaje pro obě pohlaví zkombinovány.

2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pro stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, např. nárůst relativního počtu buněk s chromozomovými aberacemi v závislosti na dávce nebo jasný nárůst počtu buněk s aberacemi pro skupinu s určitou dávkou a k určitému okamžiku odběru. Nejdříve by měla být uvážena biologická relevance výsledků. Při hodnocení výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prostředek statistické metody (6). Statistická významnost by neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní odpověď. Dvojznačné výsledky by měly být vyjasněny dalším zkoušením, nejlépe s úpravami experimentálních podmínek.

Nárůst polyploidie může znamenat, že zkoušená látka má potenciál indukovat numerické chromozomové aberace. Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozomy může znamenat, že zkoušená látka má potenciál potlačit progresi buněčného cyklu (7, 8).

Zkoušená látka, jejíž výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se považuje v tomto systému za nemutagenní.

Ačkoli většina experimentů poskytne jasně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech neumožní soubor údajů vyslovit konečný výrok o aktivitě zkoušené látky. Výsledky mohou zůstat dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.

Pozitivní výsledky zkoušky na chromozomové aberace in vivo znamenají, že zkoušená látka indukuje v kostní dřeni testovacího druhu chromozomové aberace. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky neindukuje v kostní dřeni testovacího druhu chromozomové aberace.

Měla by být diskutována pravděpodobnost, s jakou se zkoušená látka nebo její metabolity dostanou do krevního oběhu, nebo specificky do cílové tkáně (např. systémová toxicita).

3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

- zdůvodnění volby vehikula,

- rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa.

Testovací zvířata:

- použitý druh/kmen,

- počet, stáří a pohlaví zvířat,

- zdroj, podmínky chovu, strava atd.,

- individuální hmotnost zvířat na počátku zkoušky, včetně rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnoty a směrodatné odchylky pro každou skupinu.

Zkušební podmínky:

- pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontroly,

- údaje ze studie pro zjištění rozsahu, pokud byla provedena,

- zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

- údaje o přípravě zkoušené látky,

- údaje o podávání zkoušené látky,

- zdůvodnění způsobu podávání,

- popřípadě metody ověření, zda se zkoušená látka dostala do krevního oběhu nebo do cílové tkáně,

- případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu nebo vodě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),

- podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody,

- podrobný popis rozvrhu expozice a odběru,

- metody stanovení toxicity,

- identifikace látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka aplikace,

- metody přípravy preparátů,

- kritéria hodnocení aberací,

- počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,

- kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou.

Výsledky:

- známky toxicity,

- mitotický index,

- typ a počet aberací uvedený samostatně pro každé zvíře,

- celkový počet aberací ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

- počet buněk s aberacemi ve skupině se středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

- změny ploidie, pokud byly pozorovány,

- podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

- případné statistické analýzy,

- údaje o souběžné negativní kontrole,

- dosavadní údaje o negativní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

- údaje o souběžné pozitivní kontrole.

Rozbor výsledků.

Závěry.

4. LITERATURA

1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt, J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C., 275-306.

2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F., Shelby, M. (1987), Mammalian In vivo Cytogenetic Assays: Analysis of Chromozome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutatation Res., 189, 157-165.

3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J., Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 115-141.

4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S., Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in vivo Mammalian Bone Marrow Chromozomal Aberration Test, Mutatation Res., 312, 305-312.

5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, 313-319.

6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G., Savage, J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, 184-232.

7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutatation Res., 119, 403-413.

8) Huang, Y., Change, C., Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, 1362-1364."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 4C

"B.12 MUTAGENITA–TEST SAVČÍCH ERYTROCYTÁRNÍCH MIKROJADER IN VIVO

1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 474 — Test savčích erytrocytárních mikrojader in vivo (1997).

1.1 ÚVOD

Test savčích erytrocytárních mikrojader in vivo je používán pro detekci poškození chromozomů nebo mitotického aparátu erytroblastu, které je indukováno zkoušenou látkou, a to pomocí analýzy erytrocytů odebraných z kostní dřeně a/nebo buněk periferní krve, obvykle hlodavců.

Účelem testu savčích erytrocytárních mikrojader je identifikovat látky, které způsobují cytogenetické poškození, jehož výsledkem je tvorba mikrojader obsahujících nereplikující se (lagging) chromozomové fragmenty nebo celé chromozomy.

Když se erytroblast kostní dřeně mění na polychromatický erytrocyt, hlavní jádro je vypuzeno a mikrojádra, která při tom mohou vzniknout, zůstávají v cytoplasmě, která jinak jádra neobsahuje. Zviditelnění mikrojader je v těchto buňkách usnadněno tím, že neobsahují hlavní jádro. Nárůst výskytu polychromatických erytrocytů s mikrojádry v exponovaných zvířatech je známkou indukovaného chromozomového poškození.

V tomto testu je rutinně používána kostní dřeň hlodavců, poněvadž tato tkáň produkuje polychromatické erytrocyty. Stanovení nezralých (polychromatických) erytrocytů s mikrojádry v periferní krvi je rovnocenně přijatelné u kteréhokoli druhu, u něhož byla prokázána neschopnost sleziny odstraňovat erytrocyty s mikrojádry, nebo dostatečná citlivost detekovat činitele, které způsobují strukturní nebo numerické chromozomové aberace. Mikrojádra lze rozlišit řadou kritérií. Ta zahrnují identifikaci přítomnosti nebo nepřítomnosti centromerní (kinetochorní) DNA v mikrojádře. Vyšetřuje se zejména četnost nezralých (polychromatických) erytrocytů s mikrojádry. Počet zralých (normochromatických) erytrocytů v periferní krvi, které obsahují mikrojádra, připadající na určitý počet zralých erytrocytů lze rovněž použít jako konečný výsledek zkoušky, jestliže jsou zvířata exponována čtyři týdny nebo déle.

Tento test savčích erytrocytárních mikrojader in vivo je zvláště vhodný k posouzení nebezpečí mutagenese, neboť umožňuje zohlednit faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiku a procesy reparace DNA, třebaže se mohou lišit u různých druhů a tkání, jakož i z genetického hlediska. Zkouška in vivo je rovněž užitečná pro další výzkum mutagenních účinků zjištěných v systémech in vitro.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená látka nebo reaktivní metabolity nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Viz také Obecný úvod, část B.

1.2 DEFINICE

Centromera (kinetochor) : oblast (oblasti) chromozomu, k níž (k nimž) se během dělení buněk připojí dělící vřeténko umožňující uspořádaný pohyb dceřiných chromozomů k pólům dceřiných buněk.

Mikrojádra : malá jádra existující odděleně od hlavních jader a vedle nich, vytvářená během telofáze mitosy (meiosy) nereplikujícími se (lagging) chromozomovými fragmenty nebo celými chromozomy.

Normochromatický erytrocyt : zralý erytrocyt neobsahující ribozomy, který lze rozlišit od nezralých polychromatických erytrocytů barvivem selektivním pro ribozomy.

Polychromatický erytrocyt : nezralý erytrocyt ve vývojovém mezistadiu, který ještě obsahuje ribozomy, a může být tedy rozlišen od zralých normochromatických erytrocytů barvivem selektivním pro ribozomy.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Zvířata se vhodným způsobem vystaví zkoušené látce. Při použití kostní dřeně se zvířata ve vhodném okamžiku po expozici usmrtí, odebere se kostní dřeň, připraví se preparáty a obarví se (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Při použití periferní krve se krev ve vhodném okamžiku po expozici odebere, rozetřením se připraví preparát a obarví se (4, 8, 9, 10). Při studiích s periferní krví by měla mezi poslední expozicí a sklizením buněk uplynout co nejkratší doba. Preparáty jsou analyzovány na přítomnost mikrojader.

1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1 Přípravky

1.4.1.1 Výběr druhu zvířete

Při použití kostní dřeně se jako testovací zvíře doporučuje myš nebo potkan, ačkoli lze použít jakýkoli vhodný savčí druh. Při použití periferní krve se doporučuje myš. Lze však použít jakýkoli vhodný druh savce za předpokladu, že jde o druh, u něhož slezina neodstraňuje erytrocyty s mikrojádry, nebo druh vykazující dostatečnou citlivost detekovat činitele, které způsobují strukturní nebo numerické chromozomové aberace. Měly by být použity běžně užívané laboratorní kmeny mladých zdravých pohlavně dospělých zvířat. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by u obou pohlaví překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti.

1.4.1.2 Podmínky chovu a strava

Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50 – 60 %.

1.4.1.3 Příprava zvířat

Zdravá mladá pohlavně dospělá zvířata se náhodným výběrem rozdělí na kontrolní skupinu a skupinu, u níž se provede expozice. Zvířata se jednoznačně identifikují. Nechají se v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat. Klece se uspořádají tak, aby byl vliv jejich polohy minimalizován.

1.4.1.4 Příprava dávek

Pevné zkoušené látky by měly být před aplikací zvířatům rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o jejich stálosti neprokazují možnost skladování.

1.4.2 Zkušební podmínky

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých úrovních dávek toxické účinky a mělo by být vyloučeno podezření, že reaguje se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul.

1.4.2.2 Kontroly

Součástí každého experimentu by měly být pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly pro obě pohlaví. S výjimkou aplikace zkoušené látky by měla zvířata kontrolní skupiny podstoupit identický proces jako zvířata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.

Pozitivní kontroly by měly produkovat mikrojádra in vivo při expozičních úrovních, u nichž se očekává, že poskytnou detekovatelný nárůst nad pozadí. Dávky pozitivní kontroly by měly být zvoleny tak, aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo kódovaná identifikace preparátu. Je přijatelné, aby pozitivní kontrola byla podávána jiným způsobem než zkoušená látka a aby byl odběr v tomto případě prováděn jen jednou. Pro pozitivní kontrolu navíc může být vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy, jsou-li k dispozici. Příklady látek pro pozitivní kontrolu:

Látka | Číslo CAS | Číslo podle EINECS |

ethyl-methansulfonát | 62–50–0 | 200–536–7 |

1-ethyl-1-nitrosomočovina | 759–73–9 | 212–072–2 |

mitomycin C | 50–07–7 | 200–008–6 |

cyklofosfamid | 50–18–0 | 200–015–4 |

cyklofosfamid monohydrát | 6055–19–2 | |

2,4,6-tris(aziridin-1-yl)- 1,3,5-triazin | 51–18–3 | 200–083–5 |

V okamžiku odběru by měl být proveden odběr u skupiny negativní kontroly, které je aplikováno pouze rozpouštědlo nebo vehikulum a která jinak podstupuje stejný proces jako exponované skupiny, pokud nejsou z dosavadních kontrolních údajů k dispozici přijatelné údaje o variabilitě zvířat a četnosti buněk s mikrojádry. Provádí-li se pro negativní kontrolu jeden odběr, je nejvhodnějším okamžikem doba prvního odběru. Kromě toho by měly být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud nebo nejsou-li publikovány kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní účinky.

Při použití periferní krve může být jako negativní kontrola přijatelný také vzorek krve odebraný před expozicí, pouze však u krátkých studií s periferní krví (např. 1 — 3 aplikace) za předpokladu, že výsledné údaje budou v rozpětí, které se na základě dosavadních kontrol očekává.

1.5 POSTUP

1.5.1 Počet a pohlaví zvířat

Každá exponovaná a kontrolní skupina se musí skládat z alespoň pěti analyzovatelných zvířat pro každé pohlaví (11). Jestliže jsou v době studie k dispozici údaje ze studií se stejným druhem a za použití stejného způsobu expozice, jež prokazují, že neexistuje mezi pohlavími rozdíl v toxicitě, bude postačující zkoušení jednoho pohlaví. Je-li expozice člověka specifická pro určité pohlaví, jako je tomu například u některých farmaceutických látek, měla by být zkouška provedena se zvířetem odpovídajícího pohlaví.

1.5.2 Plán aplikace

Nelze doporučit žádný standardní plán (tj. jednu, dvě nebo tři aplikace v intervalu 24 hodin). Vzorky ze studií s prodlouženým režimem podávání jsou přijatelné, pokud se u těchto studií prokáží pozitivní výsledky, nebo –v případě negativních studií — pokud byla prokázána toxicita nebo byla uplatněna limitní dávka a podávání pokračuje až do okamžiku odběru. Zkoušené látky mohou být podávány také ve dvou dávkách, tzn. dvě dávky v týž den v rozmezí ne více než několika hodin, aby bylo usnadněno podávání velkých objemů materiálu.

Test může být proveden dvěma způsoby:

a) zkoušená látka se aplikuje zvířatům jednou. Vzorky kostní dřeně se odeberou alespoň dvakrát, přičemž první odběr se provede nejdříve 24 hodin po aplikaci a poslední nejpozději 48 hodin po aplikaci a s přiměřeným odstupem mezi odběry. Odběr dříve než 24 hodin po aplikaci musí být zdůvodněn. Vzorky periferní krve se odeberou alespoň dvakrát, přičemž první odběr se provede nejdříve 36 hodin po aplikaci a poslední nejpozději 72 hodin po aplikaci a po prvnímodběru se dodrží odpovídající odstup. Je-li po prvním odběru pozorována pozitivní odpověď, není další odběr nutný;

b) jsou-li podávány dvě nebo více dávek denně (např. dvě nebo více dávek v intervalu 24 hodin), měly by být vzorky při použití kostní dřeně odebrány jednou po 18 až 24 hodinách po poslední aplikaci a při použití periferní krve jednou po 36 až 48 hodinách po poslední aplikaci (12).

Podle potřeby mohou být navíc použity jiné doby odběru.

1.5.3 Dávkování

Provádí-li se kvůli neexistenci vhodných dostupných údajů studie pro zjištění rozsahu dávek, měla by být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, jež se použijí v hlavní studii (13). V případě toxicity se pro první odběr použijí tři úrovně dávky. Tyto úrovně dávky by měly pokrývat rozpětí dané maximální až minimální toxicitou, případně žádnou toxicitou. Při pozdějším odběru stačí, když bude použita pouze nejvyšší dávka. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že vyšší dávky by vedly při stejném režimu dávkování podle očekávání k letalitě. Látky se specifickou biologickou aktivitou při nízkých netoxických dávkách (např. hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení dávky vyhovovat a měly by být hodnoceny případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka vyvolávající v kostní dřeni některé známky toxicity (např. snížení podílu nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů v kostní dřeni nebo v periferní krvi).

1.5.4 Limitní zkouška

Jestliže zkouška s jednou dávkou o alespoň 2000 mg/kg tělesné hmotnosti podanou jednorázově nebo ve dvou dávkách v jednom dni nevykazuje žádné pozorovatelné toxické účinky a není-li na základě údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, očekávána genotoxicita, není považována úplná studie se třemi úrovněmi dávky za nezbytnou. U déle trvajících studií je limitní dávkou pro 14denní aplikaci 2000 mg/kg tělesné hmotnosti/den a pro delší než 14denní aplikaci je limitní dávkou 1000 mg/kg tělesné hmotnosti/den. Očekávaná expozice člověka může znamenat potřebu použít v limitní zkoušce vyšší úroveň dávky.

1.5.5 Podávání dávek

Zkoušená látka se obvykle podává nitrožaludečně, žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou, nebo intraperitoneální injekcí. Jiné způsoby podávání jsou přijatelné v odůvodnitelných případech. Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti testovacího zvířete. Objem by neměl překročit 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití vyšších objemů, než je uvedený objem, musí být zdůvodněno. Až na dráždivé a žíravé látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující konstantní objem při všech úrovních dávky.

1.5.6 Příprava kostní dřeně nebo krve

Buňky kostní dřeně se obvykle získávají z femuru nebo tibie ihned po usmrcení. Buňky se odeberou z femuru nebo tibie a zavedenými metodami se preparují a obarví. Periferní krev se získává z ocasní žíly nebo jiné vhodné krevní cévy. Krevní buňky se ihned supravitálně obarví (8, 9, 10), nebo se připraví preparáty roztěrem a poté se obarví. Použitím barviva specifického pro DNA (např. akridinová oranž (14) nebo Hoechst 33258 a pyronin-Y (15)) se lze vyhnout některým artefaktům spojeným s použitím barviva nespecifického pro DNA. Tato výhoda nebrání použití konvenčních barviv (např. Giemsa). Přídavné systémy (např. celulosová kolona k odstranění buněk obsahujících jádra (16)) lze použít za předpokladu, že se prokázala odpovídající funkčnost těchto systémů pro preparaci mikrojader v laboratoři.

1.5.7 Analýza

Pro každé zvíře se stanoví podíl nezralých erytrocytů z celkového (nezralé + zralé) množství erytrocytů, přičemž se v případě kostní dřeně použije celkově alespoň 200 erytrocytů a v případě periferní krve alespoň 1000 erytrocytů (17). Všechny preparáty včetně preparátů pozitivních a negativních kontrol, by měly být před analýzou pod mikroskopem nezávisle kódovány. U každého zvířete se vyšetří alespoň 2000 nezralých erytrocytů na výskyt mikrojader v nezralýcherytrocytech. Další informace mohou být získány vyšetřením zralých erytrocytů na výskyt mikrojader. Při mikroskopické analýze by neměl být podíl nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů menší než 20 % kontrolní hodnoty. Jestliže jsou zvířata exponována nepřetržitě čtyři týdny nebo déle, lze také vyšetřit na výskyt mikrojader alespoň 2000 zralých erytrocytů na jedno zvíře. Systémy pro automatickou analýzu (analýza obrazu a průtoková cytometrická analýza buněčné suspenze) jsou po odpovídajícím zdůvodnění a validaci přijatelnými alternativami manuálního hodnocení.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. Experimentální jednotkou je zvíře. Pro každé analyzované zvíře by měl být uveden počet vyšetřených nezralých erytrocytů, počet nezralých erytrocytů s mikrojádry a počet nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů. Jestliže jsou zvířata exponována nepřetržitě čtyři týdny nebo déle, měly by být také uvedeny údaje o zralých erytrocytech, byly-li shromažďovány. Pro každé zvíře se uvede podíl nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů a případně množství erytrocytů s mikrojádry vyjádřené v procentech. Neexistuje-li důkaz o rozdílu v odpovědi mezi pohlavími, mohou být pro statistickou analýzu údaje pro obě pohlaví zkombinována.

2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pro stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, např. nárůst počtu buněk s mikrojádry v závislosti na dávce nebo jasný nárůst počtu buněk s mikrojádry pro skupinu s určitou dávkou a k určitému okamžiku odběru. Nejdříve by měla být uvážena biologická relevance výsledků. Při hodnocení výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prostředek statistické metody (18, 19). Statistická významnost by neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní odpověď. Dvojznačné výsledky by měly být vyjasněny dalším zkoušením, nejlépe s úpravou experimentálních podmínek.

Zkoušená látka, jejíž výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se považuje v tomto systému za nemutagenní.

Ačkoli většina experimentů poskytne jasně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech neumožní soubor údajů vyslovit konečný výrok o aktivitě zkoušené látky. Výsledky mohou zůstat dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.

Pozitivní výsledky testu na mikrojádra znamenají, že zkoušená látka indukuje mikrojádra, jež jsou důsledkem chromozomového poškození nebo poškození mitotického aparátu erytroblastu testovacího druhu. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky neprodukuje mikrojádra v nezralých erytrocytech testovacího druhu.

Měla by být diskutována pravděpodobnost, s jakou se zkoušená látka nebo její metabolity dostanou do krevního oběhu, nebo specificky do cílové tkáně (např. systémová toxicita).

3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

- zdůvodnění volby vehikula,

- rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa.

Testovací zvířata:

- použitý druh/kmen,

- počet, stáří a pohlaví zvířat,

- zdroj, podmínky chovu, strava atd.,

- individuální hmotnost zvířat na počátku zkoušky, včetně rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnota a směrodatná odchylka pro každou skupinu.

Zkušební podmínky:

- údaje k pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontrole,

- údaje ze studie pro zjištění rozsahu, pokud byla provedena,

- zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

- údaje o přípravě zkoušené látky,

- údaje o podávání zkoušené látky,

- zdůvodnění způsobu podávání,

- popřípadě metody ověření, zda se zkoušená látka dostala do krevního oběhu nebo do cílové tkáně,

- případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu nebo vodě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),

- podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody,

- podrobný popis rozvrhu expozice a odběru,

- metody přípravy preparátů,

- metody stanovení toxicity,

- kritéria hodnocení mikrojader v nezralých erytrocytech,

- počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,

- kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou.

Výsledky:

- známky toxicity,

- podíl nezralých erytrocytů z celkového množství erytrocytů,

- počet nezralých erytrocytů s mikrojádry uvedený samostatně pro každé zvíře,

- střední hodnota ± směrodatná odchylka počtu nezralých erytrocytů s mikrojádry ve skupině,

- podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

- případné statistické analýzy a metody,

- údaje o souběžné a dosavadní negativní kontrole,

- údaje o souběžné pozitivní kontrole.

Rozbor výsledků.

Závěry.

4. LITERATURA

1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In vivo Test for Chromozomal Damage, Mutatation Res., 18, 187-190.

2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutatation Res., 31, 9-15.

3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K., MacGregor, J. G., Newell, G. W. (1983), The Induction of Micronuclei a. s. a Measure of Genotoxicity, Mutatation Res. 123, 61-118.

4) Mavournin, K. H., Blakey, D. H., Cimino, M. C., Salamone, M. F., Heddle, J. A. (1990), The In vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutatation Res., 239, 29-80.

5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N., Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromozomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, in: Developments in Science and Practice of Toxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell, T. S. Miya. Elsevier, Amsterdam, 555-558.

6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., Ramel, C., Salamone, M. F., Tice, R. R., Wild, D. (1987), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutatation Res., 189, 103-112.

7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R., Shelby, M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fundam. Appl. Toxicol. 14, 513-522.

8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T., Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutatation Res., 245, 245-249.

9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutatation Res., 278, 83-98.

10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) (1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, 53-159.

11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S., Vannier, B. (1994), In vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutat. Res., 312, 293-304.

12) Higashikuni, N., Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, 313-319.

13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, 313-319.

14) Hayashi, M., Sofumi, T., Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.

15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, 269-275.

16) Romagna, F., Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutatation Res., 213, 91-104.

17) Gollapudi, B., McFadden, L. G. (1995), Sample Size for the Estimation of Polychromatic to Normochromatic Erythrocyte Ratio in the Bone Marrow Micronucleus Test, Mutatation Res., 347, 97-99.

18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetics Assay, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part 1, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 115-141.

19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G., Savage, J. R. K. (1989), Staticical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 184-232."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 4D

"B.13/14 MUTAGENITA — ZKOUŠKA NA REVERZNÍ MUTACE S BAKTERIEMI

1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 471 — Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi (1997).

1.1 ÚVOD

Při zkoušce na reverzní mutace s bakteriemi se používají bakteriální kmeny závislé na aminokyselinách Salmonella typhimurium a Escherichia coli, k detekci bodových mutací, které zahrnují substituci, adici a deleci jednoho nebo několika párů bází DNA (1, 2, 3). Podstata této zkoušky na reverzní mutace s bakteriemi spočívá v detekci mutací, které revertují mutace obsažené v testovacích kmenech a obnovují tak funkční schopnost bakterií syntetizovat esenciální aminokyseliny. Bakterie po reverzi jsou detekovány díky své schopnosti růst v nepřítomnosti aminokyselin, které jsou vyžadovány mateřským testovacím kmenem.

Bodové mutace a podobné jevy jsou příčinou mnoha geneticky podmíněných chorob u člověka a existuje mnoho důkazů o tom, že bodové mutace v onkogenech a v genech somatických buněk tlumících nádory mají podíl na tvorbě rakoviny u člověka a u pokusných zvířat. Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi je rychlá, nenákladná a relativně snadná. Mnoho testovacích kmenů má řadu vlastností, díky nimž jsou citlivější na detekci mutací, včetně responsivních sekvencí DNA na reverzních místech, zvýšené permeability buněk pro velké molekuly a eliminaci reparačních systémů DNA nebo zlepšení reparačních procesů DNA náchylných k chybám. Specifičnost testovacích kmenů může poskytnout některé užitečné informace o typech mutací, jež jsou indukovány genotoxickými činiteli. Pro zkoušky na reverzní mutací s bakteriemi je k dispozici velmi rozsáhlá databáze výsledků pro širokou škálu struktur a dále byly vyvinuty dobře vyzkoušené metody zkoušení chemických látek, včetně těkavých sloučenin, s různými fyzikálně-chemickými vlastnostmi.

Viz také obecný úvod, část B.

1.2 DEFINICE

Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi Salmonella typhimurium nebo Escherichia coli slouží k detekci mutací v kmeni vyžadujícím aminokyseliny (histidin resp. tryptofan), přičemž vzniká kmen nezávislý na vnějším přísunu aminokyseliny.

Mutageny substituce párů bází jsou činitele, jež způsobují změny v bázích DNA. Při zkoušce reverzních mutací se mohou tyto změny vyskytnout na místě původní mutace nebo jiném místě bakteriálního genomu.

Posunové mutageny jsou činitele, jež způsobují adici nebo deleci jednoho nebo více párů bází DNA a posunují tak čtecí rámec RNA.

1.3 VÝCHOZÍ ÚVAHY

Při zkouškách na reverzní mutace s bakteriemi se využívají prokaryotické buňky, které se liší od buněk savců faktory, jako jsou příjem, metabolismus, chromozomová struktura a reparační procesy DNA. Zkoušky prováděné in vitro obecně vyžadují použití vnějšího zdroje metabolické aktivace. Metabolické aktivační systémy in vitro nemohou zcela napodobit podmínky in vivo u savců. Zkouška tedy neposkytuje přímou informaci o mutagenním a karcinogenním potenciálu látky pro savce.

Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi je zpravidla využívána pro počáteční vyšetření genotoxické aktivity, a zejména aktivity vyvolávající bodové mutace. Z rozsáhlé databáze vyplývá, že mnoho chemických látek, které jsou v této zkoušce pozitivní, vykazuje mutagenní aktivitu i v jiných zkouškách. Existují příklady mutagenních činitelů, které nejsou detekovány touto zkouškou. Příčiny těchto skutečností lze spatřovat ve specifické povaze detekovanéhokonečného jevu, v rozdílech v metabolické aktivaci nebo v rozdílech v biologické dostupnosti. Na druhé straně faktory, které zvyšují citlivost zkoušky na reverzní mutace na bakteriích, mohou vést k nadhodnocení mutagenní aktivity.

Zkouška na reverzní mutace s bakteriemi nemusí být vhodná pro určité třídy chemických látek, například vysoce baktericidní sloučeniny (např. určitá antibiotika) a pro chemické látky, o nichž se předpokládá (nebo o nichž se ví), že specificky zasahují do replikačního systému buněk savců (např. některé inhibitory topoisomerasy a některé analogy nukleosidů). V takových případech mohou být vhodnější zkoušky mutagenity u savců.

Přestože mnoho sloučenin, pro něž je tato zkouška pozitivní, je karcinogenní pro savce, není korelace absolutní. Závisí na chemické třídě a existuje mnoho karcinogenů, jež nejsou detekovány touto zkouškou, neboť působí jinými, negenotoxickými mechanismy, nebo mechanismy, které v bakteriálních buňkách neexistují.

1.4 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Suspenze bakteriálních buněk jsou vystaveny zkoušené látce, a to za přítomnosti vnějšího metabolického aktivačního systému a bez něho. Ve standardním miskovém testu se suspenze smíchají s vrchním agarem a ihned se nanesou na minimální půdu. V preinkubační metodě se zkoušená směs inkubuje a poté se před nanesením na minimální půdu smíchá s vrchním agarem. Při obou technikách se po dvou nebo třech dnech inkubace spočítají kolonie revertantů a provede se srovnání s počtem kolonií spontánních revertantů na kontrolní misce s rozpouštědlem.

Je popsáno několik postupů provedení zkoušky na reverzní mutace s bakteriemi. Mezi běžně používané patří standardní miskový test (1, 2, 3, 4), preinkubační metoda (2, 3, 5, 6, 7, 8), fluktuační test (9, 10) a suspenzní metoda (11). Metody pro zkoušení plynů a par jsou popsány (12).

Zde popsané postupy se týkají hlavně standardního miskového testu a preinkubačních metod. Každá z nich je přijatelná pro provádění experimentů jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Některé látky lze účinněji detekovat za použití preinkubační metody. Tyto látky patří do chemických tříd, do nichž patří mezi jiným krátké alifatické nitrosaminy, dvojvazné kovy, aldehydy, azobarviva a diazoniové sloučeniny, pyrrolizidinové alkaloidy, allylové sloučeniny a nitrosloučeniny (3). Přitom se připouští, že určité třídy mutagenů nelze vždy detekovat standardními postupy, jako je standardní miskový test nebo preinkubační metoda. Měly by být považovány za "zvláštní případy" a k jejich detekci se důrazně doporučuje použít alternativní postupy. Je možné identifikovat tyto "zvláštní případy" (společně s příklady postupů jejich detekce): azobarviva a diazoniové sloučeniny (3, 5, 6, 13), plyny a těkavé chemické látky (12, 14, 15, 16), a glykosidy (17, 18). Odchylka od standardního postupu musí být vědecky zdůvodněna.

1.5 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.5.1 Přípravky

1.5.1.1 Bakterie

Čerstvé kultury bakterií by měly být kultivovány do pozdní exponenciální fáze nebo do časné stacionární fáze růstu (přibližně 109 buněk na ml). Buňky v pozdní stacionární fázi by neměly být použity. Je důležité, aby měly použité bakterie vysoký titr životaschopných bakterií. Titr může být prokázán buď na základě dosavadních kontrolních údajů o růstové křivce, nebo pro každou zkoušku stanovením počtu životaschopných buněk na miskách.

Doporučená inkubační teplota je 37 °C.

Mělo by být použito alespoň pět kmenů bakterií. Mezi nimi by měly být čtyři kmeny S. typhimurium (TA1535; TA1537 nebo TA97a nebo TA97; TA98 a TA100), jejichž odpověď se ukázala v různých laboratořích jako spolehlivá a reprodukovatelná. Tyto čtyři kmeny S. typhimurium mají pár bází GC na primárním reverzním místě a je známo, že jejich prostřednictvím nelze detekovat určité oxidační mutageny, činitele způsobující překřížení vláken DNA a hydraziny. Tyto látky mohou být detekovány kmeny E. coli WP2 nebo S. typhimurium TA102 (19), které mají na primárním reverzním místě pár bází AT. Doporučená kombinace kmenů je tedy tato:

- S. typhimurium TA1535 a

- S. typhimurium TA1537 nebo TA97a a

- S. typhimurium TA98 a

- S. typhimurium TA100 a

- E. coli WP2 uvrA, nebo E. coli WP2 uvrA (pKM101), nebo S. typhimurium TA102.

Pro detekci mutagenů způsobujících překřížení vláken DNA může být vhodnější zařadit TA102 nebo přidat kmen E. coli s vysokou schopností reparace DNA, (např. E. coli WP2 (pKM101)).

Měly by být použity zavedené postupy přípravy kmenové kultury, verifikace markeru a skladování. Potřeba aminokyseliny pro růst by měla být prokázána pro každou zmrazenou kmenovou kulturu (histidin pro kmeny S. typhimurium a tryptofan pro E. coli). Podobně by měly být kontrolovány jiné fenotypové charakteristiky, jmenovitě podle potřeby přítomnost nebo nepřítomnost R-faktoru plasmidů (tj. ampicilinová rezistence u kmenů TA98, TA100 a TA97a nebo TA97, WP2 uvrA a WP2 uvrA (pKM101) a ampicilinová a tetracyklinová rezistence u kmene TA102), přítomnost charakteristických mutací (tj. rfa mutací u S. typhimurium citlivostí na krystalovou violeť a uvrA mutace u E. coli nebo uvrB mutací u S. typhimurium citlivostí na ultrafialové světlo) (2, 3). Kmeny by měly rovněž dávat počty kolonií spontánních revertantů na misce v rozmezí četností očekávaných na základě dosavadních údajů laboratorních kontrol a nejlépe v rozmezí uvedeném v literatuře.

1.5.1.2 Médium

Použije se vhodný minimální agar (např. obsahující minimální půdu E (Vogel-Bonner) a glukosu) a vrchní agar obsahující histidin a biotin nebo tryptofan umožňující několik buněčných dělení (1, 2, 9).

1.5.1.3 Metabolická aktivace

Bakterie by měly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodným systémem metabolické aktivace a bez něho. Nejčastěji používaným systémem je kofaktorem doplněná postmitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců ošetřených prostředkem indukujícím enzymy, jako je Aroclor 1254 (1, 2) nebo fenobarbitonu a β-naftoflavonu (18, 20, 21). Postmitochondriální frakce je obvykle používána v koncentracích v rozmezí 5 až 30 % obj. ve směsi S9. Volba a podmínky metabolického aktivačního systému může záviset na třídě zkoušené chemické látky. V některých případech může být vhodné použít více než jednu koncentraci postmitochondriální frakce. U azobarviv a diazoniových sloučenin může být vhodnější použití redukčního metabolického aktivačního systému (6, 13).

1.5.1.4 Zkoušená látka nebo přípravek

Pevné zkoušené látky by měly být před aplikací na bakterie rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být přidány přímo k testovacím systémům a/nebo mohou být před aplikací zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

Rozpouštědlo/vehikulum by mělo být mimo podezření, že reaguje se zkoušenou látkou, a mělo by být slučitelné s přežitím bakterií a s aktivitou S9 (22). Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul. Při zkoušení látek nestálých ve vodě by měla být použita organická rozpouštědla neobsahující vodu.

1.5.2 Zkušební podmínky

1.5.2.1 Zkušební kmeny (viz 1.5.1.1)

1.5.2.2 Expoziční koncentrace

Mezi kritéria, která mají být zohledněna při stanovení nejvyššího množství zkoušené látky patří cytotoxicita a rozpustnost v konečné směsi pro aplikaci.

Může být užitečné stanovit toxicitu a nerozpustnost v předběžných experimentech. Cytotoxicita může být detekována snížením počtu kolonií revertantů, vymizením nebo zeslabením bakteriálního podkladu nebo snížením stupně přežití exponovaných kultur. Cytotoxicita látky se může změnit v přítomnosti metabolických aktivačních systémů. Nerozpustnost by měla být posouzena na základě viditelného srážení v konečné směsi za skutečných zkušebních podmínek.

Doporučená maximální zkušební koncentrace pro rozpustné necytotoxické látky je 5 mg/misku nebo 5 μl/misku. U necytotoxických látek nerozpustných při koncentracích 5 mg/misku nebo 5 μl/misku by měla být jedna nebo více zkušebních koncentrací takových, aby látky byly v konečné směsi pro aplikaci nerozpustné. Zkoušené látky, které jsou cytotoxické již při koncentracích nižších než 5 mg/misku nebo 5 μl/misku, by měly být zkoušeny až do cytotoxické koncentrace. Sraženina by neměla vadit při vyšetřování.

Mělo by být použito alespoň pět různých analyzovatelných koncentrací zkoušené látky, přičemž při prvním experimentu by měly být intervaly mezi zkušebními body rovny přibližně polovině dílku logaritmické stupnice (tj. Ö10). Menší intervaly jsou vhodné v případě, kdy se vyšetřuje křivka závislosti odpovědi na koncentraci. Zkoušení koncentrací vyšších než 5 mg/misku nebo 5 μl/misku může být zváženo při hodnocení látek obsahujících významné množství potenciálně mutagenních nečistot.

1.5.2.3 Negativní a pozitivní kontroly

Součástí každého stanovení by měly být kmenově specifické pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontroly s metabolickou aktivací a bez ní. Pro pozitivní kontrolu by měly být vybrány koncentrace dokládající účinnost každé zkoušky.

V případě zkoušek s použitím metabolického aktivačního systému by měla být látka (látky) pro pozitivní kontrolu vybrána (vybrány) na základě typu použitého kmene bakterií.

Příkladem vhodné pozitivní kontroly u zkoušky s metabolickou aktivací jsou tyto látky:

Látka | Číslo CAS | Číslo podle EINECS |

9,10-dimethylanthracen | 781–43–1 | 212–308–4 |

7,12-dimethylbenzo[a]anthracen | 57–97–6 | 200–359–5 |

benzo[a]pyren | 50–32–8 | 200–028–5 |

2-aminoanthracen | 613–13–8 | 210–330–9 |

Cyklofosfamid | 50–18–0 | 200–015–4 |

cyklofosfamid monohydrát | 6055–19–2 | |

Tato látka je vhodnou pozitivní kontrolou pro metodu redukční metabolické aktivace:

Látka | Číslo CAS | Číslo podle EINECS |

CI Direct Red 28 | 573–58–0 | 209–358–4 |

2-aminoanthracen by neměl být použit jako jediný indikátor účinnosti směsi S9. Při použití 2-aminoanthracenu by měla být každá šarže S9 charakterizována mutagenem, který vyžaduje metabolickou aktivaci mikrosomálními enzymy, například benzo[a]pyren nebo 7,12-dimethylbenzo[a]anthracen.

Příkladem kmenověspecifické pozitivní kontroly u zkoušky bez vnější metabolické aktivace jsou tyto látky:

Látka | Číslo CAS | Číslo podle EINECS | Kmen |

azid sodný | 26628–22–8 | 247–852–1 | TA1535 a TA100 |

2-nitrofluoren | 607–57–8 | 210–138–5 | TA98 |

9-aminoakridin | 90–45–9 | 201–995–6 | TA1537, TA97 a TA97a |

ICR 191 | 17070–45–0 | 241–129–4 | TA1537, TA97 a TA97a |

Kumenhydroperoxid | 80–15–9 | 201–254–7 | TA102 |

mitomycin C | 50–07–7 | 200–008–6 | WP2uvrA a TA102 |

1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin | 70–25–7 | 200–730–1 | WP2, WP2 uvrA a WP2 uvrA (pKM101) |

4-nitrochinolin-1-oxid | 56–57–5 | 200–281–1 | WP2, WP2 uvrA a WP2 uvrA (pKM101) |

α-[(5-nitro-2-furyl)methyliden]furan-2-acetamid (AF2) | 3688–53–7 | | kmeny obsahující plasmidy |

Pro pozitivní kontrolu mohou být použity jiné vhodné referenční látky. Pro pozitivní kontrolu by mělo být vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy, jsou li k dispozici.

Měly by být použity negativní kontroly skládající se ze samotného rozpouštědla nebo vehikula, bez zkoušené látky, zpracované jinak stejným způsobem jako exponované skupiny. Kromě toho by měly být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní účinky.

1.5.3 Postup

U standardní miskové metody (1, 2, 3, 4) bez metabolické aktivace se obvykle smíchá 0,05 ml nebo 0,1 ml zkušebních roztoků, 0,1 ml čerstvé bakteriální kultury (obsahující přibližně 108 životaschopných buněk) a 0,5 ml sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. V případě zkoušky s metabolickou aktivací se obvykle smíchá 0,5 ml metabolické aktivační směsi obsahující přiměřené množství postmitochondriální frakce (v rozmezí 5 až 30 % obj. v metabolické aktivační směsi) s vrchním agarem (2,0 ml) a zároveň s bakteriemi a zkoušenou látkou nebo zkušebním roztokem. Obsah každé zkumavky se promíchá a přelije přes povrch minimálního agaru na misce. Před inkubací se nechá vrchní agar ztuhnout.

U preinkubační metody (2, 3, 5, 6) se zkoušená látka nebo zkoušený roztok před smícháním s vrchním agarem a přelitím přes povrch minimálního agaru na misce obvykle 20 minut nebo déle preinkubuje s testovacím kmenem (obsahujícím přibližně 108 životaschopných buněk) a sterilním pufrem nebo metabolickým aktivačním systémem (0,5 ml) při 30 — 37 °C. Obvykle se smíchá 0,05 nebo 0,1 ml zkoušené látky nebo zkušebního roztoku, 0,1 ml bakterií a 0,5 ml směsi S9 nebo sterilního pufru s 2,0 ml vrchního agaru. Zkumavky by měly být během inkubace provzdušňovány na třepačce.

K dostatečnému odhadu odchylky by měly být při každé úrovni dávky použity 3 misky. Použití dvou misek je přijatelné po vědeckém zdůvodnění. Případná ztráta misky nemusí znamenat znehodnocení zkoušky.

Plynné nebo těkavé látky by měly být zkoušeny vhodnými metodami, např. v těsně uzavřených kultivačních nádobách (12, 14, 15, 16).

1.5.4 Inkubace

Všechny misky v dané zkoušce by měly být inkubovány při 37 °C po 48 –72 hodinách. Po uplynutí inkubační doby se zjistí počet kolonií revertantů na misku.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Předloženými údaji by měly být počty kolonií revertantů připadající na misku. Měl by být rovněž uveden počet kolonií revertantů jak na miskách s negativní kontrolou (kontrola rozpouštědla a případně neexponovaná kontrola), tak na miskách s pozitivní kontrolou. Počty na jednotlivých miskách, střední hodnoty počtu kolonií revertantů na misku a směrodatná odchylka by měly být předloženy pro zkoušenou látku a pozitivní a negativní kontrolu (neexponovanou kontrolu a/nebo kontrolu rozpouštědla).

Ověření jasně pozitivní odpovědi se nepožaduje. Dvojznačné výsledky by měly být vyjasněny dalším zkoušením, nejlépe s úpravou experimentálních podmínek. Negativní výsledky musí být potvrzeny případ od případu. Jestliže se potvrzení negativních výsledků nepovažuje za nezbytné, mělo by být podáno zdůvodnění. Změna parametrů studie s cílem rozšířit rozsah posuzovaných podmínek by měla být zvážena v následných experimentech. K parametrům studie, které by mohly být změněny, patří rozmezí koncentrací, metoda zpracování (standardní misková metoda nebo preinkubace v kapalném médiu) a podmínky metabolické aktivace.

2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pro stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, např. nárůst počtu kolonií revertantů na misku nad testovaný rozsah u alespoň jednoho kmene s metabolickým aktivačním systémem nebo bez něho, a to v závislosti na koncentraci, nebo reprodukovatelný nárůst tohoto počtu pro jednu nebo více koncentrací (23). Nejdříve by měla být uvážena biologická relevance výsledků. Při hodnocení výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prostředek statistické metody (24). Statistická významnost by neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní odpověď.

Zkoušená látka, jejíž výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se považuje v tomto systému za nemutagenní.

Ačkoli většina experimentů poskytne jasně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech neumožní soubor údajů vyslovit konečný výrok o aktivitě zkoušené látky. Výsledky mohou zůstat dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.

Pozitivní výsledky zkoušky na reverzní mutace s bakteriemi znamenají, že zkoušená látka indukuje v genomu kmenů Salmonella typhimurium a/nebo Escherichia coli bodové mutace substitucí bází nebo posunem čtecího rámce. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka není za podmínek zkoušky pro testovací druhy mutagenní.

3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

- zdůvodnění volby rozpouštědla/vehikula,

- rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa.

Kmeny:

- použité kmeny,

- počet buněk v kultuře,

- charakteristiky kmene.

Zkušební podmínky:

- množství zkoušené látky na misku (mg/misku nebo μl/misku) s odůvodněním výběru dávky a počtu misek na koncentraci,

- použitá média,

- typ a složení metabolického aktivačního systému, včetně kritérií přijatelnosti,

- postup expozice.

Výsledky:

- známky toxicity,

- známky srážení,

- počty na jednotlivých miskách,

- střední hodnota počtu kolonií revertantů na misku a směrodatná odchylka,

- podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

- případné statistické analýzy,

- údaje o souběžné negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

- dosavadní údaje o negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami.

Rozbor výsledků.

Závěry.

4. LITERATURA

1) Ames, B. N., McCann, J., Yamasaki E. (1975), Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutatation Res., 31, 347-364.

2) Maron, D. M., Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutatation Res., 113, 173-215.

3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S., Zeiger, E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays, Mutatation Res., 312, 217-233.

4) Kier, L. D., Brusick D. J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K., Ray V. (1986), The Salmonella typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutatation Res., 168, 69-240.

5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, M., Sugimura, T., Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Lett. 1, 91-96.

6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, A., Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutagenicity Microbial Tests, in: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens, ed. Norpoth K. H., Garner, R. C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York, 273-285.

7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D., Foster, R. (1980), Bacterial Mutation Assays, in: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised, ed. D. J. Kirkland, Cambridge University Press, 13-61.

8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U., Porchet, L. (1987), Liquid Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J. Food Safety., 8, 167-177.

9) Green, M. H. L., Muriel, W. J., Bridges, B. A. (1976), Use of a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens, Mutatation Res., 38, 33-42.

10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D., Bridges, J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, in: Handbook of Mutagenicity Test Procedures, 2. vyd., Kilbey, B. J., Legator, M., Nichols, W., Ramel, C. (eds.), Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 141-161.

11) Thompson, E. D., Melampy, P. J. (1981), An Examination of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagenesis, 3, 453-465.

12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F., Matsushima, T. (1994), Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Compounds by Using a Gas Sampling Bag, Mutatation Res., 307, 335-344.

13) Prival, M. J., Bell, S. J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D., Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay, Mutatation Res., 136, 33-47.

14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T., Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals, Environ. Mol. Mutagen., 19, 2-141.

15) Simmon, V., Kauhanen, K., Tardiff, R. G. (1977), Mutagenic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges, F. Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, 249-258.

16) Hughes, T. J., Simmons, D. M., Monteith, I. G., Claxton, L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay, Environmental Mutagenesis, 9, 421-441.

17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., Sugimura, T. (1979), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in Salmonella typhimurium, Cancer Res., 39, 3780-3782.

18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A., Ames, B. N. (1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to Mutagens by Intestinal Flora, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 77, 4961-4965.

19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J., Gatehouse, D. G. (1990), Comparison of Salmonella typhimurium TA 102 with Escherichia coli WP2 Tester strains, Mutagenesis, 5, 285-291.

20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls a. s. an Inducer or Metabolic Activation Systems, in: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, eds. F. J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, 85-88.

21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, 175-177.

22) Maron, D., Katzenellenbogen, J., Ames, B. N. (1981), Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome Test, Mutatation Res., 88, 343-350.

23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nestmann, E., Zeiger, E. (1987), Guide for the Salmonella typhimurium/Mammalian Microsome Tests for Bacterial Mutagenicity, Mutatation Res., 189, 83-91.

24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., Robinson, W. D., Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data from Microbial Colony Assays, in: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, ed. Kirkland, D. J., Cambridge University Press, 28-65."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 4E

"B.17 MUTAGENITA — ZKOUŠKA NA GENOVÉ MUTACE V BUŇKÁCH SAVCŮ IN VITRO

1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 476 — Zkouška na genové mutace v buňkách savců in vitro (1997).

1.1 ÚVOD

Zkoušku na genové mutace v buňkách savců in vitro lze použít pro detekci genových mutací indukovaných chemickými látkami. Mezi vhodné buněčné linie patří buňky lymfomu L5178Y myší, buněčné linie CHO, CHO-AS52 a V79 křečka čínského a lymfoblastoidní buňky TK6 člověka (1). U těchto buněčných linií jsou nejpoužívanější mírou genetických účinků mutace genů pro thymidinkinasu (TK) a hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasu (HPRT) a transgen xanthin-guaninfosforibosyltransferasy (XPRT). Zkoušky na mutace TK, HPRT a XPRT detekují různé spektrum genetických událostí. Autosomální lokace TK a XPRT může umožnit detekci genetických událostí (např. rozsáhlé delece), které nelze detekovat v HPRT lokusu na X chromozomech (2, 3, 4, 5, 6).

Ve zkoušce na genové mutace v buňkách savců in vitro lze použít kultury zavedených linií buněk nebo buněčné kmeny. Buňky se vybírají podle schopnosti růstu v kultuře a stálosti četnosti spontánních mutací.

Zkoušky prováděné in vitro obecně vyžadují použití vnějšího zdroje metabolické aktivace. Tento metabolický aktivační systém nemůže zcela napodobit podmínky in vivo u savců. Je třeba se zcela vyvarovat podmínek, které by vedly k pozitivním výsledkům, jež neodrážejí vlastní mutagenitu. K pozitivním výsledkům, jež neodrážejí vlastní mutagenitu, může dojít změnou pH, osmolality nebo vysokých úrovní cytotoxicity (7).

Tato zkouška se používá ke zjištění možných mutagenů a karcinogenů savců. Mnoho sloučenin, pro něž je tato zkouška pozitivní, jsou karcinogeny savců; mezi touto zkouškou a karcinogenitou však není absolutní korelace. Korelace závisí na chemické třídě a přibývají důkazy o tom, že existují karcinogeny, které nejsou zjištěny touto zkouškou, neboť zřejmě působí jinými, negenotoxickými mechanismy, nebo mechanismy, které v bakteriálních buňkách neexistují (6).

Viz také obecný úvod, část B.

1.2 DEFINICE

Přímá mutace : genová mutace výchozího typu mutované formy, která způsobuje změnu nebo ztrátu enzymatické aktivity kódovaných bílkovin.

Mutageny substituce párů bází : látky, které způsobují substituci jednoho nebo více párů bází v DNA.

Posunové mutageny : látky, které způsobují adici nebo deleci jednoho nebo více párů bází v molekule DNA.

Doba exprese fenotypu : doba, během níž vymizí z nově mutovaných buněk nezměněné genové produkty.

Četnost mutantů : počet pozorovaných mutantních buněk dělený počtem životaschopných buněk.

Relativní celkový růst : nárůst počtu buněk v čase ve srovnání s kontrolní populací buněk; vypočte se jako součin poměru rychlosti růstu v suspenzi a v negativní kontrole a relativní účinnosti klonování vzhledem k negativní kontrole.

Relativní růst v suspenzi : nárůst počtu buněk v průběhu exprese vzhledem k negativní kontrole.

Životaschopnost : účinnost klonování buněk v okamžiku nasazení na misku za selektivních podmínek po expresi.

Přežití : účinnost klonování buněk při nasazení na misku na konci období expozice; přežití je obvykle vyjádřeno v poměru k přežití kontrolní populace buněk.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Buňky, které v důsledku mutace TK+/-® TK— /- neobsahují thymidinkinasu (TK) jsou rezistentní k cytotoxickým účinkům analogu pyrimidinu trifluorthymidinu (TFT). Buňky produkující thymidinkinasu jsou citlivé na TFT, což způsobuje inhibici buněčného metabolismu a zastavuje další buněčné dělení. Mutantní buňky jsou tedy schopny proliferace za přítomnosti TFT, zatímco normální buňky, které obsahují thymidinkinasu tuto schopnost nemají. Podobně lze u buněk s deficientním HPRT nebo XPRT provést selekci prostřednictvím rezistence k 6-thioguaninu (TG) nebo 8-azaguaninu (AG). Vlastnosti zkoušené látky by měly být pečlivě zváženy, jestliže je ve zkoušce na genové mutace v buňkách savců zkoušen analog báze nebo sloučenina podobná selekčnímu činidlu. Mělo by být například vyšetřeno jakékoli podezření na selektivní toxicitu zkoušené látky pro mutantní nebo nemutantní buňky. Při zkoušení chemických látek, které mají podobnou strukturu jako selekční činidlo, musí tedy být potvrzena účinnost systému nebo činidla pro selekci (8).

Buňky v suspenzní nebo jednovrstevné kultuře jsou vhodnou dobu vystaveny zkoušené látce jak s metabolickou aktivací, tak bez ní, a subkultivovány za účelem stanovení cytotoxicity a za účelem exprese fenotypu před selekcí mutantů (9, 10, 11, 12, 13). Cytotoxicita se obvykle zjistí stanovením relativní účinnosti klonování (přežití) nebo stanovením relativního celkového růstu kultur po uplynutí doby expozice. Exponované kultury se udržují v růstovém médiu po vhodnou dobu charakteristickou pro každý zvolený lokus a typ buněk, aby nastala přibližně optimální fenotypová exprese indukovaných mutací. Četnost mutantů se stanoví tak, že se nasadí známý počet buněk do média obsahujícího selekční činidlo pro detekci mutantních buněk a do média bez selekčního činidla, aby byla stanovena účinnost klonování (životaschopnost). Po vhodné inkubační době se spočítají kolonie. Četnost mutantů se vypočte z počtu mutantních kolonií v selekčním médiu a počtu kolonií v médiu bez selekčního činidla.

1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1 Přípravky

1.4.1.1 Buňky

Pro použití v této zkoušce jsou k dispozici různé typy buněk, včetně subklonů buněk L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 nebo TK6. Typy buněk v této zkoušce by měly vykazovat citlivost k chemickým mutagenům, vysokou klonovací schopnost a stabilní frekvenci spontánních mutací. Buňky by měly být kontrolovány, zda nejsou kontaminovány mykoplasmaty, a v případě kontaminace by neměly být použity.

Zkoušky by měly být navrženy tak, aby měly předem stanovenou citlivost a váhu. Počet použitých buněk, kultur a koncentrací zkoušené látky by měl tyto definované parametry odrážet (14). Minimální počet buněk, které přežijí expozici a které budou použity v každém stadiu zkoušky, by měl být založen na četnosti spontánních mutací. Obecným pravidlem je, aby byl použit počet buněk, který je desetinásobkem převrácené hodnoty četnosti spontánních mutací. Je však doporučeno, aby bylo použito alespoň 106 buněk. Měly by být k dispozici dostatečné dosavadní údaje o použitém buněčném systému, aby byla doložena konzistentní výpovědní hodnota zkoušky.

1.4.1.2 Média a kultivační podmínky

Pro udržování kultur by měla být použita vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentrace CO2, teplota a vlhkost). Média by měla být zvolena podle selekčních systémů a typů buněk použitých při zkoušce. Je zvláště důležité, aby kultivační podmínky byly zvoleny tak, aby byly zajištěny optimální růst buněk během období exprese a schopnost jak mutovaných, tak nemutovaných buněk tvořit kolonie.

1.4.1.3 Příprava kultur

Buňky by měly být získávány z kmenových kultur, nasazeny do kultivačního média a inkubovány při 37 °C. Před použitím v této zkoušce může být nezbytné odstranit z kultury již přítomné mutantní buňky.

1.4.1.4 Metabolická aktivace

Buňky by měly být vystaveny zkoušené látce, a to s vhodným systémem metabolické aktivace a bez něho. Nejčastěji používaným systémem je kofaktorem dotovaná postmitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců zpracovaná činidlem indukujícím enzymy, jako je Aroclor 1254 (15, 16, 17 a 18), nebo směs fenobarbitonu a β-naftoflavonu (19, 20).

Postmitochondriální frakce je v konečném testovacím médiu obvykle používána v koncentracích 1 — 10 % obj. Volba a stav metabolického aktivačního systému může záviset na třídě chemické látky, která je zkoušena. V některých případech může být vhodné použít více než jednu koncentraci postmitochondriální frakce.

Řada výsledků vývoje, včetně přípravy geneticky modifikovaných buněčných linií exprimujících specifické aktivační enzymy, poskytuje možnosti pro endogenní aktivaci. Volba použitých buněčných linií by měla být vědecky zdůvodněna (např. důležitostí isoenzymu cytochromu P450 pro metabolismus zkoušené látky).

1.4.1.5 Příprava zkoušené látky

Pevné zkoušené látky by měly být před aplikací na buňky rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být přidány přímo k testovacím systémům a/nebo mohou být před aplikací zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

1.4.2 Zkušební podmínky

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by mělo být mimo podezření, že reaguje se zkoušenou látkou, a mělo by být slučitelné s přežitím buněk a s aktivitou S9. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul. Při zkoušení látek nestálých ve vodě by měla být použitá organická rozpouštědla neobsahující vodu. Vodu lze odstranit přidáním molekulového síta.

1.4.2.2 Expoziční koncentrace

Mezi kritéria, která mají být zohledněna při stanovení nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v testovacím systému a změny pH nebo osmolality.

Cytotoxicita by měla být stanovena s metabolickou aktivací a bez ní v hlavním experimentu za použití vhodných indikátorů buněčné integrity a růstu, jako jsou relativní účinnost klonování (přežití) nebo relativní celkový růst. Může být výhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžném experimentu.

Měly by být použity alespoň čtyři analyzovatelné koncentrace. V případě toxicity by měly tyto koncentrace pokrývat rozmezí dané maximální a minimální toxicitou, případně žádnou toxicitou, což bude obvykle znamenat, že by se koncentrace měly lišit faktorem 2 až Ö10. Je-li maximální koncentrace odvozena od cytotoxicity, mělo by být výsledkem přibližně 10 — 20 % (ale nejméně 10 %) přežití (relativní účinnost klonování) nebo relativní celkový růst. V případě relativně necytotoxických látek by měla být maximální zkušební koncentrace 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M, podle toho, která z nich je nejnižší.

Relativně nerozpustné látky by měly být zkoušeny až k mezi rozpustnosti za kultivačních podmínek, nebo až za tuto mez. Měla by být stanovena případná nerozpustnost v konečném médiu, ve kterému jsou buňky exponovány. Může být výhodné stanovit rozpustnost na začátku a na konci aplikace, neboť rozpustnost se může v průběhu expozice v testovacím systému měnit v důsledku přítomnosti buněk, S9 séra, atd. Nerozpustnost lze zjistit vizuálně. Sraženina by neměla vadit při vyšetřování.

1.4.2.3 Kontroly

Součástí každého experimentu by měly být pozitivní a negativní (rozpouštědlo nebo vehikulum) kontroly jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Při použití metabolické aktivace by měla být pozitivní kontrolou chemická látka, která k mutagenní odpovědi vyžaduje aktivaci.

Příkladem pozitivní kontroly mohou být tyto látky:

Stav metabolické aktivace | Lokus | Látka | Číslo CAS | Číslo podle Einecs |

Bez vnější metabolické aktivace | HPRT | ethyl-methansulfonát | 62–50–0 | 200–536–7 |

1-ethyl-1-nitrosomočovina | 759–73–9 | 212–072–2 |

TK (malé a velké kolonie) | methyl-methansulfonát | 66–27–3 | 200–625–0 |

XPRT | ethyl-methansulfonát | 62–50–0 | 200–536–7 |

1-ethyl-1-nitrosomočovina | 759–73–9 | 212–072–2 |

S vnější metabolickou aktivací | HPRT | 3-methylcholanthren | 56–49–5 | 200–276–4 |

N-nitrosodimethylamin | 62–75–9 | 200–549–8 |

7,12-dimethylbenzoanthracen | 57–97–6 | 200–359–5 |

TK (malé a velké kolonie) | cyklofosfamid | 50–18–0 | 200–015–4 |

cyklofosfamid monohydrát | 6055–19–2 | |

benzo[a]pyren | 50–32–8 | 200–028–5 |

3-methylcholanthren | 56–49–5 | 200–276–5 |

XPRT | N-nitrosodimethylamin (pro vysoké úrovně S9) | 62–75–9 | 200–549–8 |

benzo[a]pyren | 50–32–8 | 200–028–5 |

Mohou být použity také jiné referenční látky pro pozitivní kontrolu, např. má-li laboratoř databázi dosavadních údajů o 5-brom-2′-deoxyuridinu (CAS 59–14–3, EINECS 200–415–9), může být tato referenční látka rovněž použita. Pro pozitivní kontrolu by mělo být vzato v úvahu použití chemických látek pokud možno ze stejné chemické třídy.

Měly by být použity negativní kontroly tvořené médiem obsahujícím samotné rozpouštědlo nebo vehikulum a zpracované jinak stejným způsobem jako exponované skupiny. Kromě toho by měly být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní účinky.

1.4.3 Postup

1.4.3.1 Expozice zkoušené látce

Proliferující buňky by měly být vystaveny zkoušené látce jak za přítomnosti metabolického aktivačního systému, tak bez něho. Expozice by měla trvat vhodnou dobu (obvykle je účinná doba 3 až 6 hodin). Expoziční doba může být prodloužena na jeden nebo více buněčných cyklů.

Pro každou zkušební koncentraci mohou být použity duplicitní kultury nebo jedna exponovaná kultura. Je-li použita jedna kultura, měl by být počet koncentrací zvýšen tak, aby byl zajištěn odpovídající počet kultur pro analýzu (např. alespoň osm analyzovatelných koncentrací). Měly by být použity duplicitní negativní kontrolní kultury (kontrola rozpouštědla).

Plynné nebo těkavé látky by měly být zkoušeny vhodnými metodami, např. v těsně uzavřených kultivačních nádobách (21, 22).

1.4.3.2 Stanovení přežití, životaschopnosti a četnosti mutací

Na konci expoziční doby se buňky promyjí a kultivují za účelem stanovení přežití a za účelem umožnění exprese fenotypu mutantu. Se stanovením cytotoxicity prostřednictvím stanovení relativní účinnosti klonování (přežití) nebo relativního celkového růstu kultur se započne obvykle po expoziční době.

Každý lokus má definované minimální časové nároky, aby umožnil přibližně optimální fenotypovou expresi nově indukovaných mutantů (HPRT a XPRT vyžadují alespoň 6 až 8 dnů, TK alespoň dva dny). Buňky jsou kultivovány v médiu se selekčním činidlem (selekčními činidly) a bez něho (bez nich) za účelem stanovení počtu mutantů a klonovací účinnosti. Se stanovením životaschopnosti (použité pro výpočet četnosti mutantů) se započne na konci doby exprese nasazením na misku bez selekčního činidla.

Je-li zkoušená látka pozitivní ve zkoušce L5178Y TK+/-, mělo by být provedeno alespoň na jedné ze zkušebních kultur (s nejvyšší pozitivní koncentrací) a na negativních a pozitivních kontrolách rozdělení kultury podle velikosti kolonií. Je-li zkoušená látka ve zkoušce L5178Y TK+/- negativní, mělo by být rozdělení kultury podle velikosti kolonií provedeno na negativních a pozitivních kontrolách. Při studiích za použití TK6 TK+/- může být také provedeno rozdělení kultury podle velikosti kolonií.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Údaje by měly zahrnovat stanovení cytotoxicity a životaschopnosti, počtu kolonií a četnosti mutantů pro exponované a kontrolní kultury. V případě pozitivní odpovědi na zkoušku L5178Y TK+/- se kolonie vyšetřují alespoň u jedné koncentrace zkoušené látky (nejvyšší pozitivní koncentrace) a u negativní a pozitivní kontroly za použití kriteria malá kolonie — velká kolonie. Molekulární a cytogenetická povaha jak mutantů tvořících velké kolonie, tak mutantů tvořících malé kolonie byla podrobně zkoumána (23, 24). Ve zkoušce TK+/- jsou kolonie vyšetřovány za použití kriteria kolonie s normálním růstem (velká) a kolonie s pomalým růstem (malá) (25). U mutantních buněk, které utrpěly nejrozsáhlejší genetické poškození, se prodloužily doby zdvojení, a tvoří tedy malé kolonie. Poškození má obvykle rozsah od ztrát celého genu až po karyotypické viditelné chromozomové aberace. Indukce mutantů tvořících malé kolonie se spojuje s chemickými látkami, které indukují silné chromozomové aberace (26). Méně závažně postižené buňky mutantů rostou podobným tempem jako mateřské buňky a tvoří velké kolonie.

Mělo by být udáno přežití (relativní účinnost klonování) nebo relativní celkový růst. Četnost mutantů by měla být vyjádřena jako počet mutantů k počtu přeživších buněk.

Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé kultury. Dále by měly být všechny údaje shrnuty ve formě tabulky.

Ověření jasně pozitivní odpovědi se nepožaduje. Dvojznačné výsledky by měly být vyjasněny dalším zkoušením, nejlépe s úpravou experimentálních podmínek. Negativní výsledky musí být potvrzeny případ od případu. Tam, kde není potvrzení negativních výsledků považováno za nutné, je třeba uvést zdůvodnění. Změna parametrů studie s cílem rozšířit rozsah posuzovaných podmínek by měla být zvážena v následných experimentech jak pro dvojznačné výsledky, tak pro negativní výsledky. K parametrům studie, které by mohly být změněny, patří rozmezí koncentrací a podmínky metabolické aktivace.

2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pro stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, např. nárůst četností mutantů v závislosti na koncentraci, nebo reprodukovatelný nárůst této četnosti. Nejdříve by měla být uvážena biologická relevance výsledků. Při hodnocení výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prostředek statistické metody. Statistická významnost by neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní odpověď.

Zkoušená látka, jejíž výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

Ačkoli většina experimentů poskytne jasně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech neumožní soubor údajů vyslovit konečný výrok o aktivitě zkoušené látky. Výsledky mohou zůstat dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.

Pozitivní výsledky zkoušky na genové mutace v buňkách savců in vitro znamenají, že zkoušená látka indukuje v použitých kultivovaných buňkách savců genové mutace. Reprodukovatelná pozitivní závislost odpovědi na koncentraci je velmi významná. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky neindukuje v použitých kultivovaných buňkách savců genové mutace.

3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

- zdůvodnění volby rozpouštědla/vehikula,

- rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa.

Buňky:

- typ a zdroj buněk,

- počet buněčných kultur,

- případně počet pasáží,

- případně metody udržování buněčné kultury,

- nepřítomnost mykoplasmat.

Zkušební podmínky:

- odůvodnění výběru koncentrací a počtu kultur, včetně např. údajů o cytotoxicitě a mezích rozpustnosti, jsou-li k dispozici,

- složení média, případně koncentrace CO2,

- koncentrace zkoušené látky,

- objem vehikula a přidané zkoušené látky,

- inkubační teplota,

- inkubační doba,

- délka expozice,

- případně hustota buněk během expozice,

- typ a složení použitého metabolického aktivačního systému, včetně kritérií přijatelnosti,

- pozitivní a negativní kontroly,

- délka doby exprese (případně včetně počtu nasazených buněk, subkultur a výměny média),

- selekční činidla,

- kritéria klasifikace zkoušky na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou,

- metody použité k počítání životaschopných a mutantních buněk,

- definice kolonií podle velikosti a typu (případně včetně kriterií pro "malé" a "velké" kolonie).

Výsledky:

- známky toxicity,

- známky srážení,

- údaje o pH a osmolalitě během expozice zkoušené látce, pokud byly stanoveny,

- velikost kolonií, byla-li vyšetřována, alespoň pro negativní a pozitivní kontroly,

- popřípadě předpoklady laboratoře detekovat mutanty tvořící malé kolonie systémem L5178Y TK+/-,

- podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

- případné statistické analýzy,

- údaje o souběžné negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole,

- dosavadní údaje o negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole s rozmezími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

- četnost mutantů.

Rozbor výsledků.

Závěry.

4. LITERATURA

1) Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J., Tindal, K. R. (eds.) (1987), Banbury Report 28; Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

2) Chu, E. H. Y., Malling H. V. (1968), Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 61, 1306-1312.

3) Liber, H. L., Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts, Mutation Res. 94, 467-485.

4) Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L., Dearfield, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci, Mutagenesis, 4, 394-403.

5) Aaron, C. S., Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutatation Res. 223, 121-128.

6) Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J., Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. 312, 235-239.

7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., Brusick, D., Ashby, J., Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res. 257, 147-204.

8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C., Mavournin, K. H. (1983), Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutatation Res., 115, 225-251.

9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H., Wasson, J. S. (1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections Agency Gene-Tox Program, Mutatation Res., 196, 17-36.

10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N., Hsie, A. W., Gupta, R. S., Loveday, K. S., O'Νeill, J. P., Riddle, J. C., Stankowski, L. F. Jr., Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay, Mutatation Res., 189, 135-141.

11) Liber, H. L., Yandell, D. W., Little, J. B. (1989), A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus, Mutatation Res., 216, 9-17.

12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal, K. R., Hsie, A. W. (1986), Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulphonate and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulphonate and ICR 191 Induced Mutation in AS52 Cells, Mutatation Res., 160, 133-147.

13) Turner, N. T., Batson, A. G., Clive, D. (1984), Procedure for the L5178Y/TK+/--TK+/- Mouse Lymphoma Cell Mutagenicity Assay, in: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, 239-268.

14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., Cole, J., McGregor, D. B., Asquith S. C. (1989), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, in: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D. J., ed., Cambridge University Press, 66-101.

15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, N., Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine, Mutatation Res. 46, 365-373.

16) Ames, B. N., McCann, J., Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test, Mutatation Res. 31, 347-364.

17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G., Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of the L5178Y/TK+/--Mouse Lymphoma Mutagen Assay System, Mutat. Res. 59, 61-108.

18) Maron, D. M., Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutatation Res. 113, 173-215.

19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M., Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in: In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis 7, 175-177.

20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K., Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls a. s. an Inducer of Metabolic Activation Systems, V: In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F. J., Fouts, J. R., Bend, J. R., Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North-Holland, 85-88.

21) Krahn, D. F., Barsky, F. C., McCooey, K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, 91-103.

22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P., Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environ. Mutagenesis, 5, 795-801.

23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A., Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 87, 51-55.

24) Moore, M. M., Clive, D., Hozier, J. C., Howard, B. E., Batson, A. G., Turner, N. T., Sawyer, J. (1985), Analysis of Trifluorothymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK+/--Mouse Lymphoma Cells, Mutatation Res. 151, 161-174.

25) Yandell, D. W., Dryja, T. P., Little, J. B. (1990), Molecular Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells, Mutatation Res. 229, 89-102.

26) Moore, M. M., Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chromozome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK+/- 3.7.2C Mouse Lymphoma Cells, Mutagenesis, 5, 609-614."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 4F

"B.23 ZKOUŠKA NA CHROMOZOMOVÉ ABERACE VE SPERMATOGONIÍCH SAVCŮ

1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 483 — Zkouška na chromozomové aberace ve spermatogoniích savců (1997).

1.1 ÚVOD

Účelem zkoušky na chromozomové aberace ve spermatogoniích savců in vivo je identifikovat takové látky, které způsobují strukturní chromozomové aberace ve spermatogoniích savců (1, 2, 3, 4, 5). Rozlišují se dva typy strukturních aberací: chromozomové a chromatidové. U většiny chemických mutagenů jsou indukované aberace chromatidového typu, avšak chromozomové aberace se rovněž vyskytují. Tato metoda není určena ke stanovení numerických aberací a není k tomuto účelu rutinně používána. Chromozomové mutace a podobné jevy jsou příčinou mnoha geneticky podmíněných chorob u člověka.

Touto zkouškou se stanovují chromozomové změny ve spermatogoniích a předpokládá se tedy, že tato zkouška poskytne předpověď indukce dědičných mutací v germinálních buňkách.

V této zkoušce jsou rutinně používáni hlodavci. Touto cytogenetickou zkouškou in vivo se detekují chromozomové aberace při mitose spermatogonií. Jiné cílové buňky nejsou předmětem této zkoušky.

Pro detekci aberací chromatidového typu ve spermatogoniích by mělo být — dříve než dojde ke ztrátě léze — vyšetřeno první mitotické buněčné dělení, které následuje po aplikaci. Další informace z exponovaných spermatogoniálních kmenových buněk lze získat meiotickou chromozomovou analýzou aberací chromozomového typu v diakinese-metafázi I, kdy se exponované buňky stávají spermatocyty.

Tato zkouška in vivo je navržena pro vyšetření, zda jsou mutageny somatických buněk aktivní také v germinálních buňkách. Navíc je tato zkouška se spermatogoniemi významná pro posouzení nebezpečí mutagenese, neboť umožňuje zohlednit faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiku a procesy reparace DNA.

Ve varlatech je přítomna řada generací spermatogonií s různou citlivostí na expozici chemické látce. Detekované aberace tedy představují souhrnnou odpověď exponované populace spermatogonií s převládajícími diferencovanými spermatogoniemi. V závislosti na své poloze ve varlatech, mohou nebo nemusí být různé generace spermatogonií exponovány celkovému krevnímu oběhu v důsledku fyzikální a fyziologické bariéry Sertoliho buněk a bariéry mezi krevním oběhem a varlaty.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená látka nebo reaktivní metabolity nedostanou do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Viz také obecný úvod, část B.

1.2 DEFINICE

Chromatidová aberace : strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu jednotlivých chromatid nebo zlomu a opětného spojení chromatid.

Chromozomová aberace : strukturní poškození chromozomu v podobě zlomu nebo zlomu a spojení obou chromatid v tomtéž místě.

Gap : achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimální odchylkou chromatid.

Numerická aberace : odchylka počtu chromozomů od normální hodnoty u použitých buněk.

Polyploidie : násobek haploidního počtu chromozomových sad (n), jiný než diploidní (tj. 3 n, 4 n atd.).

Strukturní aberace : mikroskopicky pozorovatelné změny struktury chromozomů při buněčném dělení ve stadiu metafáze pod mikroskopem, jeví se jako delece a fragmenty, intrachromozomální nebo interchromozomální změny.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Zvířata jsou vhodným způsobem exponována zkoušené látce a po vhodné době po expozici usmrcena. Před usmrcením se zvířatům podá látka zastavující metafázi (např. kolchicin nebo Colcemid®). Z germinálních buněk se poté připraví preparáty chromozomů, obarví se a analyzují se chromozomové aberace metafázujících buněk.

1.4 POPIS ZKUŠEBNÍ METODY

1.4.1 Přípravky

1.4.1.1 Výběr druhu zvířete

Běžně jsou používáni samci křečka čínského a myši; lze však použít samce jakéhokoli jiného vhodného druhu savce. Měly by být použity běžně užívané laboratorní kmeny mladých zdravých pohlavně dospělých zvířat. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti.

1.4.1.2 Podmínky chovu a strava

Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50 – 60 %.

1.4.1.3 Příprava zvířat

Zdraví mladí pohlavně dospělí samci se náhodným výběrem rozdělí na kontrolní skupinu a skupinu, která se exponuje. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv jejich polohy minimalizován. Zvířata se jednoznačně identifikují. Před započetím studie se nechají v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat.

1.4.1.4 Příprava dávek

Pevné zkoušené látky by měly být před aplikací zvířatům rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

1.4.2 Zkušební podmínky

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých hladinách dávek toxické účinky a mělo by být vyloučeno podezření, že reaguje se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se pokud možno nejdříve zvážit použití vodných rozpouštědel/vehikul.

1.4.2.2 Kontroly

Součástí každého experimentu by měly být souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. S výjimkou aplikace zkoušené látky by měla zvířata kontrolní skupiny podstoupit identický proces jako zvířata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.

Pozitivní kontroly by měly poskytovat strukturní aberace ve spermatogoniích in vivo při expozičních úrovních, u nichž se předpokládá, že poskytnou detekovatelný nárůst nad pozadí.

Dávky pozitivní kontroly by měly být zvoleny tak, aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo kódovaná identifikace preparátu. Je přijatelné, aby byla pozitivní kontrola podávána jiným způsobem než zkoušená látka a aby byl odběr v jejím případě prováděn jen jednou. Pro pozitivní kontrolu může být navíc vzato v úvahu použití chemických látek ze stejné chemické třídy, jsou-li k dispozici. Příklady látek pro pozitivní kontrolu:

Látka | Číslo CAS | Číslo podle Einecs |

cyklofosfamid | 50–18–0 | 200–015–4 |

cyklofosfamid monohydrát | 6055–19–2 | |

cyklohexylamin | 108–91–8 | 203–629–0 |

mitomycin C | 50–07–7 | 200–008–6 |

akrylamid (monomer) | 79–06–1 | 201–173–7 |

2,4,6-tris(aziridin-1-yl)-1,3,5-triazin | 51–18–3 | 200–083–5 |

V okamžiku každého odběru by měl být proveden odběr u skupiny negativní kontroly, které je aplikováno pouze rozpouštědlo nebo vehikulum a která jinak podstupuje stejný proces jako exponované skupiny, pokud nejsou z dosavadních kontrolních údajů k dispozici přijatelné údaje o variabilitě zvířat a četnosti buněk s chromozomovými aberacemi. Kromě toho by měly být neexponované kontroly použity také tehdy, neexistují-li dosud kontrolní údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevyvolává žádné zhoubné nebo mutagenní účinky.

1.5 POSTUP

1.5.1 Počet zvířat

Každá exponovaná i kontrolní skupina musí zahrnovat alespoň pět analyzovatelných samců.

1.5.2 Plán expozice

Zkoušené látky by měly být pokud možno podávány jednorázově nebo nadvakrát (tj. při jedné expozici nebo dvou expozicích). Zkoušené látky mohou být podávány také ve dvou dávkách, tzn. dvě dávky v týž den v rozmezí ne více než několika hodin, aby bylo usnadněno podávání velkých objemů materiálu. Jiné režimy podávání by měly být vědecky zdůvodněny.

Ve skupině s nejvyšší dávkou by měly být po expozici provedeny dva odběry. Poněvadž kinetika buněčného cyklu může být zkoušenou látkou ovlivněna, provede se jeden časný odběr a jeden pozdější odběr přibližně 24 a 48 hodin po expozici. V případě jiné než nejvyšší dávky by měl být odběr proveden po 24 hodin nebo po takové době expozice, která odpovídá 1,5násobku délky buněčného cyklu, pokud není známa jiná vhodnější doba pro detekci účinku (6).

Navíc mohou být odběry provedeny také v jiné době. Například v případě chemických látek, které mohou indukovat opoždění replikace (lagging) chromozomů nebo mohou způsobovat S-nezávislé účinky, může být vhodnější časnější odběr (1).

Vhodnost plánu opakované expozice musí být určena případ od případu. V případě plánu s opakovanou expozicí by měla být zvířata usmrcena 24 hodin (1,5násobek délky cyklu) po poslední expozici. Podle potřeby mohou být prováděny další odběry v jiné době.

Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně podá vhodná dávka látky zastavující metafázi (např. Colcemid® nebo kolchicin). Poté se po vhodné době provede u zvířat odběr. U myši je tato doba přibližně 3 — 5 hodin; u křečka čínského je tato doba přibližně 4 — 5 hodin.

1.5.3 Dávkování

Provádí-li se kvůli neexistenci vhodných dostupných údajů studie pro zjištění rozsahu, měla by být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem a kmenem a za stejného režimu expozice, který se použije v hlavní studii (7). V případě toxicity se pro první odběr použijí tři úrovně dávky. Tyto úrovně dávky by měly pokrývat rozmezí dané maximální a minimální toxicitou, případně žádnou toxicitou. Při pozdějším odběru stačí, když bude použita pouze nejvyšší dávka. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že by vyšší dávky vedly při stejném režimu dávkování podle očekávání k letalitě.

Látky se specifickou biologickou aktivitou při nízkých netoxických dávkách (např. hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení dávky vyhovovat a měly by být hodnoceny případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka vyvolávající ve spermatogoniích některé známky toxicity (např. snížení počtu spermatogonií v mitose vzhledem k první a druhé meiotické metafázi; toto snížení by nemělo překročit 50 %).

1.5.4 Limitní zkouška

Jestliže zkouška s jednou dávkou alespoň 2000 mg/kg tělesné hmotnosti podanou jednorázově nebo ve dvou dávkách v jednom dni nevykazuje žádné pozorovatelné toxické účinky a není-li na základě údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, očekávána genotoxicita, nepovažuje se úplná studie se třemi úrovněmi dávky za nezbytnou. Očekávaná expozice člověka může znamenat potřebu použít v limitní zkoušce vyšší úroveň dávky.

1.5.5 Podávání dávek

Zkoušená látka se obvykle podává nitrožaludečně, žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou, nebo intraperitoneální injekcí. Jiné způsoby podávání jsou přijatelné, jsou-li zdůvodnitelné. Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti testovacího zvířete. Objem by neměl překročit 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití vyšších objemů, než je uvedený objem, musí být zdůvodněno. Až na dráždivé a žíravé látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkoušeného objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující konstantní objem při všech úrovních dávky.

1.5.6 Příprava preparátů na analýzu chromozomů

Ihned po usmrcení se z jednoho nebo obou varlat získá buněčná suspenze, hypotonizuje se a fixuje. Poté se nanese na podložní sklíčka a obarví se.

1.5.7 Analýza

U každého zvířete by mělo být analyzováno alespoň 100 buněk v dobře rozprostřené metafázi (tj. minimálně 500 metafází na skupinu). Tento počet lze snížit, je-li pozorován velký počet aberací. Všechny preparáty včetně preparátů pozitivních a negativních kontrol, by měly být před mikroskopickou analýzou nezávisle kódovány. Poněvadž při fixaci často dochází ke chromozomálním zlomům nebo ztrátě chromozomů u části metafází, měly by vyšetřované buňky obsahovat centromery v počtu odpovídajícímu číslu 2 n ± 2.

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Údaje pro jednotlivá zvířata by měly být zpracovány ve formě tabulky. Experimentální jednotkou je zvíře. Pro každé zvíře by měl být vyhodnocen počet buněk se strukturními chromozomovými aberacemi a počet chromozomových aberací na buňku. Pro exponované a kontrolní skupiny by měly být uvedeny různé typy strukturních chromozomových aberací s jejich počtem a četností. Gapy se zaznamenávají odděleně a uvádějí se, ale obecně se nezahrnují do celkové četnosti aberací.

Je-li pozorována mitosa a také meiosa, měl by být pro stanovení možných cytotoxických účinků jako míra cytotoxicity stanoven u všech exponovaných zvířat a zvířat sloužících jako negativní kontrola poměr spermatogonií v mitose vzhledem k první a druhé meiotické metafázi, a to v celkovém vzorku 100 dělících se buněk na jedno zvíře. Pokud je sledována pouze mitosa, nejméně v 1000 buňkách na zvíře by měl být stanoven mitotický index.

2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Pro stanovení pozitivního výsledku existuje několik kritérií, např. nárůst počtu buněk s chromozomovými aberacemi v závislosti na dávce nebo jasný nárůst počtu buněk s aberacemi pro skupinu s určitou dávkou a k určitému okamžiku odběru. Nejdříve by měla být uvážena biologická relevance výsledků. Při hodnocení výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prostředek statistické metody (8). Statistická významnost by neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní odpověď. Dvojznačné výsledky by měly být vyjasněny dalším zkoušením, nejlépe s úpravami experimentálních podmínek.

Zkoušená látka, jejíž výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

Ačkoli většina experimentů poskytne jasně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech neumožní soubor údajů vyslovit konečný výrok o aktivitě zkoušené látky. Výsledky mohou zůstat dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.

Pozitivní výsledky zkoušky na chromozomové aberace ve spermatogoniích savců in vivo znamenají, že zkoušená látka indukuje v germinálních buňkách testovacího druhu strukturní chromozomové aberace. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky neindukuje v germinálních buňkách testovacího druhu chromozomové aberace.

Měla by být diskutována pravděpodobnost, s jakou se zkoušená látka nebo její metabolity dostanou do cílové tkáně.

3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

- zdůvodnění volby vehikula,

- rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa.

Testovací zvířata:

- použitý druh/kmen,

- počet a stáří zvířat,

- zdroj, podmínky chovu, strava atd.,

- individuální hmotnost zvířat na počátku zkoušky, včetně rozmezí tělesné hmotnosti, střední hodnoty a směrodatné odchylky pro každou skupinu.

Zkušební podmínky:

- údaje ze studie pro zjištění rozsahu, pokud byla provedena,

- zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

- zdůvodnění způsobu podávání,

- údaje o přípravě zkoušené látky,

- údaje o podávání zkoušené látky,

- zdůvodnění dob usmrcení,

- případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu nebo vodě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),

- podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody,

- podrobný popis rozvrhu expozice a odběru,

- metody stanovení toxicity,

- identifikace látky zastavující metafázi, její koncentrace a délka aplikace,

- metody přípravy preparátů,

- kritéria hodnocení aberací,

- počet analyzovaných buněk na jedno zvíře,

- kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou.

Výsledky:

- známky toxicity,

- mitotický index,

- poměr spermatogonií v mitose vzhledem k první a druhé metafázi meiosy,

- typ a počet aberací uvedený samostatně pro každé zvíře,

- celkový počet aberací ve skupině,

- počet buněk s aberacemi ve skupině,

- podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

- případné statistické analýzy,

- údaje o souběžné negativní kontrole,

- dosavadní údaje o negativní kontrole s rozpětími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

- údaje o souběžné pozitivní kontrole,

- změny ploidie, pokud byly pozorovány.

Rozbor výsledků.

Závěry.

4. LITERATURA

1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, in: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C., Lambert, B., Magnusson, J. (eds) Liss, New York, 477-484.

2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, in: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt, J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, 275-306.

3) Evans, E. P., Breckon, G., Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics Cell Genetics, 3, 289-294.

4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G., Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 115-141.

5) Yamamoto, K., Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromozomes, Mutatation Res., 52, 207-209.

6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T., Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutatation Res., 312, 313-318.

7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J., Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, 313-319.

8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G., Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 184-232."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 4G

"B.39 ZKOUŠKA NA NEPLÁNOVANOU SYNTÉZU DNA (UDS) V JATERNÍCH BUŇKÁCH SAVCŮ IN VIVO

1. METODA

Tato metoda je replikou metody OECD TG 486 — Zkouška na neplánovanou syntézu DNA (UDS) v jaterních buňkách savců in vivo (1997).

1.1 ÚVOD

Účelem zkoušky na neplánovanou syntézu DNA (UDS) v jaterních buňkách savců in vivo je identifikovat zkoušené látky, které indukují reparace DNA v jaterních buňkách exponovaných zvířat (1, 2, 3, 4).

Tato zkouška in vivo poskytuje metodu vyšetření genotoxických účinků chemických látek v játrech. Stanovovaný jev je ukazatelem poškození DNA a následné reparace v jaterních buňkách. Játra jsou obvykle hlavním místem, kde jsou absorbované sloučeniny metabolizovány. Jsou tedy vhodným místem pro hodnocení míry poškození DNA in vivo.

Jestliže existuje důkaz o tom, že se zkoušená látka nedostane do cílové tkáně, není vhodné tuto zkoušku použít.

Rozsah neplánované syntézy DNA (UDS) se zhodnotí stanovením inkorporace značených nukleosidů do buněk, které neprošly plánovanou syntézou DNA (S-fází). Nejrozšířenější technikou je autoradiografické stanovení inkorporace thymidinu značeného tritiem (3H-TdR). Pro zkoušky na UDS in vivo se přednostně používají játra potkana. Jiné tkáně než játra mohou být rovněž použity, nejsou však předmětem této metody.

Detekce odpovědi UDS závisí na počtu bází DNA vyštěpených a nahrazených v místě poškození. Zkouška na UDS je tedy vhodná zvláště pro detekci dlouhých reparací ("long-patch repair") (20 až 30 bází) indukovaných látkou. Krátké opravy ("short-patch repair") (jedna až tři báze) jsou naproti tomu detekovány s daleko menší citlivostí. Navíc může důsledkem neuskutečněné reparace, chybné reparace nebo chybné replikace lézí DNA dojít k mutagenním událostem. Rozsah odpovědi UDS neposkytuje žádnou informaci o věrnosti reparačních procesů. Navíc je možné, že mutagen reaguje s DNA, ale poškození DNA není opraveno vyštěpovací reparací. Nedostatek specifických informací, které tato zkouška poskytuje o mutagenní aktivitě, je vyvážen potenciální citlivostí tohoto jevu, neboť je vyšetřován v celém genomu.

Viz také obecný úvod, část B.

1.2 DEFINICE

Opravované buňky : čistý počet zrn odpovídajících buněčným jádrům (NNG), vyšší než předvolená hodnota stanovená laboratoří provádějící zkoušku.

Čistý počet zrn odpovídajících buněčným jádrům (NNG) : kvantitativní míra UDS aktivity buněk v autoradiografické zkoušce na UDS, vypočtená odečtením průměrného počtu zrn v cytoplasmatických oblastech (CG) odpovídajících jádrům od počtu zrn odpovídajících buněčným jádrům (NG): NNG = NG — CG. Hodnota NNG se vypočte pro jednotlivé buňky, poté společně pro buňky v kultuře, v paralelních kulturách atd.

Neplánovaná syntéza DNA (UDS) : Syntéza reparací DNA po vyštěpení a odstranění úseku DNA obsahujícího region s poškozením indukovaným chemickými látkami nebo fyzikálními činiteli.

1.3 PODSTATA ZKUŠEBNÍ METODY

Zkouška na UDS v jaterních buňkách savců in vivo indikuje syntézu reparací DNA po vyštěpení a odstranění úseku DNA obsahujícího region s poškozením indukovaným chemickými látkami nebo fyzikálními činiteli. Zkouška je obvykle založena na inkorporaci 3H-TdR do DNA jaterních buněk, kde je malá četnost buněk v S-fázi buněčného cyklu. Inkorporace 3H-TdR je obvykle stanoveno autoradiografií, jelikož tato technika není tak citlivá na vliv S-fáze buněk jako např. kapalná scintilační spektrometrie.

1.4 POPIS METODY

1.4.1 Přípravky

1.4.1.1 Výběr druhu zvířete

Běžně je používán potkan, ačkoli lze použít jakýkoli vhodný druh savce. Měly by být použity běžně používané laboratorní kmeny mladých zdravých pohlavně dospělých zvířat. V okamžiku zahájení studie by měla být odchylka v hmotnosti zvířat minimální a neměla by překročit ± 20 % střední hodnoty hmotnosti pro obě pohlaví.

1.4.1.2 Podmínky chovu a strava

Platí obecné podmínky podle obecného úvodu k části B, přičemž by mělo být dosaženo vlhkosti vzduchu 50 - 60 %.

1.4.1.3 Příprava zvířat

Zdravá pohlavně dospělá zvířata se náhodným výběrem rozdělí na kontrolní skupinu a skupinu, která se exponuje. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv jejich polohy minimalizován. Zvířata se jednoznačně identifikují a před započetím studie se nechají v laboratorních podmínkách alespoň pět dní aklimatizovat.

1.4.1.4 Příprava zkoušené látky

Pevné zkoušené látky by měly být před aplikací zvířatům rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných rozpouštědlech nebo vehikulech a popřípadě zředěny. Kapalné zkoušené látky mohou být podávány přímo nebo mohou být před podáním zředěny. Měly by být použity čerstvě připravené zkoušené chemické látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.

1.4.2 Zkušební podmínky

1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum

Rozpouštědlo/vehikulum by nemělo mít při použitých úrovních dávek toxické účinky a mělo by být vyloučeno podezření, že reaguje se zkoušenou látkou. Jsou-li použita jiná než známá rozpouštědla/vehikula, mělo by být jejich zařazení podloženo údaji o jejich kompatibilitě. Doporučuje se nejdříve zvážit použití pokud možno vodných rozpouštědel/vehikul.

1.4.2.2 Kontroly

Součástí každé nezávisle prováděné části experimentu by měly být souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. S výjimkou aplikace zkoušené látky by měla zvířata kontrolní skupiny podstoupit stejný proces jako zvířata ve skupinách, v nichž dojde k expozici.

Pozitivními kontrolami by měly být látky, o nichž je známo, že jejich podávání v očekávaných expozičních koncentracích vede k nárůstu UDS detekovatelnému nad pozadím. Pozitivní kontroly vyžadující metabolickou aktivaci by měly být použity v dávkách vyvolávající mírnou odpověď (4). Dávky mohou být zvoleny tak, aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo kódovaná identifikace preparátu. Příklady látek pro pozitivní kontrolu:

Doby odběru | Látka | Číslo CAS | Číslo podle Einecs |

Časné doby odběru (2 až 4 h) | N-nitrosodimethylamin | 62–75–9 | 200–249–8 |

Pozdní doby odběru (12 až 16 h) | N-(fluoren-2-yl)acetamid (2-AAF) | 53–96–3 | 200–188–6 |

Mohou být použity také jiné látky pro pozitivní kontrolu. Je přípustné, aby byla pozitivní kontrolní látka podávána jiným způsobem, než zkoušená látka.

1.5 POSTUP

1.5.1 Počet a pohlaví zvířat

Měl by být použit dostatečný počet zvířat, aby bylo zohledněno přirozené biologické kolísání odpovědi na zkoušku. Každá skupina by se měla skládat alespoň ze tří analyzovatelných zvířat. Jestliže jsou shromážděny dostatečné dosavadní údaje, je pro negativní a pozitivní kontrolní skupiny nezbytné pouze jedno až dvě zvířata.

Jestliže jsou v době studie k dispozici údaje ze studií se stejným druhem a za použití stejného způsobu expozice, jež prokazují, že neexistuje mezi pohlavími rozdíl v toxicitě, bude postačující zkoušení jednoho pohlaví, nejlépe samců. Je-li expozice člověka specifická pro určité pohlaví, jako je tomu například u některých farmaceutických látek, měla by být zkouška provedena se zvířetem odpovídajícího pohlaví.

1.5.2 Plán expozice

Zkoušené látky jsou zpravidla podávány jednorázově.

1.5.3 Dávkování

Za normálních podmínek se používají alespoň dvě úrovně dávek. Nejvyšší dávka je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že vyšší dávky by vedly podle očekávání při stejném režimu dávkování k letalitě. Nižší dávka by měla být zpravidla 50 % až 25 % vyšší dávky.

Látky se specifickou biologickou aktivitou při nízkých netoxických dávkách (např. hormony a mitogeny) nemusí kritériím stanovení dávky vyhovovat a měly by být hodnoceny případ od případu. Provádí-li se kvůli neexistenci vhodných dostupných údajů studie pro zjištění rozsahu, měla by být provedena ve stejné laboratoři, se stejným druhem, kmenem, pohlavím a za stejného režimu expozice, jež se použijí v hlavní studii.

Nejvyšší dávka může být definována také jako dávka vyvolávající známky toxicity v játrech (např. pyknotická jádra).

1.5.4 Limitní zkouška

Jestliže zkouška s jednou dávkou o alespoň 2000 mg/kg tělesné hmotnosti podanou jednorázově nebo ve dvou dávkách v jednom dni nevykazuje žádné pozorovatelné toxické účinky a není-li na základě údajů o látkách, které mají podobnou strukturu, očekávána genotoxicita, nemusí být úplná studie nezbytná. Očekávaná expozice člověka může znamenat potřebu použít v limitní zkoušce vyšší úroveň dávky.

1.5.5 Podávání dávek

Zkoušená látka se obvykle podává nitrožaludečně, žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou. Jiné způsoby podávání jsou možné, lze-li je zdůvodnit. Podávání intraperitoneálně se však nedoporučuje, neboť by játra mohla být exponována zkoušené látce přímo a nikoli prostřednictvím oběhového systému. Maximální objem kapaliny, který může být najednou podán žaludeční sondou nebo injekčně, závisí na velikosti testovacího zvířete. Objem by neměl překročit 2 ml/100 g tělesné hmotnosti. Použití vyšších objemů, než je uvedený objem, musí být zdůvodněno. Až na dráždivé a žíravé látky, které obvykle při vyšších koncentracích vykazují zesílené účinky, by měla být variabilita zkušebního objemu minimalizována nastavením koncentrace zajišťující konstantní objem při všech úrovních dávky.

1.5.6 Příprava jaterních buněk

Jaterní buňky se připravují z exponovaných zvířat zpravidla 12 až 16 hodin po podání dávky. Doplňující dřívější odebrání vzorků (obecně dvě až čtyři hodiny po expozici) je nezbytné, není-li po 12 až 16 hodinách jasná pozitivní odpověď. Mohou však být použity jiné doby odběru, jsou-li zdůvodněny na základě toxikokinetických údajů.

Krátkodobé kultury jaterních buněk savců se zpravidla zakládají perfuzí jater kolagenasou in situ a umožní se, aby se čerstvě disociované jaterní buňky zachytily na vhodném povrchu. Jaterní buňky z negativní kontroly by měly vykazovat životaschopnost (5) alespoň 50 %.

1.5.7 Stanovení UDS

Čerstvě izolované jaterní buňky savců se obvykle vhodnou dobu, např. tři až osm hodin, inkubují s médiem obsahujícím 3H-TdR. Na konci inkubační doby by mělo být médium z buněk odstraněno a buňky poté mohou být inkubovány s médiem obsahujícím přebytek neznačeného thymidinu, aby byla snížena neinkorporovaná radioaktivita ("cold chase"). Buňky se poté promyjí, fixují a vysuší. Při delší inkubační době nemusí být snížení radioaktivity nezbytné. Preparáty se ponoří do autoradiografické emulse, exponují se v temnu (např. v chladu 7 až 14 dnů), vyvolají se, obarví a spočítají se exponovaná zrna stříbra. Z každého zvířete se připraví dva až tři preparáty.

1.5.8 Analýza

Preparáty by měly obsahovat dostatečný počet morfologicky normálních buněk, aby mělo hodnocení UDS výpovědní hodnotu. Preparáty se pod mikroskopem prohlédnou na známky zjevné cytotoxicity (např. na pyknosu, sníženou úroveň značení radioaktivním izotopem).

Před počítáním zrn by měly být preparáty kódovány. Zpravidla se vyšetřuje 100 buněk na každé zvíře alespoň ze dvou preparátů; vyšetření méně než 100 buněk/zvíře by mělo být zdůvodněno. Při počítání zrn se jádra v S-fázi nevyšetřují, ale podíl buněk v S-fázi může být zaznamenán.

Množství 3H-TdR inkorporovaného do jader a cytoplasmy morfologicky normálních buněk doložené navrstvením zrn stříbra by mělo být stanoveno vhodnou metodou.

Počet buněk se stanoví z počtu zrn odpovídajících buněčným jádrŭm (ng) a z prŭměrného počtu zrn v cytoplasmatických oblastech (cg) odpovídajících jádrŭm. jako hodnota cg se použije buď počet buněk pro nejsilněji označenou oblast cytoplasmy, nebo prŭměrná hodnota dvou až tří náhodně vybraných oblastí v blízkosti dotyčných buněčných jader. po odpovídajícím zdŮvodnění mohou být použity i jiné postupy stanovení počtu buněk (např. počítání celých buněk) (6).

2. ÚDAJE

2.1 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ

Měly by být uvedeny údaje pro jednotlivé preparáty a zvířata. Údaje by měly být dále shrnuty ve formě tabulky. Odečtením hodnoty CG od hodnoty NG by měl být vypočten pro každou buňku, pro každé zvíře a pro každou dávku a čas čistý počet zrn odpovídajících buněčným jádrům (NNG). Jestliže jsou počítány "opravované" buňky, měla by být kritéria pro definování "opravovaných" buněk odůvodněna a založena na dosavadních nebo souběžných údajích o negativních kontrolách. Numerické výsledky mohou být zhodnoceny statistickými metodami. Mají-li být použity, měly by být statistické testy vybrány a odůvodněny před provedením studie.

2.2 HODNOCENÍ A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ

Mezi příklady kritérií pro pozitivní nebo negativní odpověď patří:

pozitivní | i) | hodnota NNG leží nad prahovou úrovní, která je zdůvodněna na základě dosavadních údajů laboratoře; |

nebo | ii) | hodnota NNG je významně vyšší než hodnota pro souběžnou kontrolu; |

negativní | i) | hodnota NNG leží na dosavadní prahové hodnotě nebo pod ní; |

nebo | ii) | hodnota NNG není významně vyšší než hodnota pro souběžnou kontrolu. |

Měla by být uvažována biologická relevance údajů, tj. měly by být vzaty v úvahu parametry, jako jsou variabilita zvířat, vztah dávky a odpovědi a cytotoxicita. Při hodnocení výsledků zkoušky mohou být použity jako pomocný prostředek statistické metody. Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pro pozitivní odpověď.

Ačkoli většina experimentů poskytne jasně pozitivní nebo negativní výsledky, v ojedinělých případech neumožní soubor údajů vyslovit konečný výrok o aktivitě zkoušené látky. Výsledky mohou zůstat dvojznačné nebo sporné bez ohledu na to, kolikrát je experiment opakován.

Pozitivní výsledky zkoušky na UDS v jaterních buňkách savců in vivo znamenají, že zkoušená látka indukuje v jaterních buňkách savců in vivo poškození DNA, které lze opravit neplánovanou syntézou DNA in vitro. Negativní výsledky znamenají, že zkoušená látka za podmínek zkoušky neindukuje poškození DNA, které lze detekovat touto zkouškou.

Měla by být diskutována pravděpodobnost, s jakou se zkoušená látka dostane do krevního oběhu popř. do cílové tkáně (např. systémová toxicita).

3. ZPRÁVY

PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace:

Rozpouštědlo/vehikulum:

- zdůvodnění volby vehikula,

- rozpustnost a stálost zkoušené látky v rozpouštědle/vehikulu, je-li známa.

Testovací zvířata:

- použitý druh/kmen,

- počet, stáří a pohlaví zvířat,

- zdroj, podmínky chovu, strava atd.,

- individuální hmotnost zvířat na počátku zkoušky, včetně rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnoty a směrodatné odchylky pro každou skupinu.

Zkušební podmínky:

- pozitivní a negativní (vehikulum/rozpouštědlo) kontroly,

- údaje ze studie pro zjištění rozsahu, pokud byla provedena,

- zdůvodnění zvolených úrovní dávek,

- údaje o přípravě zkoušené látky,

- údaje o podávání zkoušené látky,

- zdůvodnění způsobu podávání,

- popřípadě metody ověření, zda se zkoušená látka dostala do krevního oběhu nebo do cílové tkáně,

- případně přepočet mezi koncentrací zkoušené látky v krmivu nebo vodě (ppm) na odpovídající dávku (mg/kg tělesné hmotnosti/den),

- podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody,

- podrobný popis rozvrhu expozice a odběru,

- metody stanovení toxicity,

- metody přípravy a kultivace jaterních buněk,

- použitá autoradiografická technika,

- počet preparátů a počet vyšetřených buněk,

- kritéria hodnocení,

- kritéria klasifikace studie na pozitivní, negativní nebo dvojznačnou.

Výsledky:

- střední hodnoty počtu zrn odpovídajících buněčným jádrům a počtu zrn odpovídajících cytoplasmě, a čistý počet zrn, jednotlivě pro preparáty, zvířata a skupiny,

- podle možnosti závislost odpovědi na dávce,

- případné statistické hodnocení,

- známky toxicity,

- údaje o souběžné negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole,

- dosavadní údaje o negativní (rozpouštědlo/vehikulum) a pozitivní kontrole s rozmezími, středními hodnotami a směrodatnými odchylkami,

- počet buněk "opravovaných" buněk, je-li stanoven,

- počet buněk v S-fázi, je-li stanoven,

- životaschopnost buněk.

Rozbor výsledků.

Závěry.

4. LITERATURA

1) Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B., Penman, M. G. (1985), An Assessment of the In vivo Rat. Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutatation Res., 156, 1-18.

2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mirsalis, J., Probst, G., Williams, G. (1987), A Protocol and Guide for the In vivo Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, Mutatation Res., 189, 123-133.

3) Kennelly, J. C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, B., Benford, D. J., Dean, S. W., Mitchell, I. de G. (1993), In vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J., Fox M., (eds), Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part II revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 52-77.

4) Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, B., Doolittle, D. J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C. A., Mori, H. (1993), Recommendations for the Performance of UDS Tests In vitro and In vivo, Mutat. Res., 312, 263-285.

5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E., Hechenberger-Freudl, C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the In vivo/In vitro DNA Repair Assay (UDS), Mutatation Res., 291, 21-27.

6) Mirsalis, J. C., Tyson, C. K., Butterworth, B. E. (1982), Detection of Genotoxic Carcinogens in the In vivo/In vitro Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ.Mutagen. 4, 553-562."

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 5

OBECNÉ POŽADAVKY NA KLASIFIKACI A OZNAČOVÁNÍ NEBEZPEČNÝCH LÁTEK A PŘÍPRAVKŮ

Viz směrnice Komise 2001/59/ES, Úř. věst. L 332, 28. 12. 2000, s. 81.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA 6

PŘÍLOHA IX

ČÁST A

předpisy týkající se uzávěrů odolných proti otevření dětmi

Kromě ustanovení čl. 22 odst. 1 písm. e) této směrnice, musí být obaly o jakémkoli objemu obsahující látky, s nimiž je spojeno riziko při vdechování (Xn; R 65) a které jsou klasifikovány a označeny podle bodu 3.2.3 přílohy VI této směrnice, s výjimkou látek uvedených na trh ve formě aerosolů nebo v nádobách opatřených aerosolovým rozprašovačem, opatřeny uzávěry odolnými proti otevření dětmi.

1. Opakovaně uzavíratelné obaly

Uzávěry odolné proti otevření dětmi použité na opakovaně uzavíratelných obalech musí splňovat požadavky normy ISO 8317 (vydání ze dne 1. července 1989) "Obaly odolné dětem — Požadavky na opakovaně uzavíratelné obaly a metody jejich zkoušení" přijatou Mezinárodní organizací pro normalizaci (ISO).

2. Opakovaně neuzavíratelné obaly

Uzávěry odolné proti otevření dětmi použité na opakovaně neuzavíratelných obalech musí splňovat požadavky normy CEN EN 862 (vydání z března 1997) "Obaly — Obaly odolné dětem — Požadavky a zkušební postupy pro opakovaně neuzavíratelné obaly jiných než farmaceutických výrobků" přijatou Evropským výborem pro normalizaci (CEN).

3. Poznámky

1. Prokázání shody s výše uvedenými normami mohou osvědčovat pouze laboratoře, které splňují evropské normy řady EN 45000.

2. Specifické případy

Je-li zřejmé, že obal je dostatečně bezpečný pro děti, neboť se nemohou dostat k obsahu bez pomoci nástroje, nemusí být zkouška provedena.

Ve všech ostatních případech a pokud existují oprávněné důvody k pochybám o bezpečnosti uzávěru pro dítě, může vnitrostátní orgán požadovat, aby osoba odpovědná za uvedení výrobku na trh předložila certifikát vydaný laboratoří podle odst. 3 bodu 1 konstatující, že buď

- typ uzávěru je takový, že jej není nezbytné zkoušet podle výše uvedených norem ISO a CEN,

nebo

- že uzávěr byl zkoušen a byl shledán vyhovujícím podle výše uvedených norem.

ČÁST B

Předpisy týkající se hmatatelných výstrah

Technické specifikace pro hmatatelné výstrahy musí být v souladu s normou EN ISO 11683 (vydání z roku 1997) "Obaly — Hmatatelné výstrahy před nebezpečím — Požadavky".

--------------------------------------------------