81/715/EHSDEVÁTÁ SMĚRNICE KOMISE ze dne 31. července 1981, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv (81/715/EHS)

Devátá směrnice Komise

ze dne 31. července 1981,

kterou se stanoví analytické metody Společenství pro úřední kontrolu krmiv

(81/715/EHS)

KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ,

s ohledem na Smlouvu o založení Evropského hospodářského společenství,

s ohledem na směrnici Rady 70/373/EHS ze dne 20. července 1970, kterou se zavádí metody odběru vzorků a analýzy Společenství pro úřední kontrolu krmiv [1], naposledy pozměněnou Aktem o přistoupení Řecka, a zejména na článek 2 uvedené směrnice,

vzhledem k tomu, že směrnice 70/373/EHS stanoví, že úřední kontroly krmiv za účelem zjištění, zda jsou splněny požadavky právních a správních předpisů na jakost a složení krmiv, se provádějí za použití metod Společenství pro odběr vzorků a analytických metod Společenství;

vzhledem k tomu, že směrnice Komise 71/250/EHS [2], 71/393/EHS [3], 72/199/EHS [4], 73/46/EHS [5], 74/203/EHS [6], 75/84/EHS [7], 76/372/EHS [8] a 78/633/EHS [9], naposledy pozměněné směrnicí ze dne 30. července 1981, již řadu analytických metod Společenství stanovily; že stav od té doby provedených prací nyní umožňuje stanovit devátý soubor analytických metod;

vzhledem k tomu, že opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro krmiva,

PŘIJALA TUTO SMĚRNICI:

Článek 1

Členské státy stanoví, že analýzy pro úřední kontrolu krmiv na obsah avoparcinu a monensinu sodného se provádějí metodami popsanými v příloze.

Článek 2

Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí do 1. prosince 1981. Neprodleně o nich uvědomí Komisi.

Článek 3

Tato směrnice je určena členským státům.

V Bruselu dne 31. července 1981.

Za Komisi

Gaston Thorn

předseda

[1] Úř. věst. L 170, 3.8.1970, s. 2.

[2] Úř. věst. L 155, 12.7.1971, s. 13.

[3] Úř. věst. L 279, 20.12.1971, s. 7.

[4] Úř. věst. L 123, 29.5.1972, s. 6.

[5] Úř. věst. L 83, 30.3.1973, s. 21.

[6] Úř. věst. L 108, 22.4.1974, s. 7.

[7] Úř. věst. L 32, 5.2.1975, s. 26.

[8] Úř. věst. L 102, 15.4.1976, s. 8.

[9] Úř. věst. L 206, 29.7.1978, s. 43.

--------------------------------------------------

PŘÍLOHA

1. STANOVENÍ AVOPARCINU DIFÚZÍ V AGAROVÉM KULTIVAČNÍM MÉDIU

1. ÚČEL A ROZSAH POUŽITÍ

Tato metoda umožňuje stanovení avoparcinu v krmivech a medikovaných premixech. Spodní hranice stanovitelnosti je 2 mg/kg (2 ppm). Přítomnost polyetherických antibiotik může na stanovení působit rušivě.

2. PRINCIP

Ze směsi aceton/voda/kyselina chlorovodíková se vyextrahuje vzorek. Extrakt se odstředí. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze avoparcinu v agarovém kultivačním médiu naočkovaném mikroorganismem Bacillus subtilis. Difúze se dokáže vznikajícími inhibičními zónami mikroorganismu. Průměr inhibičních zón je pro rozsah použitých koncentrací považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika.

3. MIKROORGANISMUS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NICB 8054)

3.1 Uchovávání základní kultury

Agarové kultivační médium (4.1) v šikmých zkumavkách se naočkuje mikroorganismem Bacillus subtilis a přes noc se při 30 °C inkubuje. Kultura se uchovává v chladničce při asi 4 °C a každý měsíc se znovu naočkuje.

3.2. Příprava suspenze spór [1]

Čerstvá kultura v agarovém médiu (3.1) se omyje 2-3 ml sterilní vody. Touto suspenzí se naočkuje Rouxova láhev, která obsahuje 300 ml kultivačního média (4.1), a po dobu 3 až 5 dní se inkubuje při 30 °C. Po kontrole tvorby spór pod mikroskopem se kultura přidá do 15 ml ethanolu (4.2) a zhomogenizuje se. Tato suspenze může být uchována minimálně 5 měsíců při 4 °C.

4. KULTIVAČNÍ MÉDIUM A ČINIDLA

4.1 Kultivační médium [2]

pepton | 6,0 g |

trypton | 4,0 g |

kvasnicový extrakt | 3,0 g |

masový extrakt | 1,5 g |

glukóza | 1,0 g |

agar | 15,0 g |

voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaci) | |

4.2 Ethanol 20 %-ní (v/v): 200 ml ethanolu se zředí 800 ml vody.

4.3 Kyselina chlorovodíková, d: 1,18–1,19.

4.4 Roztok hydroxidu sodného, 2M.

4.5 Fosfátový pufr 0,1 M:

dihydrogenfosforečnan draselný, KH2 PO4: 13,6 g

voda: 1000 ml

pH upravit na 4,5.

4.6 Směs acetonu/vody/kyseliny chlorovodíkové (4.3): 65/32,5/2,5 (v/v/v)

4.7 Standardní substance: avoparcinsulfát o známé aktivitě

5. STANDARDNÍ ROZTOKY

Přesně odvážené množství asi 10 mg standardní substance (4.7) se rozpustí ve fosfátovém pufru (4.5) a tímto pufrem naředí, aby vznikl základní roztok obsahující 100 μg avoparcinu v 1 ml. Při uchování v uzavřené láhvi a při 4 °C, zůstane tento roztok použitelný 7 dní.

5.1 Pro medikované premixy

Z tohoto výchozího roztoku se připraví postupným rozřeďováním fosfátovým pufrem následující roztoky:

S8 | 4 μg/ml |

S4 | 2 μg/ml |

S2 | 1 μg/ml |

S1 | 0,5 μg/ml. |

5.2 Pro krmiva

Z výchozího roztoku se připraví postupným rozřeďováním fosfátovým pufrem následující roztoky:

S8 | 2,0 μg/ml |

S4 | 1,0 μg/ml |

S2 | 0,5 μg/ml |

S1 | 0,25 μg/ml. |

6. PŘÍPRAVA EXTRAKTU A TESTOVACÍHO ROZTOKU

6.1 Medikované premixy

Přesně odvážené množství 10 mg vzorku, které obsahuje 10-100 mg avoparcinu, se v odměrné baňce o obsahu 100 ml mechanicky protřepe s 60 ml směsi (4.6) po dobu 15 minut. Hodnota pH se zkontroluje a pokud je třeba, upraví se kyselinou chlorovodíkovou (4.3) na hodnotu 2. Směsí (4.6) se doplní objem a homogenizuje se. Pak se dílčí množství přefiltruje přes vhodný filtrační papír (např. Whatman č. 1) a prvních 5 ml filtrátu se sleje. Odebere se poměrná část a pH se roztokem hydroxidu sodného (4.4) upraví na hodnotu 4,5. Tento roztok se zředí fosfátovým pufrem (4.5), aby se dosáhlo očekávaného obsahu avoparcinu 4 μg/ml ( = U8).

Z tohoto roztoku se postupným rozřeďováním (1+1) fosfátovým pufrem (4.5) připraví roztoky U4 (očekávaný obsah: 2 μg/ml), U2 (očekávaný obsah: 1 μg/ml) a U1 (očekávaný obsah: 0,5 μg/ml).

6.2 Krmiva

Vzorek o hmotnosti 50 g se přidá do 100 ml směsi (4.6) a po dobu 30 minut se mechanicky protřepává. Extrakt se čistí odstředěním (v uzavřených zkumavkách). Poměrná část čistého extraktu se odebere (viz. následující tabulka) a hodnota pH se roztokem hydroxidu sodného (4.4) upraví na 4,5. Tento roztok se naředí fosfátovým pufrem (4,5), aby se získal roztok U8 (viz. následující tabulka).

Z tohoto roztoku se postupným rozřeďováním (1+1) fosfátovým pufrem (4.5) připraví roztoky U4 (očekávaný obsah: 1,0 μg/ml), U2 (očekávaný obsah: 0,5 μg/ml) a U1 (očekávaný obsah: 0,25 μg/ml).

Očekávaný obsah avoparcinu (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 |

Hmotnost vzorku v g (± 0,1 g) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |

Objem směsi (4.6) v ml | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Objem čistého extraktu (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |

Výsledný objem (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |

Očekávaný obsah U8 v μg/kg | 2 | přibl. 2 | 2 | přibl. 2 | 2 | 2 |

7. POSTUP TESTU

7.1 Naočkování kultivačního média

Zkušební médium (4.1) se naočkuje suspenzí spór (3.2) při teplotě 50–60 °C. Předběžnými pokusy na miskách se zkušebním médiem (4.1) se stanoví množství inokula, které vykáže co možná největší ale ještě ostré inhibiční zóny při různých použitých koncentracích avoparcinu.

7.2 Příprava misek

Test se nasadí jako difúzní test na miskách po čtyřech koncentračních stupních standardního roztoku (S8, S4, S2, S1) a testovacího roztoku (U8, U4, U2, U1).Na každou misku musí být umístěny bezpodmínečně všechny čtyři koncentrace standardu a extraktu. Z toho důvodu musí mít miska takové rozměry, aby bylo možné vytvořit ve vrstvě kultivačního prostředí alespoň osm otvorů o průměru 10-13 mm s rozestupem středů minimálně 30 mm. Test by měl být prováděn především na miskách, které jsou vyrobeny ze skleněné desky, na kterou se umístí hliníkové nebo plastové kroužky o výšce 20 mm a průměru 200 mm.

Na misku se nalije takové množství zkušebního média (4.1) naočkovaného podle 7.1, aby se vytvořila vrstva silná přibližně 2 mm (60 ml na misku o průměru 200 mm). Poté, co vrstva ztuhne, vyhloubí se otvory, do kterých se pipetou odměří přesné množství standardního a testovacího roztoku (mezi 0,10 a 0,15 ml na otvor, podle průměru otvoru). Každá koncentrace musí být použita minimálně čtyřikrát, takže pro každý test se vyhodnotí 32 inhibičních zón.

7.3 Inkubace

Inkubovat po dobu 16 až 18 hodin při 30 °C.

8. VYHODNOCENÍ

Průměr inhibičních zón se změří s přesností na 0,1 mm. Pro každou koncentraci se střední hodnoty zanesou do semilogaritmického papíru, přičemž se zanáší logaritmus koncentrace ve vztahu k průměru inhibičních zón. Pro standardní roztok stejně jako pro extrakt se zakreslí nejpříhodnější přímky, vypočítané např. níže uvedeným způsobem.

Nejvhodnější bod pro nejnižší úroveň standardního roztoku (SL) se stanoví podle následujícího vzorce:

SL =

10

Nejvhodnější bod pro nejvyšší úroveň standardního roztoku (SH) se stanoví podle následujícího vzorce:

SH =

10

Stejně tak se stanoví nejvhodnější body pro nejnižší (UL) a nejvyšší úroveň (UH) extraktu, přičemž se do výše uvedených vzorců dosadí U1, U2, U4 a U8 namísto S1, S2, S4 a S8.

Vypočítané hodnoty SL a SH se zanesou do stejného diagramu. Spojením obou bodů vznikne nejvhodnější přímka pro standardní roztok. Totéž se provede pro hodnoty UL a UH k získání nejvhodnější přímky pro extrakt.

Pokud se nevyskytují rušivé faktory, měly by být přímky rovnoběžné. Přímky je možno považovat za rovnoběžné, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neodchylují více než o 10 % od střední hodnoty.

Pokud úsečky nejsou rovnoběžné, je možné vyloučit buď U1 a S1 nebo U8 a S8. Pak se hodnoty SL, SH, UL a UH určí pomocí následujících vzorců, aby se obdržely alternativní nejvhodnější přímky:

a )SL = 5S1 + 2S2 − S46 | nebo | 5S2 + 2S4 − S86 |

b )SH = 5S4 + 2S2 − S16 | nebo | 5S8 + 2S4 − S26 |

Totéž se provede pro hodnoty UL a UH. U těchto alternativních přímek se rovněž zkontroluje rovnoběžnost. Výsledky, které byly stanoveny ze tří úrovní, by měly být zaznamenány do protokolu o analýze.

Pokud je možno přímky považovat za rovnoběžné, vypočítá se logaritmus relativní aktivity (log A) pomocí jednoho z následujících vzorců:

Pro 4 úrovně

log A =

U

+ U

+ U

+ U

− S

− S

− S

− S

8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 − U1 − U2 − S1 − S2

Pro 3 úrovně

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

4 × 0,401U4 + S4 − U1 − S1

nebo

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

8 × 0,401U8 + S8 − U2 − S2

Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita х relativní aktivita.

Pokud relativní aktivita leží mimo rozsah hodnot 0,5–2,0, zkouška se zopakuje při odpovídajícím přizpůsobení koncentrací extraktu příp. standardních roztoků. Pokud není možné získat relativní aktivitu v rozsahu požadovaných hodnot, výsledek je třeba považovat za přibližný, a to by mělo být zaznamenáno do protokolu o analýze.

Pokud není možné přímky považovat za rovnoběžné, zkouška se zopakuje. Pokud se ani pak nedosáhne rovnoběžnosti, je třeba výsledek považovat za neuspokojivý.

9. OPAKOVATELNOST

Rozdíly mezi výsledky dvou stanovení jednoho analytika při jedné a téže zkoušce by neměly překračovat:

- 2 mg/kg absolutní hodnoty při obsahu avoparcinu 2 až 10 mg/kg,

- 20 % vyšší hodnoty výsledku při obsahu 10 až 25 mg/kg,

- 5 mg/kg absolutní hodnoty při obsahu 25 až 50 mg/kg,

- 10 % vyšší hodnoty výsledku při obsahu nad 50 mg/kg.

2. STANOVENÍ MONENSINU SODNÉHO DIFÚZÍ V AGAROVÉM KULTIVAČNÍM MÉDIU

1. ÚČEL A ROZSAH POUŽITÍ

Metoda umožňuje stanovení monensinu sodného v krmivech a medikovaných premixech. Spodní hranice stanovitelnosti je 10 mg/kg (10 ppm) [3].

2. PRINCIP

Vzorek se extrahuje 90 %-ním methanolem. Extrakt se podrobí vhodnému postupu podle obsahu monensinu sodného ve vzorku. Jeho antibiotická aktivita se stanoví měřením difúze monensinu sodného v agarovém kultivačním médiu naočkovaném mikroorganismem Bacillus subtilis. Difúze se prokáže vznikajícími inhibičními zónami mikroorganismu. Průměr těchto inhibičních zón je v rozsahu použitých koncentrací považován za přímo úměrný logaritmu koncentrace antibiotika. Citlivost postupu je snížena přítomností sodných iontů.

3. MIKROORGANISMUS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NICB 8054)

3.1 Uchování kmenové kultury

Agarové kultivační médium (4.1) v šikmých zkumavkách se naočkuje mikroorganismem Bacillus subtilis a přes noc se inkubuje při 30 °C. Kultura se uchovává v chladničce při asi 4 °C a každý měsíc se znovu naočkuje.

3.2 Příprava suspenze spór [4]

Čerstvá kultura na agaru (3.1) v šikmé zkumavce se omyje 2-3 ml sterilní vody. Touto suspenzí se naočkuje Rouxova láhev, která obsahuje 300 ml kultivačního média (4.1), a po dobu 3 až 5 dní se inkubuje při 30 °C. Po kontrole tvorby spór pod mikroskopem se kultura přidá do 15 ml ethanolu (4.3) a zhomogenizuje se. Tato suspenze může být uchována minimálně 5 měsíců při 4 °C.

4. KULTIVAČNÍ MÉDIUM A ČINIDLA

4.1 Kultivační médium [5]

trypton | 10,0 g |

kvasnicový extrakt | 3,0 g |

masový extrakt | 1,5 g |

glukóza | 1,0 g |

agar (podle kvality) | 10,0-20,0 g |

voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaci) | |

4.2 Zkušební médium

glukóza | 10,0 g |

kvasnicový extrakt | 2,5 g |

hydrogenfosforečnan draselný, K2HPO4 | 0,69 g |

dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4 | 0,45 g |

agar (podle kvality) | 10,0-20,0 g |

voda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterilizaci) | |

4.3 Ethanol 20 %-ní (v/v): 200 ml ethanolu se zředí 800 ml vody.

4.4 Methanol, bezvodý.

4.5 Methanol 90 %-ní (v/v): 900ml methanolu (4.4) se zředí 100 ml vody.

4.6 Methanol 50 %-ní (v/v): 500ml methanolu (4.4) se zředí 500 ml vody.

4.7 Oxid hlinitý, granulovaný (alcoa F, 20 mesh; activated alumina UG1: F. Lancaster and Co., nebo rovnocenný).

4.8 Standardní substance: monensin sodný o známé aktivitě (mimo jiné získatelný u International Laboratory for Boilogical Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey KT15 3NB, Velká Británie).

5. PŘÍSTROJE

5.1 Vakuová rotační odparka s 250ml kulatou baňkou.

5.2 Skleněná trubička pro chromatografii, vnitřní průměr: 25 mm, délka: 400 mm, s otvorem o průměru 2 mm na jednom konci.

5.3 Skleněná trubička pro chromatografii, vnitřní průměr: 11 mm, délka: přibližně 300 mm, s otvorem o průměru 2 mm na jednom konci.

6. STANDARDNÍ ROZTOKY

Přesně odvážené množství asi 10 mg standardní substance (4.8) se rozpustí v methanolu (4.4) a naředí, aby vznikl výchozí roztok s obsahem monensinu sodného 800 μg/ml. Při uchování v uzavřené láhvi a při 4 oC, zůstane tento roztok použitelný 2 týdny.

Z tohoto výchozího roztoku se připraví postupným rozřeďováním 50 %-ním methanolem (4.6) následující roztoky:

S8 | 8 μg/ml |

S4 | 4 μg/ml |

S2 | 2 μg/ml |

S1 | 1 μg/ml. |

7. PŘÍPRAVA EXTRAKTU A TESTOVACÍHO ROZTOKU

7.1 Extrakce

7.1.1 Medikované premixy

Vzorek o hmotnosti 2,0 mg se přidá k 100 ml 90 %-ního methanolu (4.5), několik minut se protřese a odstředí. Zbytek se zředí 50 %-ním methanolem (4.6), aby bylo dosaženo očekávané koncentrace monesinu sodného 8 μg/ml ( = U8).

7.1.2 Krmiva, u nichž podíl monensinu není nižší než 50 ppm

Vzorek o hmotnosti 10 až 20 g se přidá k 100 ml 90 %-ního methanolu (4.5), 15 minut protřese a nechá ustát.

Vatová zátka se zavede do skleněné trubičky (5.2) a za lehkého poklepávání trubičkou se naplní do výše 75–80 mm oxidem hlinitým (4.7).

Extrakt se převede na sloupec oxidu hlinitého a zachytí se filtrát. 30 ml filtrátu se zředí 50 ml vody. Hned poté se zředí 50 %-ním methanolem (4.6), aby bylo dosaženo očekávané koncentrace monesinu sodného 8 μg/ml ( = U8).

7.1.3 Krmiva u nichž podíl monensinu nedosahuje 50 ppm (spodní hranice 10 ppm)

Vzorek o hmotnosti 10 až 20 g se přidá k 100 ml 90 %-ního methanolu (4.5), 15 minut protřese a odstřeďuje dokud se nevyčistí.

Pro vzorek s podílem monensinu 20 ppm se odebere 40 ml zbytku; pro 10 ppm se odebere 80 ml. Roztok se odpaří ve vakuu při teplotě nepřesahující 40 oC v rotačním odparce (5.1). Zůstatek se rozpustí v 10 ml 90 %-ního methanolu.

Vatová zátka se zavede do skleněné trubičky (5.3) a za lehkého poklepu se trubička naplní do výše 75–80 mm oxidem hlinitým.

Methanolový roztok zbytku se převede na sloupec oxidu hlinitého a filtrát se odebere. Kolona se promyje 10 ml 90procentního methanolu a vzniklý filtrát se přidá k prvnímu filtrátu.

Roztok se odpaří ve vakuu při teplotě nepřesahující 40 oC v rotační odparce (5.1). Zůstatek se rozpustí v 10 ml bezvodého methanolu (4.4) a roztok se doplní vodou na 20 ml. Roztok se odstřeďuje minimálně 5 minut při minimálních otáčkách 4000 ot/min. Hned poté se zředí 50 %-ním methanolem, aby bylo dosaženo očekávané koncentrace monesinu sodného 8 μg/ml ( = U8).

7.2. Testovací roztok

Z roztoku U8 se postupným rozřeďováním (1 + 1) 50 %-ním methanolem (4.6) připraví roztoky U4 (očekávaný podíl: 4 μg/ml), U2 (očekávaný podíl: 2 μg/ml), U1 (očekávaný podíl: 1 μg/ml).

8. POSTUP TESTU

8.1 Naočkování kultivačního média

Zkušební médium (4.2) se naočkuje suspenzí spór (3.2) při 50 až 60 oC. Předběžnými pokusy na miskách se zkušebním médiem (4.2) se stanoví množství inokula, které vykáže co možná největší ale ještě ostré inhibiční zóny s různými použitými koncentracemi monensinu sodného.

8.2 Příprava misek

Test se nasadí jako difúzní test na miskách po čtyřech koncentračních stupních standardního roztoku (S8, S4, S2, S1) a testovacího roztoku (U8, U4, U2, U1). Na každou misku musí být naneseny bezpodmínečně všechny čtyři koncentrace standardu a extraktu. Z toho důvodu musí mít miska takové rozměry, aby bylo možné vytvořit ve vrstvě kultivačního média alespoň osm otvorů o průměru 10-13 mm s rozestupem středů minimálně 30 mm. Test by měl být prováděn především na miskách, které jsou vyrobeny ze skleněné desky, na nichž je umístěn hliníkový nebo plastový kroužek o výšce 20 mm a průměru 200 mm.

Na misku se nalije takové množství zkušebního média (4.1) naočkovaného podle 8.1, aby se vytvořila vrstva silná přibližně 2 mm (60 ml na misku o průměru 200 mm). Poté co vrstva ztuhne, vyhloubí se otvory, do kterých se pipetou odměří přesné množství standardního a testovacího roztoku (mezi 0,10 a 0,15 ml na otvor, podle průměru otvoru). Každá koncentrace musí být použita minimálně čtyřikrát, takže pro každý test se vyhodnotí 32 inhibičních zón.

8.3 Inkubace

Inkubovat přibližně po dobu 18 hodin při 35 až 37 oC.

9. VYHODNOCENÍ

Prŭměr inhibičních zón se změří s přesností na 0,1 mm. Pro každou koncentraci se střední hodnoty zanesou do semilogaritmického papíru, přičemž se zanáší logaritmus koncentrace ve vztahu k průměru inhibičních zón. Pro standardní roztok stejně jako pro extrakt se zakreslí nejpříhodnější přímky, vypočítané např. níže uvedeným způsobem.

Nejvhodnější bod pro nejnižší úroveň standardního roztoku (SL) se stanoví podle následujícího vzorce:

SL =

10

Nejvhodnější bod pro nejvyšší úroveň standardního roztoku (SH) se stanoví podle následujícího vzorce:

SH =

10

Stejně tak se stanoví nejvhodnější body pro nejnižší (UL) a nejvyšší úroveň (UH) extraktu, přičemž se do výše uvedených vzorců dosadí U1, U2, U4 a U8 namísto S1, S2, S4 a S 8.

Vypočítané hodnoty SL a SH se zanesou do stejného diagramu. Spojením obou bodů vznikne nejvhodnější přímka pro standardní roztok. Totéž se provede pro hodnoty UL a UH k získání nejvhodnější přímky pro extrakt.

Pokud se nevyskytují rušivé faktory, měly by být přímky rovnoběžné. Přímky je možno považovat za rovnoběžné, pokud se hodnoty (SH-SL) a (UH-UL) neodchylují více než o 10 % od střední hodnoty.

Pokud přímky nejsou rovnoběžné, je možné vyloučit buď U1 a S1 nebo U8 a S8. Pak se hodnoty SL, SH, UL a UH určí pomocí následujících vzorců, aby se obdržely alternativní nejvhodnější přímky:

a )SL = 5S1 + 2S2 − S46 | nebo | 5S2 + 2S4 − S86 |

b )SH = 5S4 + 2S2 − S16 | nebo | 5S8 + 2S4 − S26 |

Totéž se provede pro hodnoty UL a UH. U těchto alternativních přímek se rovněž zkontroluje rovnoběžnost. Výsledky, které byly stanoveny ze tří úrovní, by měly být zaznamenány do protokolu o analýze.

Pokud je možno přímky považovat za rovnoběžné, vypočítá se logaritmus relativní aktivity (log A) pomocí jednoho z následujících vzorců:

Pro 4 úrovně

log A =

U

+ U

+ U

+ U

− S

− S

− S

− S

8 × 0,602U4 + U8 + S4 + S8 − U1 − U2 − S1 − S2

Pro 3 úrovně

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

4 × 0,401U4 + S4 − U1 − S1

nebo

log A =

U

+ U

+ U

− S

− S

− S

8 × 0,401U8 + S8 − U2− S2

Skutečná aktivita = předpokládaná aktivita х relativní aktivita.

Pokud relativní aktivita leží mimo rozsah hodnot 0,5–2,0, test se zopakuje při odpovídajícím přizpůsobení koncentrací extraktu příp. standardních roztoků. Pokud není možné dosáhnout relativní aktivity v rozsahu požadovaných hodnot, výsledek je třeba považovat za přibližný, a to by mělo být zaznamenáno do protokolu o analýze.

Pokud není možné přímky považovat za rovnoběžné, test se zopakuje. Pokud se ani pak nedosáhne rovnoběžnosti, je třeba výsledek považovat za neuspokojivý.

10. OPAKOVATELNOST

Rozdíly mezi výsledky dvou rozborů jednoho analytika při jedné a téže zkoušce by neměly překračovat:

- 20 % vyšší hodnoty výsledku při obsahu monensinu sodného 10 až 25 mg/kg,

- 5 mg/kg absolutní hodnoty při obsahu 25 až 50 mg/kg,

- 10 % vyšší hodnoty výsledku při obsahu nad 50 mg/kg.

[1] Mohou být použity jiné metody, které poskytnou odpovídající sporovou suspenzi.

[2] Může být použito jakékoliv komerční kultivační médium odpovídajícího složení, které poskytne stejné výsledky.

[3] 1 mg monensinu sodného odpovídá 1000 jednotkám UK.

[4] Mohou být použity jiné metody, které vytvoří odpovídající suspenzi spór.

[5] Může být použito jakékoli komerční kultivační médium odpovídajícího složení, které poskytuje stejné výsledky.

--------------------------------------------------