(EHS) č. 2568/91NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91 ze dne 11. července 1991 o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy

Tento dokument slouží výhradně k informačním účelům a nemá žádný právní účinek. Orgány a instituce Evropské unie nenesou za jeho obsah žádnou odpovědnost. Závazná znění příslušných právních předpisů, včetně jejich právních východisek a odůvodnění, jsou zveřejněna v Úředním věstníku Evropské unie a jsou k dispozici v databázi EUR-Lex. Tato úřední znění jsou přímo dostupná přes odkazy uvedené v tomto dokumentu

►B	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91 ze dne 11. července 1991 o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy (Úř. věst. L 248 5.9.1991, s. 1)

Ve znění:

		Úřední věstník
		Č.	Strana	Datum
►M1	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 3682/91 ze dne 17. prosince 1991,	L 349	36	18.12.1991
M2	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 1429/92 ze dne 26. května 1992,	L 150	17	2.6.1992
M3	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 3288/92 ze dne 12. listopadu 1992,	L 327	28	13.11.1992
M6	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 183/93 ze dne 29. ledna 1993,	L 22	58	30.1.1993
M7	Ve znění: NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 826/93 ze dne 6. dubna 1993,	L 87	6	7.4.1993
M8	COMMISSION REGULATION (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 177/94 ze dne 28. ledna 1994,	L 24	33	29.1.1994
M10	COMMISSION REGULATION (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 656/95 ze dne 28. března 1995,	L 69	1	29.3.1995
M12	COMMISSION REGULATION (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
M13	COMMISSION REGULATION (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
M14	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 282/98 ze dne 3. února 1998,	L 28	5	4.2.1998
M15	COMMISSION REGULATION (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 379/1999 ze dne 19. února 1999,	L 46	15	20.2.1999
M17	COMMISSION REGULATION (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	COMMISSION REGULATION (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	COMMISSION REGULATION (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1989/2003 ze dne 6. listopadu 2003,	L 295	57	13.11.2003
►M21	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 702/2007 ze dne 21. června 2007,	L 161	11	22.6.2007
M22	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 640/2008 ze dne 4. července 2008,	L 178	11	5.7.2008
►M23	NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 61/2011 ze dne 24. ledna 2011,	L 23	1	27.1.2011
M24	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 661/2012 ze dne 19. července 2012,	L 192	3	20.7.2012
►M25	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 299/2013 ze dne 26. března 2013,	L 90	52	28.3.2013
►M26	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) č. 1348/2013 ze dne 16. prosince 2013,	L 338	31	17.12.2013
M27	NAŘÍZENÍ KOMISE V PŘENESENÉ PRAVOMOCI (EU) 2015/1830 ze dne 8. července 2015,	L 266	9	13.10.2015
►M28	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2015/1833 ze dne 12. října 2015,	L 266	29	13.10.2015
►M29	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2016/1227 ze dne 27. července 2016,	L 202	7	28.7.2016
►M30	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2016/1784 ze dne 30. září 2016,	L 273	5	8.10.2016
M31	NAŘÍZENÍ KOMISE V PŘENESENÉ PRAVOMOCI (EU) 2016/2095 ze dne 26. září 2016,	L 326	1	1.12.2016
►M32	PROVÁDĚCÍ NAŘÍZENÍ KOMISE (EU) 2019/1604 ze dne 27. září 2019,	L 250	14	30.9.2019

Opraveno:

C1	Oprava, Úř. věst. L 048, 23.2.2011, s.  19 (61/2011)
C2	Oprava, Úř. věst. L 211, 17.8.2017, s.  58 (2016/2095)

(*)	Tento akt nebyl nikdy publikován v češtině.

---

▼B

NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91

ze dne 11. července 1991

o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy

▼M20

Článek 1

1.  Oleje s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodech 1 a 2 přílohy I tohoto nařízení, jsou považovány za panenské olivové oleje ve smyslu bodu 1 písm. a) a b) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

2.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 3 přílohy I tohoto nařízení, je považován za lampantový olivový olej ve smyslu bodu 1 písm. c) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

3.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 4 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej ve smyslu bodu 2 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

4.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 5 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej obsahující směs rafinovaného olivového oleje a panenského olivového oleje ve smyslu bodu 3 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

5.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 6 přílohy I tohoto nařízení, je považován za surový olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 4 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

6.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 7 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 5 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

7.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 8 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 6 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

▼M26

Článek 2

1.  Charakteristiky olivových olejů uvedených v příloze I se stanoví v souladu s těmito metodami analýzy:

▼M28

▼M26

▼M32

▼M26

▼M28 —————

▼M26

2.  Ověřování organoleptických charakteristik panenského oleje provádí vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci v rámci zkušebních komisí schválených členskými státy.

Organoleptické vlastnosti oleje uvedeného v prvním pododstavci se považují za odpovídající deklarované kategorii v případě, že zkušební komise schválená členským státem potvrdí jeho zařazení.

▼M32

V případě, že zkušební komise nepotvrdí deklarovanou kategorii oleje vzhledem k jeho organoleptickým charakteristikám, nechají vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci na žádost zainteresované strany bez odkladu provést dvě oponentní hodnocení jinými schválenými zkušebními komisemi. Alespoň jedna z těchto komisí musí být schválena členským státem, z nějž pochází výrobce oleje. Dotčené charakteristiky se považují za odpovídající deklarovaným charakteristikám, pokud obě oponentní hodnocení potvrdí deklarovanou kvalitu. Pokud tomu tak není, prohlásí se klasifikace za neodpovídající uvedeným charakteristikám, nehledě na typ nedostatků zjištěných během hodnocení, a náklady na oponentní hodnocení ponese zainteresovaná strana.

▼M26

3.  Pokud vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci ověřují vlastnosti oleje postupem podle odstavce 1, provádí se odběr vzorků v souladu s mezinárodními normami EN ISO 661 o přípravě zkušebních vzorků a EN ISO 5555 o odběru vzorků. Pokud jsou však takové oleje ve spotřebitelských obalech baleny po šaržích, pak odchylně od bodu 6.8 normy EN ISO 5555 se odběr vzorků provádí v souladu s přílohou Ia tohoto nařízení. V případě, že odběr vzorků oleje ve velkém balení nemůže být proveden v souladu s normou EN ISO 5555, odeberou se vzorky podle pokynů příslušného orgánu členského státu.

Aniž by byla dotčena ustanovení normy EN ISO 5555 a kapitoly 6 normy EN ISO 661, odebrané vzorky se co nejrychleji umístí z dosahu světla a vysokých teplot a nejpozději pět pracovních dní po odběru se odešlou k analýze do laboratoře, jinak musí být uchovávány tak, aby se neznehodnotily nebo nepoškodily během přepravy nebo skladování, než budou do laboratoře zaslány.

4.  Pro účely ověření podle odstavce 3 se analýzy uvedené v přílohách II, III, IX, XII a XX, jakož i případné kontrolní analýzy stanovené vnitrostátními právními předpisy, v případě balených výrobků provádějí před datem minimální trvanlivosti. V případě odběru vzorků olejů ve velkých baleních se tyto analýzy provádějí nejpozději šestý měsíc po měsíci, v kterém byl vzorek odebrán.

Pro ostatní analýzy uvedené v tomto nařízení neplatí žádné lhůty.

Jestliže výsledky analýz neodpovídají vlastnostem deklarované třídy olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin, dotčená strana je o tom informována nejpozději jeden měsíc před koncem lhůty stanovené v prvním odstavci, kromě případu, kdy byl vzorek odebrán méně než dva měsíce před datem minimální trvanlivosti.

5.  Ke stanovení charakteristik olivového oleje metodami uvedenými v prvním pododstavci odstavce 1 se výsledky analýz porovnávají přímo s mezními hodnotami danými tímto nařízením.

▼M25

Článek 2a

1.  Pro účely tohoto článku se pojmem „olivový olej uváděný na trh“ rozumí celkové množství olivového oleje a olivového oleje z pokrutin příslušného členského státu, které se v uvedeném členském státě spotřebuje nebo které se z uvedeného členského státu vyveze.

2.  Členské státy zajistí, aby kontroly shody byly prováděny selektivně, na základě analýzy rizik a s přiměřenou četností s cílem zajistit, aby olivový olej uváděný na trh byl v souladu s deklarovanou kategorií.

3.  Kritéria pro posouzení rizika mohou zahrnovat:

4.  Členské státy předem stanoví:

Ročně se provádí alespoň jedna kontrola shody na každých tisíc tun olivového oleje uváděného na trh v členském státě.

5.  Členské státy ověří dodržování shody:

▼M32

▼M19 —————

▼M25

Článek 3

Pokud se zjistí, že určitý olej neodpovídá popisu kategorie, do níž patří, uloží daný členský stát, aniž jsou dotčeny jakékoli další sankce, účinné, přiměřené a odrazující sankce, jejichž výše se stanoví podle závažnosti zjištěné nesrovnalosti.

Pokud jsou při kontrolách zjištěny závažné nesrovnalosti, zvýší členské státy četnost kontrol ve vztahu k etapě uvádění na trh, kategorii oleje, původu nebo jiným kritériím.

▼M5

Článek 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Pokud členský stát narazí na potíže při sestavování zkušebních komisí na svém území, může povolat zkušební komisi schválenou v jiném členském státě.

3.  Každý členský stát vypracuje seznam zkušebních komisí sestavených profesionálními nebo mezioborovými organizacemi za podmínek stanovených v odstavci 1 a zajistí dodržování těchto podmínek.

▼M19 —————

▼B

Článek 6

1.  Obsah oleje u pokrutin z oliv a jiných zbytků po extrakci olivového oleje (podpoložky 2306 90 11 a 2306 90 19 ) se stanoví metodou uvedenou v příloze XV.

2.  Obsah oleje, na který odkazuje odstavec 1, se vyjadřuje v procentech hmotnosti oleje v sušině.

▼M20

Článek 7

Pokud jde o přítomnost kontaminujících látek, použijí se příslušné předpisy Společenství.

Pokud jde o halogenovaná rozpouštědla, zavádějí se pro všechny kategorie olivového oleje tyto limity:

▼M25

Článek 7a

Fyzické či právnické osoby a skupiny fyzických či právnických osob vlastnící z profesionálních či obchodních důvodů olivový olej a olivový olej z pokrutin od extrakce v lisovně až po fázi plnění, musí pro každou z kategorií těchto olejů vést evidenci vstupů a výstupů.

Členský stát zajistí, aby byla povinnost stanovená v prvním odstavci řádně dodržována.

▼M25

Článek 8

1.  Členské státy sdělí Komisi opatření přijatá k provádění tohoto nařízení. Rovněž Komisi uvědomí o veškerých následných změnách.

2.  Nejpozději 31. května každého roku předají členské státy Komisi zprávu o provádění tohoto nařízení v předchozím kalendářním roce. Zpráva musí obsahovat alespoň výsledky kontrol shody provedené u olivového oleje podle vzoru stanoveného v příloze XXI.

3.  Oznámení uvedená v tomto nařízení se provádějí v souladu s nařízením Komise (ES) č. 792/2009 ( 1 ).

▼B

Článek 9

Nařízení (EHS) č. 1058/77 se zrušuje.

Článek 10

1.  Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Metoda uvedená v příloze XII se však použije ode dne ►M1  1. listopadu 1992 ◄ , s výjimkou případů, kdy se jedná o intervenční opatření.

▼M5

Tato metoda se nepoužije u panenského olivového oleje stočeného před 1. listopadem 1992.

▼B

2.  Toto nařízení se nepoužije na olivový olej a olivový olej z pokrutin stočený do obalů před vstupem tohoto nařízení v platnost a uvedený na trh do 31. října 1992.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

▼M32

---

PŘÍLOHY

OBSAH

Příloha I	Charakteristiky olivového oleje
Příloha Ia	Odběr vzorků ze šarží olivového oleje a olivového oleje z pokrutin ve spotřebitelských obalech
Příloha Ib	Vývojový diagram pro ověření souladu vzorku olivového oleje s deklarovanou kategorií
Příloha II	Stanovení volných mastných kyselin, metoda za studena
Příloha III	Stanovení peroxidového čísla
Příloha IV	Stanovení obsahu vosku pomocí kapilární plynové chromatografie
Příloha VII	Stanovení procentního podílu 2-glyceryl monopalmitátu
Příloha IX	Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra
Příloha X	Stanovení methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií
Příloha XI	Stanovení těkavých halogenovaných rozpouštědel v olivovém oleji
Příloha XII	Metoda mezinárodní rady pro olivový olej pro organoleptické hodnocení panenského olivového oleje
Příloha XV	Stanovení obsahu oleje v olivových pokrutinách
Příloha XVI	Stanovení jodového čísla
Příloha XVII	Metoda pro stanovení stigmastadienolů v rostlinných olejích
Příloha XVIII	Stanovení rozdílu mezi skutečným a teoretickým obsahem triacylglycerolů s ekvivalentním počtem uhlíkových atomů 42 (ECN 42)
Příloha XIX	Stanovení složení a obsahu sterolů a alkoholových sloučenin kapilární plynovou chromatografií
Příloha XX	Metoda stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií
Příloha XXI	Výsledky kontrol shody provedených u olivového oleje uvedené v čl. 8 odst. 2

---

PŘÍLOHA I

CHARAKTERISTIKY OLIVOVÉHO OLEJE

Jakostní charakteristiky

Charakteristiky týkající se čistoty

Poznámky:

---

Dodatek

Rozhodovací schémata

Kampesterol – rozhodovací schéma pro panenské a extra panenské olivové oleje:

Ostatní parametry musí být v souladu s mezními hodnotami stanovenými v tomto nařízení.

Delta-7-stigmastenol – rozhodovací schéma pro:

Ostatní parametry musí být v souladu s mezními hodnotami stanovenými v tomto nařízení.

Ostatní parametry musí být v souladu s mezními hodnotami stanovenými v tomto nařízení.

▼M26

---

PŘÍLOHA Ia

ODBĚR VZORKŮ ZE ŠARŽÍ OLIVOVÉHO OLEJE A OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN VE SPOTŘEBITELSKÝCH OBALECH

Tato metoda odběru vzorků se použije pro šarže olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin stočené do spotřebitelských obalů. Použijí se různé metody odběru vzorků v závislosti na tom, zda objem spotřebitelských obalů přesahuje 5 litrů či nikoli.

„Šarže“ se skládá z více prodejních jednotek, které jsou vyprodukovány, vyrobeny a zabaleny za takových okolností, že olej obsažený v každé prodejní jednotce se vzhledem ke všem svým analytickým charakteristikám považuje za homogenní. Individualizace šarže musí být provedena v souladu se směrnicí Evropského parlamentu a Rady 2011/91/EU ( 2 ).

„Dílem“ se rozumí množství oleje obsažené ve spotřebitelském obalu a odebrané z namátkou vybraného místa v dané šarži.

1.   OBSAH DÍLČÍHO VZORKU

1.1    Spotřebitelský obal o objemu nejvýše 5 litrů

„Dílčím vzorkem“ u spotřebitelského obalu o objemu nejvýše 5 litrů se rozumí počet dílů odebraných ze šarže v souladu s tabulkou 1.

Počet obalů uvedených v tabulce 1, které tvoří dílčí vzorek, může každý členský stát zvýšit podle vlastní potřeby (např. organoleptické hodnocení provedené jinou laboratoří než tou, která provedla chemické analýzy, kontrolní analýza atd.).

1.2    Spotřebitelský obal o objemu vyšším než 5 litrů

„Dílčím vzorkem“ u spotřebitelského obalu o objemu vyšším než 5 litrů se rozumí reprezentativní část všech dílů získaných redukcí jejich množství a v souladu s tabulkou 2. Dílčí vzorek se musí skládat z různých příkladů.

„Příkladem“ dílčího vzorku se rozumí každý obal, ze kterého se dílčí vzorek skládá.

Za účelem zmenšení objemu vzorků odebraných ze spotřebitelských obalů se obsah odebraných dílů pro přípravu dílčího vzorku homogenizuje. Části jednotlivých dílů se nalijí do společné nádoby pro homogenizaci mícháním tak, aby byly co nejlépe chráněny před přístupem vzduchu.

Obsah dílčího vzorku se musí nalít do série obalů s minimální kapacitou 1,0 litru, z nichž každý představuje příklad dílčího vzorku.

Počet dílčích vzorků může každý členský stát zvýšit podle vlastní potřeby (např. organoleptické hodnocení provedené jinou laboratoří, než která provedla chemické analýzy, kontrolní analýza atd.).

Každý obal musí být naplněn tak, aby byla vzduchová vrstva v jeho vrchní části co nejmenší, a pak se odpovídajícím způsobem uzavře a utěsní s cílem zabránit neoprávněné manipulaci s produktem.

Tyto příklady musí být označeny tak, aby byla zajištěna jejich správná identifikace.

2.   ANALÝZY A VÝSLEDKY

▼M32

▼M26

Pokud jediný z výsledků analýzy nevyhovuje charakteristikám deklarované kategorie olivového oleje, celá šarže se prohlásí za nevyhovující.

3.   OVĚŘENÍ KATEGORIE ŠARŽE

Každý díl představující dílčí vzorek musí být odebrán z průběžného místa v šarži; je třeba zaznamenat umístění každého dílčího vzorku a jednoznačně ho identifikovat.

Každý dílčí vzorek musí být vytvořen v souladu s postupy uvedenými v bodech 1.1 a 1.2.

Každý dílčí vzorek je pak podroben analýzám uvedeným v čl. 2 odst. 1.

▼M32

---

PŘÍLOHA Ib

VÝVOJOVÝ DIAGRAM PRO OVĚŘENÍ SOULADU VZORKU OLIVOVÉHO OLEJE S DEKLAROVANOU KATEGORIÍ

Všeobecná tabulka

Tabulka 1 – Extra panenský olivový olej – kritéria jakosti

Tabulka 2 – Extra panenský olivový olej – kritéria jakosti

Tabulka 3 – Extra panenský olivový olej a panenský olivový olej – kritéria čistoty

Tabulka 4 – Lampantový olivový olej – kritéria čistoty

Tabulka 5 – Rafinovaný olivový olej – kritéria jakosti

Tabulka 6 – Olivový olej (složený z rafinovaného a panenského olivového oleje) – kritéria jakosti

Tabulka 7 – Rafinovaný olivový olej a olivový olej složený z rafinovaného a panenského olivového oleje – kritéria čistoty

Tabulka 8 – Surový olivový olej z pokrutin – kritéria čistoty

Tabulka 9 – Rafinovaný olivový olej z pokrutin – kritéria jakosti

Tabulka 10 – Olivový olej z pokrutin – kritéria jakosti

Tabulka 11 – Rafinovaný olivový olej z pokrutin a olivový olej z pokrutin – kritéria čistoty

▼M29

---

PŘÍLOHA II

STANOVENÍ VOLNÝCH MASTNÝCH KYSELIN, METODA ZA STUDENA

1.   PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda popisuje postup stanovování volných mastných kyselin v olivových olejích a olivových olejích z pokrutin. Obsah volných mastných kyselin je vyjádřen jako kyselost vypočtená v procentech kyseliny olejové.

2.   PODSTATA METODY

Vzorek se rozpustí ve směsi rozpouštědel a přítomné volné mastné kyseliny se titrují roztokem hydroxidu draselného nebo hydroxidu sodného.

3.   ČINIDLA

Všechna činidla by měla být čistoty p. a. a používaná voda by měla být destilovaná nebo odpovídající čistoty.

3.1

Směs diethyletheru a 95 % ethanolu 1:1 (V/V). Neutralizuje se těsně před použitím pomocí roztoku hydroxidu draselného (3.2) a přidá se 0,3 ml fenolftaleinového roztoku (3.3) na 100 ml směsi. Poznámka 1:  Diethylether je vysoce hořlavý a může vytvářet výbušné peroxidy. Při jeho používání je třeba dbát zvýšené opatrnosti. Poznámka 2:  Není-li možné použít diethylether, může se použít směsné rozpouštědlo obsahující ethanol a toluen. V případě potřeby může být ethanol nahrazen 2-propanolem.

3.2

Hydroxid draselný nebo hydroxid sodný, titrační ethanolický nebo vodný roztok o koncentraci c(KOH) [nebo c(NaOH)] přibližně 0,1 mol/l, nebo v případě potřeby přibližně 0,5 mol/l. Dostupné jsou komerční roztoky. Přesná koncentrace roztoku hydroxidu draselného (nebo roztoku hydroxidu sodného) musí být známa a zkontrolována těsně před použitím. Použije se roztok připravený nejméně pět dnů před použitím a dekantovaný v láhvi z hnědého skla s gumovou zátkou. Roztok by měl být bezbarvý nebo pouze slabě zbarvený. Je-li při použití vodného roztoku hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) zpozorována separace fází, nahradí se vodný roztok roztokem ethanolickým. Poznámka 3:  Stabilní bezbarvý roztok hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) je možné připravit takto: do varu se uvede 1 000 ml ethanolu nebo vody s 8 g hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) a 0,5 g hliníkových hoblin a nechá se jednu hodinu vařit pod zpětným chladičem. Okamžitě se destiluje. V destilátu se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného). Několik dnů se nechá stát a oddělí se čistá kapalina od usazeniny uhličitanu draselného (nebo uhličitanu sodného). Roztok je možné též připravit bez destilace takto: do 1 000 ml ethanolu (nebo vody) se přidají 4 ml aluminium-butylátu a směs se nechá několik dní stát. Odsazená kapalina se slije a v ní se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného). Roztok je připraven k použití.

3.3	Fenolftalein, roztok o koncentraci 10 g/l v 95–96 % ethanolu (V/V), nebo alkalická modř 6B nebo thymolftalein, roztok o koncentraci 20 g/l v 95–96 % ethanolu (V/V). V případě silně zbarvených olejů se použije alkalická modř nebo thymolftalein.

4.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní přístroje a pomůcky, mj.:

5.   POSTUP

5.1    Příprava zkušebního vzorku.

Je-li vzorek zakalený, měl by být přefiltrován.

5.2    Zkušební vzorek

Hmotnost vzorku se řídí podle očekávané kyselosti (podle údajů v níže uvedené tabulce):

Vzorek se naváží v Erlenmeyerově baňce (4.2).

5.3    Stanovení

Vzorek (5.2) se rozpustí v 50 až 100 ml předem neutralizované směsi diethyletheru a ethanolu (3.1).

Titruje se za současného míchání roztokem hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) o koncentraci 0,1 mol/l (3.2) (viz poznámka 4), dokud nedojde k barevné změně indikátoru (zbarvení indikátoru musí trvat nejméně 10 sekund).

Druhé stanovení se provádí pouze tehdy, je-li první výsledek vyšší než limit určený pro danou kategorii oleje.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Kyselost vyjádřená jako podíl kyseliny olejové v % hmotnostních se vypočítá podle vzorce:

kde:

V

=

spotřeba titračního roztoku hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) v ml;

c

=

přesná koncentrace titračního roztoku hydroxidu draselného (nebo hydroxidu sodného) v mol/l;

M

=

282 g/mol, molární hmotnost kyseliny olejové v g na mol;

m

=

hmotnost vzorku v g.

Obsah kyseliny olejové se udává takto:

▼M30

---

PŘÍLOHA III

STANOVENÍ PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1.    Předmět

Tato příloha popisuje metodu pro stanovení peroxidového čísla živočišných a rostlinných olejů a tuků.

2.    Definice

Peroxidové číslo je množství těchto látek ve vzorku, vyjádřené v miliekvivalentech aktivního kyslíku na kg, které oxidují jodid draselný za popsaných pracovních podmínek.

3.    Podstata

Reakce vzorku s roztokem jodidu draselného v roztoku kyseliny octové a chloroformu. Titrace uvolněného jodu standardizovaným roztokem thiosíranu sodného.

4.    Přístroje a pomůcky

Všechny použité předměty musí být zbaveny redukčních a oxidačních látek.

Poznámka 1: zábrusy nesmějí být mazány tukem.

5.    Reakční činidla

Roztok thiosíranu sodného o koncentraci 0,01 mol/l se připraví denně před použitím ze standardního roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,1 mol/l, nebo se určí přesná molarita. Ze zkušeností vyplývá, že stabilita je omezená a závisí na hodnotě pH a obsahu volného oxidu uhličitého. Pro roztok se použije pouze čerstvě převařená voda, případně se propláchne dusíkem.

Pro určení přesné molarity roztoku thiosíranu sodného se doporučuje následující postup:

S přesností na 0,001 g se do odměrné baňky (250 nebo 500 ml) odváží 0,27 až 0,33 g jodičnanu draselného (mKIO3) a rozpustí se v po rysku doplněné čerstvě převařené vodě (V2), která se předtím nechá ochladit na pokojovou teplotu. Pomocí pipety se 5 nebo 10 ml tohoto roztoku jodičnanu draselného (V1) přenese do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml. Přidá se 60 ml čerstvě převařené vody, 5 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 4 mol/l a 25 až 50 mg jodidu draselného nebo 0,5 ml nasyceného roztoku jodidu draselného. Tento roztok se titruje roztokem thiosíranu sodného (V3) za účelem stanovení přesné molarity roztoku thiosíranu sodného.

kde:

6.    Vzorek

Vzorek je nutno odebrat a skladovat v temnu a chladu ve zcela naplněných skleněných nádobách, hermeticky uzavřených zabroušenou skleněnou, nebo korkovou zátkou.

7.    Postup

Stanovení musí být prováděno v rozptýleném denním světle, nebo při umělém osvětlení. Do skleněné váženky (4.1) nebo baňky (4.2) se s přesností na 0,001 g odváží vzorek o hmotnosti dle následující tabulky, podle předpokládaného peroxidového čísla:

Z baňky (4.2) se vyjme zátka a vloží se do ní váženka obsahující vzorek. Přidá se 10 ml chloroformu (5.1). Vzorek se rychle rozpustí zamícháním. Přidá se 15 ml kyseliny octové (5.2) a potom 1 ml roztoku jodidu draselného (5.3). Baňka se ihned uzavře, protřepá se po dobu jedné minuty a nechá se stát přesně 5 minut v temnu při teplotě 15 až 25 °C.

Přidá se přibližně 75 ml destilované vody. Uvolněný jod se za použití škrobového roztoku (5.5) jako indikátoru za silného protřepávání titruje roztokem thiosíranu sodného (5.4).

Z jednoho zkušebního vzorku se provádějí dvě stanovení.

Spolu s vlastním stanovením se provádí slepý pokus. Jestliže výsledky slepého pokusu přesáhnou 0,05 ml roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,01 N (5.4), je nutno vyměnit znečištěná činidla.

8.    Vyjádření výsledků

Peroxidové číslo (PV) vyjádřené v miliekvivalentech aktivního kyslíku na kilogram se vypočítá podle vzorce:

kde:

V

=

počet ml standardizovaného roztoku thiosíranu sodného (5.4) použitého pro stanovení, korigovaný s přihlédnutím k slepému pokusu.

T

=

přesná molarita použitého roztoku thiosíranu sodného (5.4) v mol/l.

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení.

Výsledek se zaokrouhlí na jedno desetinné místo.

▼M21

---

PŘÍLOHA IV

STANOVENÍ OBSAHU VOSKU POMOCÍ KAPILÁRNÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu vosku v olivových olejích. Vosky se dělí podle počtu atomů uhlíku. Tuto metodu lze použít zejména k rozlišení mezi olivovým olejem získaným lisováním a extrakcí (olivový olej z pokrutin).

2.   PODSTATA METODY

K tuku nebo oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná nejprve při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1	Kónická 25ml baňka.

3.2	Skleněná chromatografická plynová kolona o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm vybavená ventilem.

3.3

Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený přímým vstřikováním, obsahující: 3.3.1 Termostatickou komoru pro kolony vybavenou programátorem teploty. 3.3.2 Studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony. 3.3.3 Plameno-ionizační detekční čidlo a konverzní zesilovač. 3.3.4 Integrátor se zapisovačem, vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (3.3.3), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru. (Lze též použít informační systémy, které umožňují získávání dat z plynové chromatografie pomocí PC.) 3.3.5 Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi, o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm. (Kapalné fáze SE 52 nebo SE 54 vhodné k použití v obchodu.)

3.4	Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou.

3.5	Elektrický vibrátor.

3.6	Rotační odpařovač.

3.7	Muflová pec.

3.8	Analytické váhy s přesností měření ± 0,1 mg.

3.9	Běžné laboratorní skleněné nádoby.

4.   REAKČNÍ ČINIDLA

4.1	Silikagel s velikostí zrna od 60 do 200 μm. Silikagel se umístí alespoň na čtyři hodiny do pece o teplotě 500 °C. Nechá se ochladit a přidají se 2 % vody v poměru k odebranému množství silikagelu. Řádným protřepáním se směs homogenizuje. Před použitím se ponechá nejméně 12 hodin ve tmě.

4.2	n-hexan pro chromatografii.

4.3	Diethylether pro chromatografii.

4.4	n-heptan pro chromatografii.

4.5	Standardní roztok 0,1 % (m/V) laurylarachidátu v hexanu (vnitřní standard). (Lze též použít palmityl palmitát a myristyl stearát.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).

4.6	Nosný plyn: vodík nebo čisté helium pro plynovou chromatografii.

4.7	Pomocné plyny: — vodík, čistý pro plynovou chromatografii, — vzduch, čistý pro plynovou chromatografii.

5.   POSTUP

5.1   Příprava chromatografické kolony

Provede se suspenze 15 g silikagelu (4.1) v n-hexanu (4.2) a zavede se do kolony (3.2). Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru (3.5), aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější. Provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot. Pomocí vah (3.8) se naváží přesně 500 mg vzorku do baňky (3.1) a přidá se vhodné množství vnitřního standardu (4.5) v závislosti na předpokládaném obsahu vosku. Např. 0,1 mg laurylu arachidátu v případě olivového oleje a 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin. Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu (4.2) převede do chromatografické kolony.

Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu, a poté se provede perkolace 70 ml doplňkového n-hexanu za účelem odstranění n-alkanů, které jsou přirozeně přítomny. Poté se zahájí chromatografické eluování, odejme se 180 ml směsi n-hexanu/diethyletheru v poměru 99:1 při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund. Eluování vzorku se musí provést při teplotě okolí 22 °C ± 4.

Poznámky:

Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači (3.6), až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku; poté se přidá 2–4 ml n-heptanu.

5.2   Analýza plynovou chromatografií

5.2.1   Přípravné práce

Kolona se spojí s plynovým chromatografem (3.3), vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detekčnímu činidlu. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detekčního činidla a záznamníku atd.).

Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat. Postupně se zahřívá, dokud není zhruba po 4 hodinách dosaženo teploty 350 °C. Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se provede regulace pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače (3.3.4), nastavení teploty kolonové komory, detekčního činidla atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů.

Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony.

5.2.2   Výběr pracovních podmínek

Pracovní podmínky, které je třeba všeobecně dodržovat, jsou tyto:

Tyto podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem oddělit všechny vosky, dosáhnout dostatečného rozpuštění píků (viz obrázek) a retenčního času vnitřního standardu C32, který musí být 18 ± 3 minuty. Nejreprezentativnější pík vosku musí dosáhnout nejméně 60 % z plného rozsahu.

Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků.

Poznámka:Vzhledem k tomu, že konečná teplota je vysoká, připouští se kladný drift, který nesmí přesáhnout 10 % z plného rozsahu.

5.3   Provedení analýzy

Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok; přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne.

Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nejsou zcela eluovány.

Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům.

5.4   Identifikace píků

Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známé a které byly analyzovány za stejných podmínek.

Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku.

5.5   Kvantitativní vyhodnocení

Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu a alifatickým esterům C40 až C46.

Obsah vosku jednotlivých esterů vyjádřený v mg/kg tukové látky se vypočítá podle vzorce:

kde:

Ax

=

plocha píku každého esteru v milimetrech čtverečních;

As

=

plocha píku vnitřního standardu v milimetrech čtverečních;

ms

=

hmotnost přidaného vnitřního standardu v miligramech;

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v gramech.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se souhrn obsahů jednotlivých vosků C40 až C46v mg/kg tukové látky (ppm).

Poznámka:Sloučeniny, které je třeba kvantifikovat, se stanoví vzhledem k píkům esterů s počtem uhlíků mezi C40 a C46 podle příkladu chromatogramu vosků olivového oleje uvedeného na následujícím obrázku. Pokud se ester C46 objeví dvakrát, doporučuje se pro jeho identifikaci provést analýzu frakce vosků olivového oleje z pokrutin, v níž je pík C46 snadno rozpoznatelný, jelikož jasně převažuje.

Výsledky se vyjádří s přesností na jedno desetinné místo.

Obrázek

Chromatogram vosků olivového oleje ( 3 )

Vysvětlivky:

I.S.

=

Lauryl arachidátu;

1

=

Estery diterpenu;

2 + 2′

=

Estery C40;

3 + 3′

=

Estery C42;

4 + 4′

=

Estery C44;

5

=

Estery C46;

6

=

Estery sterolů a triterpenický alkohol.

---

DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se vstříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu. Změří se doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku eluce píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas změřený v sekundách.

▼M32 —————

▼M26 —————

▼M21

---

PŘÍLOHA VII

STANOVENÍ PROCENTUÁLNÍHO PODÍLU 2-GLYCERIL MONOPALMITÁTU

1.   PŘEDMĚT A ROZSAH POUŽITÍ

Tato metoda popisuje analytický postup stanovení procentuálního podílu kyseliny palmitové ve 2. pozici triglyceridů hodnocením 2-glyceril monopalmitátu.

Tato metoda se použije na tekuté rostlinné oleje při teplotě okolí (20 °C).

2.   PODSTATA METODY

Po přípravě se vzorek oleje podrobí účinku pankreatické lipázy. Parciální a specifická hydrolýza v pozici 1 a 3 molekuly triglyceridu způsobuje, že monoglyceridy se objeví na 2. pozici. Procentuální podíl 2-glyceril monopalmitátu v monoglycerické frakci se stanoví po silylaci pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1	Kónická 25ml baňka.

3.2	Kádinky na 100, 250 a 300 ml.

3.3	Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 21–23 mm a délce 400 mm s vložkou ze sintrovaného skla a kohoutem.

3.4	Nedělené pipety na 10, 50, 100 a 200 ml.

3.5	Baňky na 100 a 250 ml.

3.6	Rotační odpařovač.

3.7	Centrifugační zkumavky s konickým dnem na 10 ml se zabroušenou skleněnou zátkou.

3.8	Odstředivka pro zkumavky o obsahu 10 a 100 ml.

3.9	Termostat umožňující udržet teplotu na 40 °C s přesností na 0,5 °C.

3.10	Dělené pipety na 1 a 2 ml.

3.11	Hypodermická stříkačka na 1 ml.

3.12	Mikrostříkačka na 100 μl.

3.13	Nálevka na 1 000 ml.

3.14	Plynový chromatograf pro kapilární kolony se studeným nástřikovým zařízením on column pro přímé zavádění vzorku do kolony a s termostatem, který je schopen udržovat žádanou teplotu s přesností na 1 °C.

3.15	Studené nástřikové zařízení on column pro přímé zavádění vzorku do kolony.

3.16	Plameno-ionizační detektor a elektrometr.

3.17	Integrátor se zapisovačem, vhodný pro elektrometr, s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru.

3.18	Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující methylpolysiloxan nebo 5 %-fenyl-methylpolysiloxan, o tloušťce 0,10 až 0,30 μm, kterou je možno použít při 370 °C.

3.19	Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou o délce min. 7,5 cm.

4.   CHEMIKÁLIE

4.1

Silikagel s velikostí zrna od 0,063 až po 0,200 mm (70/280 mesh), který se připraví takto: silikagel se položí do porcelánové misky, suší se v sušárně po dobu 4 hodin při teplotě 160 °C, pak se nechá ochladit v exsikátoru při pokojové teplotě. Přidá se voda o objemu shodném s 5 % váhy silikagelu takto: do 500 ml baňky se naváží 152 g silikagelu a přidá se 8 g destilované vody, baňka se zazátkuje a jemně protřepá, aby se voda rozložila rovnoměrně. Nechá se odstát na alespoň 12 hodin před použitím.

▼M32

4.2	n-hexan pro chromatografii. Hexan lze nahradit isooktanem (2,2,4-trimethylpentanem pro chromatografii) za předpokladu, že je dosaženo srovnatelných hodnot přesnosti.

▼M21

4.3	Isopropanol.

4.4	Isopropanol, vodný roztok 1/1 (V/V).

4.5	Pankreatická lipáza. Použitá lipáza musí mít aktivitu mezi 2,0 A 10 jednotkami lipázy na mg (v obchodě existují pankreatické lipázy s aktivitou mezi 2 a 10 jednotkami na mg enzymu).

4.6	Tlumivý roztok trihydroxy-methyl-aminomethanu: 1 M vodný roztok upravený na pH 8 (kontrola potenciometrem) přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové (1/1 V/V).

4.7	Cholát sodný (enzymatické kvality), vodný roztok o koncentraci 0,1 % (tento roztok se musí použít do 15 dnů po přípravě).

4.8	Chlorid vápenatý, vodný roztok o koncentraci 22 %.

4.9	Diethylether pro chromatografii.

4.10	Vyvíjecí rozpouštědlo: směs n-hexanu/diethyletheru (87/13) (V/V).

4.11	Hydroxid sodný, roztok o koncentraci 12 % hmotnostních.

4.12	Fenolftalein, 1 % roztok ethanolu.

4.13	Nosný plyn: vodík nebo helium, pro plynovou chromatografii.

4.14	Pomocné plyny: – vodík o minimální čistotě 99 %, bez vlhkosti a organických látek, a vzduch, pro plynovou chromatografii stejná čistota.

4.15	Silanizační činidla: směs pyridinu/hexametyldisilazanu, trimetylchlorosilanu 9/3/1 (V/V/V) (Roztoky připravené k použití jsou na trhu. Mohou se použít jiná silylační činidla, zejména bis-trimethylsilyl trifluoracetamid + 1 % trimetylchlorosilan, zředěná stejným objemem bezvodého pyridinu.)

4.16	Referenční vzorky: čisté monoglyceridy nebo směsi, které mají podobné procentuální složení jako vzorek.

5.   POSTUP

5.1   Příprava vzorku

5.1.1

Oleje, které mají volnou kyselost nižší než 3 %, nemusí být neutralizovány před chromatografií na silikagelové koloně. Oleje, které mají volnou kyselost vyšší než 3 %, musí být neutralizovány podle bodu 5.1.1.1. 5.1.1.1 Do nálevky na 1 000 ml (3.13) se vleje 50 g oleje a 200 ml n-hexanu. Přidá se 100 ml isopropanolu a množství roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 12 % (4.11) odpovídající volné kyselosti oleje, plus 5 % navíc. Jednu minutu se důkladně protřepe. Přidá se 50 ml destilované vody, znovu se protřepe a nechá se usadit. Po dělení se odstraní spodní mýdlová vrstva. Odstraní se také jakékoli mezilehlé vrstvy (sliz, nerozpustné hmoty). Hexanový roztok neutralizovaného oleje se promyje následnými dávkami 50 až 60 ml roztoku isopropanolu/vody 1/1 (V/V) (4.4), dokud růžové zabarvení fenolftaleinu nezmizí. Většina hexanu se odstraní destilací ve vakuu (např. v rotačním odpařovači) a olej se přelije do baňky na 100 ml (3.5). Olej se suší ve vakuu, dokud nebude rozpouštědlo zcela odstraněno. K tomu musí být kyselost oleje nižší než 0,5 %.

5.1.2

Do kónické 25 ml baňky (3.1) se převede olej připravený podle výše uvedeného způsobu a rozpustí se ve vyvíjecím rozpouštědle (10 ml, 4.10). Roztok se nechá odstát na alespoň 15 minut před chromatografií na silikagelové koloně. Pokud je roztok kalný, odstředí se, aby byly zabezpečeny optimální podmínky pro chromatografii. (Mohou se použít kartony silikagelu SPE na 500 mg, které jsou připraveny k použití.)

5.1.3

Příprava chromatografické kolony Do kolony se vlije (3.3) zhruba 30 ml vyvíjecího rozpouštědla (4.10) a pomocí skleněné tyčinky se do spodní části kolony zavede kousek vaty. Stlačí se, aby se odstranil vzduch. V kádince se připraví suspenze 25 g silikagelu (4.1) ve zhruba 80 ml vyvíjecího rozpouštědla a naleje se do kolony za pomoci nálevky. Ověří se, zda je celý silikagel zaveden do kolony; vymyje se vyvíjecím rozpouštědlem (4.10), otevře se kohoutek a hladina kapaliny se nechá dostoupit zhruba 2 mm nad horní úroveň silikagelu.

5.1.4

Kolonová chromatografie Do 25 ml baňky (3.1) se naváží přesně 1,0 g připraveného vzorku podle bodu 5.1. Vzorek se rozpustí v 10 ml vyvíjecího rozpouštědla (4.10). Roztok se vlije do připravené chromatografické kolony podle bodu 5.1.3. Zabrání se tomu, aby se plocha kolony hýbala. Otevře se kohoutek a roztok vzorku se nechá odkapat, než dosáhne hladiny silikagelu. Rozpustí se pomocí 150 ml vyvíjecího rozpouštědla. Průtok se upraví na 2 ml/min (tak, aby 150 ml proteklo do kolony přibližně za 60–70 minut). Do baňky na 250 ml, která byla předtím zvážena, se odebere eluát. Rozpouštědlo se ve vakuu odpaří a jeho zbylé stopy se odstraní pod proudem dusíku. Baňka se zváží a vypočítá se množství získaného extraktu. (V případě použití už hotových silikagelových patron SPE se postupuje takto: zavede se 1 ml roztoku (5.1.2) do předem připravených patron s 3 ml n-hexanu. Po perkolování roztoku se vyvíjí 4 ml n-hexanu/dietyleteru v objemovém poměru 9/1 (V/V). Eluát se odebere do 10 ml zkumavky a odpařuje se pod proudem dusíku až do vysušení. Suché reziduum se podrobí pankreatické lipáze (5.2). Základem je ověřit složení mastných kyselin před a po přechodu patronou SPE.)

5.2   Hydrolýza pankreatickou lipázou

5.2.1

Do centrifugační zkumavky se odváže 0,1 g oleje připraveného podle bodu 5.1. Přidá se 2 ml tlumivého roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, přičemž po každém přidání se protřepe řádně směsí. Zkumavka se uzavře zábrusovou zátkou a umístí se do termostatu při teplotě 40 ± 0,5 °C.

5.2.2

Přidá se 20 mg lipázy, opatrně se protřepe (tak, aby se nenamočila zátka), a zkumavka se dá do termostatu přesně na 2 minuty, potom se vybere, během 1 minuty důkladně protřepává a nechá se vychladit.

5.2.3

Přidá se 1 ml dietyleteru, zazátkuje se a důkladně protřepe, potom se odstředí a pomocí mikrostříkačky se roztok etheru přenese do čisté a suché zkumavky.

5.3   Příprava silanizovaných derivátů a plynová chromatografie

5.3.1

Pomocí mikrostříkačky se 100 μl roztoku (5.2.3) zavede do 10 ml zkumavky s kónickým dnem.

5.3.2

Rozpouštědlo se odstraní pod slabým proudem dusíku, přidá se 200 μl silanizačního činidla (4.15), zkumavka se uzavře zátkou a nechá 20 minut odstát.

5.3.3

Po 20 minutách se přidá 1 až 5 ml n-hexanu (v závislosti na chromatografických podmínkách): výsledný roztok je připravený pro plynovou chromatografii.

5.4   Plynová chromatografie

Pracovní podmínky jsou tyto:

5.4.1   Identifikace píků

Identifikace jednotlivých monoglyceridů se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardními směsmi monoglyceridů, které byly analyzovány za stejných podmínek.

5.4.2   Kvantitativní vyhodnocení

Plocha každého píku se vypočítá pomocí elektronického integrátoru.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Procentuální obsah glyceryl monopalmitátu se vypočítá na základě vztahu mezi plochou odpovídajícího píku a součtem ploch píků všech monoglyceridů (viz obrázek 2), podle vzorce:

Glycéril monopalmitate (%):

(Glycéril monopalmitate = glyceril monopalmitát)

kde:

Ax

=

plocha píku, který odpovídá glyceril monopalmitátu;

ΣA

=

součet ploch všech píků, které odpovídají monoglyceridům;

Výsledek se uvádí s přesností na jedno desetinné místo.

7.   ZPRÁVA O ANALÝZE

Zpráva o analýze musí uvádět:

Obrázek 1

Chromatogram produktů z reakce silanizace, které byly získány lipázou na rafinovaném olivovém oleji s přidáním 20 % esterifikovaného oleje (100 %)

Vysvětlivky: „acides gras libres“ = volné mastné kyseliny; „Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée“ = rafinovaný olivový olej + 20 % esterifikovaný olej; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 monopalmitolein; „1-2 mono C18 insat.“ = nenasycený 1-2 mono C18; „squalene“ = squalen.

Obrázek 2

Chromatogram:

A)

neesterifikovaného olivového oleje po lipáze; po silanizaci; za těchto podmínek (kapilární kolona 8–12 m) je vosková frakce eluovaná zároveň s frakcí diglyceridu nebo krátce poté. Po lipáze by obsah triglyceridů neměl překročit 15 % Vysvětlivky: 1 = Volné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

Chromatogram:

B)

esterifikovaného olivového oleje po lipáze; po silanizaci; za těchto podmínek (kapilární kolona 8–12 m) je vosková frakce eluovaná zároveň s frakcí diglyceridu nebo krátce poté. Po lipáze by obsah triglyceridů neměl překročit 15 % Vysvětlivky: 1 = Volné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitin ** = Triglycerid C54

8.   POZNÁMKY

PŘÍPRAVA LIPÁZY

Lipázy s dostatečnou aktivitou jsou obchodně dostupné. Je ale rovněž možné je připravit v laboratoři takto:

5 kg čerstvé vepřové slinivky břišní se vychladí na 0 °C; okolní sádlo a vazivová tkáň se oddělí a v míchadle se rozmělní, dokud nevznikne tekutá mazlavá pasta. Tato pasta se protřepe po dobu 4 až 6 hodin s 2,5 l bezvodého acetonu a poté odstředí. Zbytek se extrahuje třikrát pomocí stejného množství bezvodého acetonu, potom dvakrát pomocí směsi acetonu a diethyletheru 1:1 (V/V) a dvakrát pomocí diethyletheru.

Zbytek se po 48 hodin suší ve vakuu za účelem získání stabilního prášku, který je možné dlouho skladovat v ledničce chráněný před vlhkostí.

KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY

Emulze olivového oleje se připraví takto:

V míchadle se po 10 minut protřepává směs složená ze 165 ml roztoku arabské gumy o koncentraci 100 g/l, 15 g drceného ledu a 20 ml předem neutralizovaného oleje.

Do 50 ml kádinky se zavede 10 ml této emulze, poté se postupně přidá 0,3 ml roztoku cholátu sodného o koncentraci 0,2 g/ml a 20 ml destilované vody.

Kádinka se vloží do termostatu udržovaného na teplotě 37 °C; vloží se elektrody pH metru a spirálovité míchadlo.

Pomocí byrety se po kapkách přidává roztok hydroxidu sodného 0,1 N, dokud hodnota pH nedosáhne 8,3.

Přidá se objem vodní suspenze lipázy (0,1 g/ml lipázy). Jakmile pH metr začne ukazovat pH 8,3, zapnou se stopky a po kapkách se přikapává roztok hydroxidu sodného takovou rychlostí, aby se udržovala hodnota pH 8,3. Zaznamená se objem spotřebovaného roztoku za minutu.

Údaje se zaznamenávají do grafového systému souřadnic tak, že osa nezávisle proměnných (x-ová osa) ponese časové údaje a na ose závisle proměnných se uvede počet mililitrů alkalického roztoku 0,1 N spotřebovaného na udržení konstantního pH. Výsledný graf musí být lineární.

Aktivita lipázy vyjádřená v lipázových jednotkách na 1 mg je pak dána tímto vzorcem:

kde:

A	je aktivita vyjádřená v jednotkách lipázy/mg;

V	je počet ml roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za minutu (vypočítaný z grafu);

N	je molarita roztoku hydroxidu sodného;

m	je hmotnost zkušební lipázy v mg.

Jednotka lipázy je definovaná jako množství enzymu, které uvolní 10 mikro-ekvivalentů kyseliny za minutu.

▼M20 —————

▼M28

---

PŘÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÁ ANALÝZA V ULTRAFIALOVÉ OBLASTI SPEKTRA

ÚVOD

Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra může poskytnout informace o jakosti tuku, stavu jeho zachovalosti a změnách způsobených technologickými procesy. Absorpce při vlnových délkách specifikovaných v metodě je dána přítomností systémů konjugovaných dienů a trienů, které jsou výsledkem procesů oxidace a/nebo rafinace. Tyto absorpce jsou vyjádřeny jako specifické extinkce

(extinkce vyvolaná 1 % roztokem tuku v předepsaném rozpouštědle, v 10mm kyvetě) obvykle označované písmenem K (též zmiňované jako „extinkční koeficient“).

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato příloha popisuje postup spektrofotometrické analýzy olivového oleje v ultrafialové oblasti spektra.

2.   PODSTATA METODY

Vzorek se rozpustí v požadovaném rozpouštědle a změří se absorbance roztoku při určitých vlnových délkách proti čistému rozpouštědlu.

Vypočítá se specifická extinkce při 232 nm a 268 nm v isooktanu nebo při 232 nm a 270 nm v cyklohexanu pro 1 % hmotnostní koncentrace v 10mm kyvetě.

3.   VYBAVENÍ

3.1.

Spektrofotometr vhodný pro měření v ultrafialových vlnových délkách (mezi 220 nm a 360 nm) s možností odečítání jednotlivých nanometrických jednotek. Doporučuje se provádět pravidelné kontroly přesnosti a reprodukovatelnosti rozsahu absorbance a vlnových délek, jakož i rozptýleného světla. 3.1.1. Rozsah vlnových délek: rozsah vlnových délek se může ověřit pomocí referenčního materiálu tvořeného optickým skleněným filtrem obsahujícím oxid holmia nebo roztok oxidu holmia (uzavřený či neuzavřený), který má různá absorpční pásma. Referenční materiály slouží k ověřování a kalibraci stupnice vlnových délek spektrofotometrů ve viditelné a ultrafialové oblasti spektra s nominální spektrální šířkou pásma 5 nm nebo méně. Podle pokynů přiložených k referenčním materiálům se měření provádějí proti vzdušnému slepému vzorku v rozsahu vlnových délek od 640 do 240 nm. Při každé změně štěrbiny se provede korekce základní linie bez kyvety v optické dráze. Vlnové délky normy jsou uvedeny v osvědčení referenčního materiálu. 3.1.2. Stupnice absorbance: ověřit ji lze pomocí obchodně dostupného uzavřeného referenčního materiálu tvořeného roztoky dichromanu draselného v určitých koncentracích a certifikovaných hodnotách absorbance při jejich λmax (čtyřmi roztoky dichromanu draselného v kyselině chloristé uzavřenými ve čtyřech křemenných kyvetách pro UV k měření linearity a referenční fotometrické přesnosti v UV oblasti spektra). Roztoky dichromanu draselného se měří proti slepému vzorku kyseliny použité po základní korekci podle pokynů přiložených k referenčnímu materiálu. Hodnoty absorbance jsou uvedeny v osvědčení referenčního materiálu. Při kontrole odezvy fotočlánku a fotonásobiče lze rovněž postupovat takto: naváží se 0,2000 g čistého chromanu draselného pro spektrofotometrii a rozpustí se v roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,05 N v 1 000 ml odměrné baňce a doplní po značku. Odebere se přesně 25 ml získaného roztoku, převede do odměrné baňky na 500 ml a doplní po značku stejným roztokem hydroxidu draselného. Extinkce takto získaného roztoku se změří při vlnové délce 275 nm s použitím roztoku hydroxidu draselného jako reference. Extinkce naměřená pomocí jednocentimetrové kyvety by měla být 0,200 ± 0,005.

3.2.	Obdélníkové křemenné kyvety s víčky, vhodné pro měření v ultrafialových vlnových délkách (mezi 220 a 360 nm) o délce optické dráhy 10 mm. Naplněné vodou nebo jiným vhodným rozpouštědlem by se neměly vzájemně lišit o více než 0,01 jednotky extinkce.

3.3.	Odměrné baňky s jednou značkou o objemu 25 ml třídy A.

3.4.	Analytické váhy, které lze odečítat s přesností na 0,0001 g.

4.   ČINIDLA

Není-li uvedeno jinak, používají se během analýzy pouze činidla uznané analytické kvality a destilovaná nebo demineralizovaná voda nebo voda rovnocenné čistoty.

Rozpouštědlo: isooktan (2,2,4-trimethylpentan) pro měření při 232 nm a 268 nm a cyklohexan pro měření při 232 nm a 270 nm, s absorbancí nižší než 0,12 při 232 nm a nižší než 0,05 při 270 nm proti destilované vodě, měřeno v 10mm kyvetě.

5.   POSTUP

5.1.	Zkoumaný vzorek musí být dokonale homogenní a bez suspendovaných nečistot. Není-li tomu tak, musí být přefiltrován přes papír při teplotě přibližně 30 °C.

5.2.

Takto připraveného vzorku se odváží přibližně 0,25 g (s přesností na 1 mg) do odměrné baňky o objemu 25 ml, doplní se po rysku předepsaným rozpouštědlem a homogenizuje se. Výsledný roztok musí být dokonale čirý. Je-li roztok zakalený nebo obsahuje nečistoty, je nutno jej rychle přefiltrovat přes papír. POZNÁMKA: Pro měření absorbance panenských a extra panenských olivových olejů při při 232 nm a 268 nm zpravidla stačí hmotnost 0,25–0,30 g. Pro měření při 232 nm se obvykle požaduje vzorek o váze 0,05 g, takže se obvykle připraví dva různé roztoky. Pro měření absorbance olivového oleje z pokrutin, rafinovaného olivového oleje nebo kontaminovaného olivového oleje je vzhledem k jeho vyšší absorbanci zapotřebí menší část vzorku, např. 0,1 g.

5.3.

Je-li to třeba, proveďte korekci základní linie (220–290 nm) rozpouštědlem v obou křemenných kyvetách (ve vzorku i v referenční kyvetě), potom naplňte vzorkovou křemennou kyvetu zkušebním roztokem a změřte extinkce při 232, 268 nebo 270 nm proti rozpouštědlu, které bylo použito jako reference. Zaznamenané hodnoty extinkce musí být v rozmezí 0,1 až 0,8 nebo v rozsahu linearity spektrofotometru, kterou je nutno ověřit. Pokud tomu tak není, musí se měření zopakovat s koncentrovanějšími nebo případně zředěnějšími roztoky.

5.4.	Po měření absorbance při 268 nebo 270 nm, změřte absorbanci při λmax, λmax + 4 a λmax – 4. Tyto hodnoty absorbance se používají ke stanovení změny specifické extinkce (ΔΚ). POZNÁMKA: Má se za to, že λmax činí 268 nm pro isooktan použitý jako rozpouštědlo a 270 nm pro cyklohexan.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1.

Zaznamenávají se specifické extinkce (extinkční koeficienty) při různých vlnových délkách vypočtené ze vzorce: kde: Kλ = specifická extinkce při vlnové délce λ, Eλ = extinkce měřená při vlnové délce λ; c = koncentrace roztoku v g/100 ml; s = délka dráhy křemenné kyvety v cm; vyjádřeno s přesností na dvě desetinná místa.

6.2.	Změna specifické extinkce (ΔΚ) Změny absolutní hodnoty extinkce (ΔΚ) je dána vzorcem: kde Km je specifická extinkce při vlnové délce pro maximální absorpce ve výši 270 nm a 268 nm v závislosti na použitém rozpouštědle, vyjádřeno s přesností na dvě desetinná místa.

---

PŘÍLOHA X

STANOVENÍ METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato příloha obsahuje pokyny pro stanovení volných a vázaných mastných kyselin v rostlinných tucích a olejích plynovou chromatografií po jejich přeměně na methylestery mastných kyselin (FAME).

Vázané mastné kyseliny triacylglycerolů (TAG) a v závislosti na metodě esterifikace volné mastné kyseliny (FFA) se přeměňují na methylestery mastných kyselin (FAME), které se stanoví kapilární plynovou chromatografií.

Metoda popsaná v této příloze umožňuje stanovovat methylestery mastných kyselin od C12 po C24, včetně methylesterů nasycených, cis- a trans-mononenasycených a cis- a trans-polynenasycených mastných kyselin.

2.   PODSTATA

Pro kvantitativní analýzu FAME se používá plynová chromatografie (GC). Methylestery mastných kyselin se připraví podle části A. Poté se vstříknou do injektoru a uvnitř něj se odpaří. Separace methylesterů mastných kyselin se provádí v analytických kolonách se specifickou polaritou a délkou. Pro detekci FAME se používá plameno-ionizační detektor (FID). Podmínky analýzy jsou uvedeny v části B.

V plynové chromatografii methylesterů mastných kyselin s FID lze jako nosný plyn (mobilní fáze) použít vodík nebo helium. Vodík urychluje separaci a zajišťuje výraznější píky. Stacionární fáze je mikroskopickou vrstvou tenkého tekutého filmu na inertním pevném povrchu z taveného křemene.

Když analyzované odtěkané sloučeniny procházejí kapilární kolonou, reagují se stacionární fází, jež je pokrytím na vnitřním povrchu kolony. Vzhledem k tomuto různému působení rozdílných sloučenin dochází k eluaci v různou dobu, která se nazývá retenčním časem sloučenin pro daný soubor parametrů analýzy. Srovnání retenčních časů se používá stanovení jednotlivých sloučenin.

ČÁST A

PŘÍPRAVA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN Z OLIVOVÉHO OLEJE A OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato část upřesňuje přípravu methylesterů mastných kyselin. Zahrnuje metody pro přípravu methylesterů mastných kyselin z olivového oleje a olivového oleje z pokrutin.

2.   OBLAST POUŽITÍ

Příprava methylesterů mastných kyselin z olivového oleje a olivového oleje z pokrutin se provádí transesterifikací pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného při pokojové teplotě. Nezbytnost čištění vzorku před transesterifikací vzorku závisí na obsahu volných mastných kyselin ve vzorku a analytickém parametru, který má být stanoven, přičemž rozhodnout se lze podle následující tabulky:

3.   METODIKA

3.1.    Transesterifikace pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného při pokojové teplotě

3.1.1.    Podstata

Methylestery se vytvářejí transesterifikací pomocí methanolového roztoku hydroxidu draselného jako mezistupeň před zmýdelněním.

3.1.2.    Činidla

3.1.2.1.

Methanol s obsahem maximálně 0,5 % (m/m) vody

3.1.2.2.

Hexan pro chromatografii

3.1.2.3.

Heptan pro chromatografii

3.1.2.4.

Diethylether, stabilizovaný pro účely analýzy

3.1.2.5.

Aceton pro chromatografii

3.1.2.6.

Eluční rozpouštědlo pro čištění oleje směsí hexanu/diethyletheru 87/13 (v/v) pro sloupcovou chromatografii/chromatografii SPE)

3.1.2.7.

Hydroxid draselný, přibližně 2M methanolový roztok: 11,2 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 100 ml methanolu.

3.1.2.8.

Silikagelové patrony 1 g (6 ml) pro extrakci na pevnou fázi.

3.1.3.    Přístroje a pomůcky

3.1.3.1.

Zkumavky se šroubovacím uzávěrem (o objemu 5 ml) opatřené spojem z PTFE

3.1.3.2.

Dělené nebo automatické pipety, 2 ml a 0,2 ml

3.1.4.    Čištění vzorků oleje

V případě potřeby budou vzorky oleje čištěny na silikagelových patronách pro extrakci na pevnou fázi. Silikagelová patrona (3.1.2.8) se vloží do vakuového elučního zařízení a promývá se s 6 ml hexanu (3.1.2.2), promývání se provádí mimo vakuum. Poté se do kolony vlije roztok oleje (přibližně 0,12 g) v 0,5 ml hexanu (3.1.2.2). Tento roztok se po průchodu kolonou eluuje s 10 ml hexanu/diethyletheru (87/13 v/v) (3.1.2.6). Kombinované eluáty se homogenizují a rozdělí na dva obdobné objemy. Alikvotní část se odpaří do sucha na rotační odparce za sníženého tlaku při pokojové teplotě. Residuum se rozpustí v 1 ml n-heptanu a roztok je připraven k analýze mastných kyselin plynovou chromatografií. Případně se odpaří druhá alikvotní část a residuum se rozpustí v 1 ml acetonu pro analýzu triglyceridů vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

3.1.5.    Postup

Do 5ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem (3.1.3.1) se odváží přibližně 0,1 g vzorku oleje. Přidá se 2 ml heptanu (3.1.2.2) a vše se protřepe. Přidá se 0,2 ml roztoku hydroxidu draselného (3.1.2.7), přidá se uzávěr se spojem z PTFE, uzávěr se utěsní a důkladně protřepe po dobu 30 sekund. Nechá se odstát, dokud nebude svrchní vrstva roztoku čirá. Svrchní vrstva obsahující methylestery se slije. Roztok heptanu je připraven k nástřiku do plynového chromatografu. Do analýzy plynovou chromatografií je vhodné roztok uchovávat v ledničce. Nedoporučuje se skladovat roztok déle než 12 hodin.

ČÁST B

ANALÝZA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato metoda popisuje použití plynové chromatografie v kapilární koloně pro stanovení kvalitativního a kvantitativního složení směsi methylesterů mastných kyselin získaných podle metody uvedené v části A.

Tato část není použitelná pro polymerní mastné kyseliny.

2.   ČINIDLA

2.1.    Nosný plyn

Inertní plyn (helium nebo vodík), dokonale vysušený a s obsahem kyslíku menším než 10 mg/kg.

2.2.    Pomocné plyny

2.2.1.

Vodík (čistota ≥ 99,9 %), neobsahující organické nečistoty.

2.2.2.

Vzduch nebo kyslík, neobsahující organické nečistoty.

2.2.3.

Dusík (čistota > 99 %).

2.3.    Referenční standard

Směs methylesterů čistých mastných kyselin, nebo methylestery z tuku známého složení; výhodné je složení podobné analyzovanému tuku. Pro stanovení trans-isomerů nenasycených kyselin jsou užitečné cis- a trans-isomery methylesterů oktadecenové, oktadekadienové a oktadekatrienové kyseliny.

Pozornost je třeba věnovat ochraně polynenasycených mastných kyselin před oxidací.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Uvedené pokyny se vztahují na obvyklá zařízení používaná pro plynovou chromatografii, která používají kapilární kolony a plameno-ionizační detektor.

3.1.    Plynový chromatograf

Plynový chromatograf obsahuje tyto části:

3.1.1.    Injektor

Injektor se používá pro kapilární kolonu, kde by injektor měl být konstruován přímo pro použití s touto kolonou. V tomto případě může být prováděn buď nástřik pomocí děliče (split type), nebo bez dělení přímo na kolonu (splitless type) nástřik „on column“.

3.1.2.    Termostat

Termostat má mít schopnost vyhřát kolonu na teplotu nejméně 260 °C a udržovat žádanou teplotu s přesností na 0,1 °C. Poslední požadavek je zvlášť důležitý při použití trubice z taveného křemene.

Použití ohřevu s programovanou teplotou je doporučeno ve všech případech, zejména pro mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku.

3.1.3.    Kapilární kolona

3.1.3.1.

Trubice vyrobená z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (obvykle sklo nebo tavený křemen). Vnitřní průměr se pohybuje mezi 0,20 mm až 0,32 mm. Vnitřní povrch musí být před pokrytím stacionární fází přiměřeným způsobem upraven (např. příprava povrchu, inaktivace). Pro cis- a trans-isomery mastných kyselin je dostatečná délka 60 m.

3.1.3.2.

U stacionární fáze jsou vhodné polární polysiloxany (kyanosilikony) vázané stacionární fáze (zesíťované). Poznámka 2:  Při použití polárních polysiloxanů je nebezpečí obtížné identifikace a separace kyseliny linolenové a kyselin C20. Pokrytí má být tenké, tj. 0,1 μm až 0,2 μm.

3.1.3.3.

Montáž a kondicionace kolony Při montáži kapilární kolony, např. úpravě kolony v termostatu (nosič), výběru a provedení spojů (netěsné spoje), polohy konce kolony v injektoru a detektoru (zmenšení mrtvých prostorů) je nutno zachovat běžnou opatrnost. Kolonou se nechá protékat nosný plyn (např. 0,3 bar (30 kPa) pro kolonu délky 25 m a vnitřním průměru 0,3 mm). Kolona se ohřívá v termostatu za programované teploty rychlostí 3 °C/min od teploty okolí do teploty 10 °C pod limitní hodnotu, při které dochází k rozložení stacionární fáze. Termostat se udržuje při této teplotě po dobu jedné hodiny, dokud nedojde k ustálení základní linie. Potom se termostat ochladí na 180 °C a pracuje se za isotermních podmínek. Poznámka 3:  Vhodné kondiciované kolony jsou obchodně dostupné.

3.1.4.    Plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač

3.2.    Stříkačka

Stříkačka o maximálním objemu 10 μl, dělená po 0,1 μl.

3.3.    Systém pro sběr dat

Systém pro sběr dat napojený online na detektory a používaný se softwarovým programem pro integraci píků a normalizaci.

4.   POSTUP

Operace popsané v odstavcích 4.1 až 4.3 se týkají použití plameno-ionizačního detektoru.

4.1.    Zkušební podmínky

4.1.1.    Výběr optimálních pracovních podmínek u kapilárních kolon

Účinnost a permeabilita kapilárních kolon způsobují, že dělení složek a doba trvání analýzy jsou značně závislé na průtoku nosného plynu kolonou. Bude proto nezbytné optimalizovat pracovní podmínky působením na tyto parametry (nebo jednodušeji na tlakovou ztrátu na koloně) podle toho, zda je cílem zlepšit dělení, nebo zrychlit analýzu.

Tyto podmínky se ukázaly být vhodné pro separaci FAME (C4 až C26). Příklady chromatogramů jsou uvedeny v dodatku B:

4.1.2.    Stanovení rozlišení (viz dodatek A)

Rozlišení R dvou sousedních píků I a II se vypočte podle vzorce:

R = 2 × ((dr(II) – dr(I) )/(ω(I) + ω(II))) nebo R = 2 × ((tr(II) – tr(I) )/(ω(I) + ω(II))) (USP) (lékopis USA)

nebo

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (lékopis Japonska), EP (Evropský lékopis), BP (lékopis UK))

kde:

Pokud ω(I) ≈ ω(II), R se vypočte podle těchto vzorců:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

kde

σ je směrodatná odchylka (viz Dodatek A, obrázek 1).

Pokud se vzdálenost dr mezi dvěma píky d r(II) – d r(I) rovná 4σ, faktor rozlišení R = 1.

Nejsou-li dva píky úplně separovány, tečny vedené inflexními body dvou píků se protnou v bodě C. Pro úplnou separaci dvou píků musí být vzdálenost mezi dvěma píky:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, odtud R = 1,5 (viz Dodatek A, obrázek 3).

5.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

5.1.    Kvalitativní analýza

Provede se identifikace píků methylesterů pro vzorek z chromatogramu v dodatku B, obrázku 1, podle potřeby se interpoluje, nebo se porovná s píky referenčních směsí methylesterů (jak je uvedeno v bodě 2.3).

5.2.    Kvantitativní analýza

5.2.1.    Určení složení

Výpočet hmotnostního zlomku w i jednotlivých methylesterů mastných kyselin, vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů, se provede takto:

5.2.2.    Metoda výpočtu

5.2.2.1.   Obecný případ

Obsah složky i vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů se vypočítá určením plochy odpovídajícího píku vzhledem k součtu ploch všech píků podle vzorce:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

5.2.2.2.   Použití korekčních faktorů

V některých případech, zvláště za přítomnosti mastných kyselin s méně než osmi atomy uhlíku, nebo kyselin se sekundární skupinou se plochy opraví pomocí specifických korekčních faktorů (Fci). Tyto faktory se stanoví pro každý jednotlivý nástroj. Pro tento účel se použijí vhodné referenční materiály s certifikovaným složením mastných kyselin v odpovídajícím rozsahu.

Pro tyto referenční směsi se hmotnostní procenta FAME i vypočtou podle vzorce:

wi = (mi /Σm) × 100

kde

Z chromatogramu referenční směsi se vypočítá procentní podíl plochy pro FAME i takto:

wi = (Ai/ΣA) × 100

kde

Korekční faktor Fc je následně:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Pro vzorek činí hmotnostní procenta každého FAME i:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

5.2.2.3.   Použití vnitřního standardu

V některých případech (např. když nejsou kvantifikovány všechny mastné kyseliny, k čemuž dochází, jsou-li přítomny kyseliny se čtyřmi a šesti atomy uhlíku současně s kyselinami s 16 a 18 atomy uhlíku, nebo když je třeba určit absolutní množství mastných kyselin ve vzorku) by měl být použit vnitřní standard. Jako vnitřní standard se používají nejčastěji methylestery mastných kyselin s 5, 15 nebo 17 atomy uhlíku. Pro vnitřní standard by měl být stanoven korekční faktor (pokud se použije).

Hmotnostní procenta složky i vyjádřená jako methylester lze vypočítat podle vzorce:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

kde:

Výsledky se vyjádří s přesností na dvě desetinná místa.

6.   PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol musí obsahovat odkaz na použitou metodu pro přípravu methylesterů a jejich stanovení plynovou chromatografií. Dále zahrnuje všechny pracovní podrobnosti nespecifikované v této standardní metodě nebo považované za volitelné, jakož i další okolnosti, které mohou ovlivnit výsledek.

Protokol musí obsahovat všechny informace nutné pro kompletní identifikaci vzorku.

7.   PŘESNOST

7.1.    Výsledky mezilaboratorní zkoušky

Podrobnosti k mezilaboratorní zkoušce týkající se přesnosti metody jsou uvedeny v příloze C normy IOC/T.20/Doc. No 33. Hodnoty odvozené z této mezilaboratorní zkoušky nelze použít na jiné než uvedené rozsahy koncentrace a matrice.

7.2.    Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou samostatných jednotlivých zkoušek získanými stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu v téže laboratoři týmž pracovníkem používajícím stejné zařízení krátce po sobě není u více než 5 % případů vyšší než R uvedené v tabulkách 1 až 14 přílohy C normy IOC/T.20/Doc. No 33.

7.3.    Reprodukovatelnost

Absolutní rozdíl mezi výsledky dvou jednotlivých zkoušek získanými stejnou metodou na stejném zkušebním materiálu v různých laboratořích a různými pracovníky používajícími odlišná zařízení není u více než 5 % případů vyšší než R uvedené v tabulkách 1 až 14 přílohy C normy IOC/T.20/Doc. No 33.

---

Dodatek A

Obrázek 1

Šířka ω0,5 v poloviční výšce trojúhelníku (ABC) a šířka b v poloviční výšce trojúhelníku (NPM).

---

Dodatek B

Obrázek 1

Plynově-chromatografický profil získaný metodou studené methylace z olivového oleje z pokrutin

Chromatografické píky odpovídají methylesterům a ethylesterům, není-li uvedeno jinak.

▼B

---

PŘÍLOHA XI

STANOVENÍ OBSAHU TĚKAVÝCH HALOGENOVANÝCH ROZPOUŠTĚDEL V OLIVOVÉM OLEJI

1.   PODSTATA

Tato metoda popisuje analýzu plynovou chromatografií s použitím techniky parního prostoru (head space).

2.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

2.1	Plynový chromatograf vybavený detektorem elektronového záchytu (ECD).

2.2	Zařízení pro přípravu vzorku v parním prostoru (head space).

2.3	Skleněná kolona pro plynovou chromatografii o délce 2 m a průměru 2 mm se stacionární fází tvořenou 10 % OV101 nebo ekvivalentem, zachycenou v kyselinou prané a silanizované křemelině s velikostí částic 80-100 mesh.

2.4	Nosný a pomocný plyn: dusík pro plynovou chromatografii, vhodný pro detektor elektronového záchytu.

2.5	Skleněné baňky na 10 až 15 ml s teflonovým povlakem a hliníkovým uzávěrem s vybavením pro vpich stříkačky.

2.6	Hermeticky těsnící svorky.

2.7	Plynová stříkačka na 0,5 až 2 ml.

3.   CHEMIKÁLIE

Standard: halogenovaná rozpouštědla se stupněm čistoty vhodným pro plynovou chromatografii.

4.   POSTUP

4.1

Do skleněné baňky se přesně naváží přibližně 3 g oleje (nesmí být použita opakovaně); baňka se hermeticky uzavře. Baňka se vloží na jednu hodinu do termostatu nastaveného na 70 °C. Pomocí stříkačky se opatrně odebere 0,2 až 0,5 ml z parního prostoru. Obsah stříkačky se nastříkne na kolonu chromatografu nastaveného takto: — teplota vstřiku: 150 °C, — teplota kolony: 70 až 80 °C, — teplota detektoru: 200 až 250 °C. Mohou být použity i jiné teploty, pokud se dosáhne ekvivalentních výsledků.

4.2	Referenční roztoky: s použitím rafinovaného olivového oleje beze stop rozpouštědel se připraví standardní roztoky s různými koncentracemi těkavých halogenovaných rozpouštědel o hodnotách 0,05 mg/kg až 1 mg/kg. V případě potřeby se halogenovaná rozpouštědla rozředí pentanem.

4.3

Kvantitativní vyhodnocení: porovnejte plochy nebo výšky píků vzorku a standardního roztoku, jehož koncentrace se nejvíce blíži předpokládané koncentraci. Je-li odchylka větší než 10 %, analýza musí být opakována, tj. musí být provedeno porovnání s dalším standardním roztokem, dokud nebude odchylka menší než 10 %. Obsah se stanoví na základě průměru jednotlivých vstřiků.

4.4	Vyjádření výsledků: v mg/kg (ppm). Detekční limit činí u této metody 0,01 mg/kg.

▼M26

---

PŘÍLOHA XII

METODA MEZINÁRODNÍ RADY PRO OLIVOVÝ OLEJ PRO ORGANOLEPTICKÉ HODNOCENÍ PANENSKÉHO OLIVOVÉHO OLEJE

▼M28

1.   PŘEDMĚT A OBLAST POUŽITÍ

Cílem mezinárodní metody popsané v této příloze je stanovit postup hodnocení organoleptických vlastností panenského olivového oleje ve smyslu bodu 1 části VIII přílohy VII nařízení Evropského parlamentu a Rady (EU) č. 1308/2013 ( 4 ) a stanovit metodu jeho klasifikace na základě těchto vlastností. Metoda obsahuje rovněž pokyny týkající se nepovinného označování.

Popsaná metoda se vztahuje pouze na panenské olivové oleje a na klasifikaci nebo označování takovýchto olejů podle intenzity vnímaných vad a ovocné chuti a vůně, které stanoví skupina vybraných vyškolených a vyzkoušených posuzovatelů tvořících zkušební komisi.

Normy IOC uvedené v této příloze jsou použity v nejnovější dostupné verzi.

▼M26

2.   OBECNÝ ZÁKLADNÍ SLOVNÍK PRO SENZORICKOU ANALÝZU

Viz norma IOC/T.20/Doc. č. 4 „Senzorická analýza: obecný základní slovník“

3.   SPECIFICKÝ SLOVNÍK

3.1    Negativní znaky

▼M28

3.1.1    Další negativní znaky

3.2    Pozitivní znaky

▼M32

3.3    Nepovinná terminologie pro účely označování

Vedoucí zkušební komise může na požádání potvrdit, že hodnocené oleje splňují definice a rozpětí odpovídající výhradně následujícím termínům v závislosti na intenzitě a vnímání znaků.

Pozitivní znaky (ovocná chuť a vůně, hořký a štiplavý): podle intenzity vnímání:

Seznam termínů podle intenzity vnímání:

▼M26

4.   SKLENĚNÉ NÁDOBKY PRO HODNOCENÍ OLIVOVÉHO OLEJE

Viz norma IOC/T.20/Doc. č. 5 „Skleněné nádobky pro hodnocení olivového oleje“.

5.   ZKUŠEBNÍ MÍSTNOST

Viz norma IOC/T.20/Doc. č. 6 „Návod na zřízení zkušební místnosti“

6.   ZAŘÍZENÍ

Všechny kabiny se vybaví níže uvedeným zařízením, nezbytně nutným pro posuzovatele pro řádné splnění jejich úkolu a snadno dosažitelným:

7.   VEDOUCÍ ZKUŠEBNÍ KOMISE A POSUZOVATELÉ

7.1    Vedoucí zkušební komise

Vedoucím zkušební komise musí být náležitě vyškolená osoba s odbornými znalostmi nezbytnými pro posuzování jednotlivých druhů olivových olejů, s nimiž v průběhu své práce přijde do styku. Je klíčovou postavou ve zkušební komisi a odpovídá za organizaci a řízení zkušebních činností.

Práce vedoucího zkušební komise vyžaduje základní odbornou přípravu v oblasti nástrojů senzorické analýzy, senzorického hodnocení, pečlivost při přípravě, organizaci a provádění zkoušek, jakož i zkušenost a trpělivost při vědeckém plánování a provádění zkoušek.

Je jedinou osobou, která odpovídá za výběr, odbornou přípravu a sledování posuzovatelů, aby se ubezpečil o jejich úrovni výkonnosti. Je proto odpovědný za hodnocení posuzovatelů, které musí být vždy objektivní a pro něž musí vypracovat konkrétní postupy založené na zkouškách a pevně stanovených kritériích výběru nebo vyřazení (viz norma IOC/T.20/Doc. č. 14 „Pokyny pro výběr, výcvik a sledování odborných posuzovatelů panenského olivového oleje“.

Vedoucí zkušební komise je odpovědný za výkon zkušební komise a tedy za její hodnocení, o kterém musí poskytnout spolehlivé a objektivní důkazy. V každém případě je povinen kdykoli prokázat, že metoda i posuzovatelé jsou pod kontrolou. Doporučuje se provádět pravidelnou kalibraci zkušební komise (IOC/T.20/Doc. č. 14, § 5).

Nese konečnou odpovědnost za vedení záznamů zkušební komise. Tyto záznamy musí být vždy dohledatelné, musí být v souladu s požadavky na zabezpečení a jakost stanovené v mezinárodních normách pro senzorickou analýzu a po celou dobu zajišťovat anonymitu vzorků.

Odpovídá za inventarizaci přístrojů a zařízení potřebných k dosažení souladu se specifikacemi této metody a za zajištění jejich řádného čištění a údržby, a o těchto skutečnostech, jakož i o dodržování zkušebních podmínek, uchovává písemné důkazy.

Odpovídá za příjem a skladování vzorků po jejich doručení do laboratoře, jakož i za jejich skladování po provedení zkoušky. Přitom musí za všech okolností zajistit anonymitu a řádné uskladnění vzorků, a za tímto účelem musí vypracovat písemné postupy s cílem zajistit, aby byl celý tento proces sledovatelný a poskytoval záruky.

Kromě toho odpovídá za přípravu, kódové označení vzorků a jejich předkládání posuzovatelům v daném pořadí hodnocení v souladu s předem připravenými protokoly, jakož i za sběr a statistické vyhodnocování dat získaných posuzovateli.

Odpovídá za vytvoření a vypracování jakýchkoli dalších postupů, které budou případně nezbytné k doplnění této normy a k řádnému fungování zkušební komise.

Musí hledat způsoby porovnávání výsledků zkušební komise panelu s výsledky získanými jinými zkušebními komisemi provádějícími analýzu panenského olivového oleje, aby se tak přesvědčil o řádném fungování zkušební komise.

Povinností vedoucího zkušební komise je motivovat členy zkušební komise a podněcovat jejich zájem, zvídavost a soutěživost. Za tímto účelem se důrazně doporučuje, aby zajistil obousměrný bezproblémový tok informací ke členům zkušební komise a průběžně je informoval o všech prováděných úkolech a dosahovaných výsledcích. Zdrží se rovněž vyjadřování svého mínění a musí zabezpečit, aby případné dominantní osobnosti neovlivňovaly ostatní posuzovatele.

Svolává posuzovatele v dostatečném předstihu a zodpovídá veškeré dotazy týkající se provádění zkoušek, avšak zdrží se jakéhokoli vyjadřování svého mínění o vzorku.

▼M28

7.1.1.    Zástupce vedoucího zkušební komise

Vedoucího zkušebního komise může na základě oprávněných důvodů nahradit zástupce, jenž ho může zastupovat v povinnostech souvisejícími s prováděním zkoušek. Tento zástupce musí mít veškeré potřebné dovednosti, které potřebuje vedoucí zkušební komise.

▼M28

7.2    Posuzovatelé

Osoby působící jako posuzovatelé při organoleptických zkouškách olivového oleje tak musí činit dobrovolně. Je proto vhodné, aby uchazeči předkládali písemnou žádost. Uchazeče vybere, vyškolí a sleduje vedoucí zkušební komise podle jejich schopnosti rozlišovat mezi podobnými vzorky; je třeba vzít v úvahu, že jejich posuzovací schopnost se během odborné přípravy zlepší.

Posuzovatelé musí jednat jako skuteční senzoričtí pozorovatelé, nepřihlížet k vlastním osobním chutím a referovat pouze o počitcích, které vnímají. Proto musí vždy pracovat v tichu, uvolněně a beze spěchu a věnovat maximální smyslovou pozornost právě ochutnávanému vzorku.

Pro každou zkoušku je třeba 8 až 12 posuzovatelů, ačkoli je žádoucí mít několik rezervních posuzovatelů pro případ možných absencí.

▼M26

8.   PODMÍNKY ZKOUŠEK

8.1    Prezentace vzorku

Vzorek oleje pro analýzu se předkládá ve standardizovaných skleněných zkušebních nádobkách podle normy IOC/T.20/Doc. č. 5 „Skleněné nádobky pro hodnocení olivového oleje“.

Skleněná nádobka obsahuje 14–16 ml oleje nebo 12,8 až 14,6 g, pokud se vzorky váží, a je zakryta hodinovým sklem.

Každá nádobka musí být označena kódem složeným z náhodně vybraných číslic nebo kombinace písmen a číslic. Kód bude označen pomocí systému, který je bez zápachu.

8.2    Teplota při zkoušce a teplota vzorku

Vzorky oleje určené pro ochutnávání jsou uchovávány ve skleněných nádobkách při teplotě 28°C ± 2 °C po celou dobu zkoušky. Tato teplota byla zvolena proto, že usnadňuje zjišťování organoleptických rozdílů oproti teplotě okolí, a proto, že při nižších teplotách se zřídka uvolňují aromatické sloučeniny charakteristické pro tyto oleje, zatímco vyšší teploty vedou k výskytu těkavých sloučenin charakteristických pro zahřívané oleje. Metoda, která má být použita pro ohřev vzorků ve skleněné nádobce, je popsána v normě IOC/T.20/Doc. č. 5 „Skleněné nádobky pro hodnocení olivového oleje“.

Teplota ve zkušební místnosti se musí pohybovat mezi 20 °C a 25 °C (viz IOC/T.20/Doc. č. 6).

8.3    Doba zkoušek

Nejvhodnější dobou pro ochutnávání olejů je dopoledne. Je dokázáno, že čichově-chuťové smysly jsou v průběhu dne zvláště citlivé. Citlivost čichově-chuťových smyslů je před hlavním jídlem zvláště vysoká, zatímco po jídle slábne.

Toto kritérium však nesmí být přiváděno do extrému, aby posuzovatel nebyl rozptylován hladem a tím nebyla snížena jeho rozlišovací schopnost; proto se doporučuje, aby se ochutnávky konaly mezi 10. hodinou dopolední a polednem.

8.4    Posuzovatelé: obecná pravidla chování

Následující doporučení se týkají chování posuzovatelů během jejich práce.

Jsou-li posuzovatelé vyzváni vedoucím zkušební komise k účasti na organoleptické zkoušce, musí být připraveni dostavit se v stanoveném čase a přitom dodržet dále uvedená pravidla.

9.   POSTUP ORGANOLEPTICKÉHO HODNOCENÍ A KLASIFIKACE PANENSKÉHO OLIVOVÉHO OLEJE

9.1    Technika ochutnávání

▼M29

Po provedení čichové zkoušky posuzovatelé zhodnotí pocity v ústech (celkové retronasální čichově-chuťově-taktilní počitky). To provedou tak, že usrknou přibližně 3 ml oleje. Je velmi důležité rozprostřít olej po celé dutině ústní, od přední části úst a jazyka, podél lícních stěn až k zadní části a části podepírající patro a do krku, protože vnímání chutí a taktilních počitků se co do intenzity mění v závislosti na místu na jazyce, patře a v krku.

Je třeba zdůraznit, že pro posouzení je nebytné, aby se dostatečné množství oleje velmi pomalu rozprostřelo na zadní části jazyka směrem k části podepírající patro a ke krku, přičemž posuzovatel se soustřeďuje na pořadí, v němž se objeví hořký a štiplavý podnět. Pokud se tak nestane, oba tyto podněty mohou u některých olejů uniknout pozornosti nebo může být hořký podnět zastřen podnětem štiplavým.

Krátké opakované nádechy, při nichž je vzduch vtahován ústy, umožňují posuzovateli nejen plošně rozprostřít vzorek po celých ústech, ale též vnímat těkavé aromatické sloučeniny retronasální (pharyngonasální) metodou čichání vynuceným použitím tohoto kanálu.

Pozn.: Pokud posuzovatelé ve vzorku nevnímají ovocnou chuť a vůni a intenzita klasifikujícího negativního znaku dosahuje hodnoty 3,5 nebo nižší, může se vedoucí zkušební komise rozhodnout, že posuzovatelé vzorek zanalyzují ještě jednou za teploty okolí (IOC/T.20/Dok. č. 6/Rev. 1, září 2007, oddíl 3 – Obecné specifikace pro zřízení zkušební místnosti), přičemž upřesní okolnosti a pojem teploty okolí. Když vzorek dosáhne pokojové teploty, měli by jej posuzovatelé znovu zhodnotit, aby ověřili výhradně vnímání ovocné chuti a vůně. Pokud budou ovocnou chuť a vůni vnímat, zaznamenají její intenzitu na stupnici.

V úvahu se též bere taktilní počitek štiplavosti. Za tímto účelem je vhodné olej spolknout.

▼M26

Jelikož postupné posuzování způsobuje únavu nebo ztrátu citlivosti způsobenou předchozími vzorky, je nutné použít něco, co může odstranit z úst zbytky olivového oleje z předchozího hodnocení.

Doporučuje se použít malý plátek jablka, který je možné po rozžvýkání odložit do plivátka. Poté se ústa vypláchnou malým množstvím vody o laboratorní teplotě. Mezi koncem jednoho sezení a začátkem dalšího musí uplynout nejméně 15 minut.

9.2    Používání profilového listu posuzovateli

Profilový list, který posuzovatelé použijí, je zobrazen na obrázku 1 této přílohy.

Každý posuzovatel ve zkušební komisi čichově a následně chuťově ( 5 ) zhodnotí předmětný olej. Následně uvede intenzitu, s níž vnímá každý z negativních a pozitivních znaků, do desetibodové hodnotící tabulky uvedené v obdrženém profilovém listu.

V případě, že posuzovatel vnímá jakékoli případné negativní znaky, které nejsou uvedeny v oddíle 4, musí je zaznamenat do rubriky „ostatní“ s použitím termínu nebo termínů, které dané znaky co nejpřesněji popisují.

▼M28

9.3    Použití údajů vedoucími zkušební komise

Vedoucí zkušební komise shromáždí profilové listy vyplněné jednotlivými posuzovateli a zkontroluje intenzity přisouzené jednotlivým znakům. V případě, že zjistí jakoukoli nesrovnalost, vyzve posuzovatele, aby svůj profilový list revidoval a v případě nutnosti zkoušku zopakoval.

Vedoucí zkušební komise zadá údaje z hodnocení získané od jednotlivých členů zkušební komise do počítačového programu podobného tomu, který stanoví norma IOC/T.20/Doc. č.o15) za účelem statistického výpočtu výsledků analýzy na základě výpočtu jejich mediánu (viz oddíl 9.4 a dodatek k této příloze). Údaje týkající se daného vzorku se zadávají pomocí matice složené z devíti sloupců odpovídajících devíti organoleptickým vlastnostem a z n řádků odpovídajících n počtu posuzovatelů zkušební komise.

Pokud více než 50 % členů zkušební komise vnímalo určitou vadu a uvedlo ji v rubrice „jiné“, vypočítá vedoucí zkušební komise medián této vady a provede příslušnou klasifikaci.

Hodnota robustního variačního koeficientu, který vyjadřuje klasifikaci (vada s nejsilnější intenzitou a znakem ovocné chuti a vůně), musí být nižší nebo rovna 20 %.

Pokud tomu tak není, musí vedoucí komise opakovat hodnocení tohoto konkrétního vzorku při jiném sezení.

Pokud k takové situaci dochází často, doporučuje se, aby vedoucí zkušební komise poskytl posuzovatelům konkrétní doplňkovou odbornou přípravu (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5) a pro kontrolu výkonnosti zkušební komise použil ukazatel opakovatelnosti a ukazatel odchylek (IOC/T.20/Doc. č. 14, § 6).

▼M32

9.4    Klasifikace oleje

Olej se zařadí do následujících kategorií podle mediánu vad a mediánu znaku ovocné chuti a vůně. Medián vad se stanovuje jako medián vady vnímané s největší intenzitou. Medián vad a medián znaku ovocné chuti a vůně se vyjadřuje s přesností na jedno desetinné místo.

Klasifikace oleje se provádí porovnáváním hodnoty mediánu vad a mediánu znaku ovocné chuti a vůně s níže uvedenými referenčními intervaly. Při stanovování hranice těchto intervalů byla zohledněna chyba metody, proto se tyto hranice považují za absolutní. Počítačové programy umožňují zobrazení klasifikace v tabulce statistických údajů nebo na grafu.

V případě hodnocení, která se provádějí za účelem sledování shody, se provádí jedna zkouška. V případě oponentních hodnocení se musí analýza provést dvakrát při různých zkušebních sezeních. Výsledky duplicitní analýzy musí být statisticky homogenní. (Viz bod 9.5). Pokud tomu tak není, musí se vzorek znovu dvakrát analyzovat. Konečná hodnota mediánu klasifikačních znaků se vypočte na základě průměru obou mediánů.

▼M29

9.5    Kritéria pro přijímání a zamítání duplikátů

K určení, zda jsou oba výsledky duplicitní analýzy homogenní nebo statisticky přijatelné, se použije níže definovaná normalizovaná chyba:

Kde Me1 a Me2 jsou mediány obou duplikátů (respektive první a druhé analýzy) a U1 a U2 jsou rozšířené nejistoty získané pro obě hodnoty, vypočtené následovně, jak je upřesněno v dodatku:

U 1 = c × s* and

Pro rozšířenou nejistotu, c = 1,96; proto:

U1 = 0,0196 × CVr × Me1

kde CVr je robustní variační koeficient.

Aby bylo možno konstatovat, že obě získané hodnoty nejsou statisticky odlišné, se musí En rovnat 1,0 nebo být nižší než 1,0.

▼M28

▼M26

---

Dodatek

Metoda výpočtu mediánu a intervaly spolehlivosti

Medián

Medián je definován jako reálné číslo Xm, pro které platí, že pravděpodobnost (p), že hodnoty rozdělení (X) jsou nižší než toto číslo (Xm), je nižší a rovna 0,5, a zároveň že pravděpodobnost (p), že hodnoty rozdělení (X) jsou nižší nebo rovné Xm, je vyšší a rovna 0,5. Praktičtější definice zní, že medián je padesátý percentil rozdělení čísel seřazených podle vzestupného pořadí. Zjednodušeně řečeno se jedná o prostřední hodnotu uspořádané množiny lichých čísel nebo průměr dvou prostředních hodnot uspořádané množiny sudých čísel.

Robustní směrodatná odchylka

Za účelem získání spolehlivého odhadu variability kolem průměru je třeba použít robustní směrodatné odchylky podle Stuarta a Kendalla (4). Tento vzorec uvádí robustní odchylku asymptotického typu, tj. robustní odhad variability zvažovaných údajů, kde N je počet pozorování a IQR je mezikvartilové rozpětí, které zahrnuje přesně 50 % případů daného rozdělení pravděpodobnosti.

Výpočet mezikvartilového rozpětí se provádí výpočtem velikosti rozdílu odchylky mezi 75.. a 25.. percentilem.

Pokud je percentilem hodnota Xpc, pro kterou platí, že pravděpodobnost (p), že hodnoty rozdělení jsou nižší než Xpc, je nižší nebo rovna konkrétní setině, a zároveň že pravděpodobnost (p), že hodnoty rozdělení jsou nižší nebo rovny Xpc, je vyšší nebo rovna této konkrétní setině. Setina označuje zvolený fraktil rozdělení. V případě mediánu se rovná 50/100.

Pro praktické účely představuje percentil hodnotu rozdělení, která odpovídá určité ploše vyznačené od křivky rozdělení nebo hustoty. Například 25. percentil představuje hodnotu rozdělení odpovídající ploše, která se rovná 0,25 nebo 25/100.

Tato metoda slouží k výpočtu percentilů na základě reálných hodnot, které se vyskytují v datové matici (postup pro výpočet percentilů).

Robustní variační koeficient (%)

Robustní variační koeficient CVr % představuje bezrozměrné číslo, které udává procento variability analyzované množiny čísel. Z tohoto důvodu je tento koeficient velice užitečný pro ověření spolehlivosti posuzovatelů ve zkušební komisi.

95% intervaly spolehlivosti mediánu

95% intervaly spolehlivosti (hodnota chyby prvního druhu se rovná 0,05 nebo 5 %) představují interval, v němž by se hodnota mediánu mohla měnit za předpokladu, že by bylo možné pokus donekonečna opakovat. V praxi označuje interval proměnlivosti pokusu za přijatých provozních podmínek vycházející z předpokladu, že by se pokus mohl mnohokrát opakovat. Stejně jako v případě CVr% interval napomáhá při hodnocení spolehlivosti pokusu.

kde C = 1,96 v případě intervalu spolehlivosti na úrovni 95 %.

Příklad výpočetního listu je uveden v příloze I normy IOC/T 20/Doc. č. 15.

Odkazy

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

PŘÍLOHA XV

1.   STANOVENÍ OBSAHU OLEJE V OLIVOVÝCH POKRUTINÁCH

1.1   Přístroje a pomcky

1.2   Chemikálie

Technický hexan, jehož odparek nesmí být větší než 2 mg na 100 ml rozpouštědla.

2.   POSTUP

2.1   Příprava zkušebního vzorku

V případě potřeby se k rozemletí laboratorního vzorku použije předem dobře vyčištěný mechanický mlýnek, aby částice zcela prošly sítem.

Asi jedna dvacetina vzorku se použije pro vyčištění mlýnku; tento rozemletý materiál se vyhodí. Zbytek se rozemele a shromáždí, důkladně promíchá a neprodleně analyzuje.

2.2   Velikost zkušebního vzorku

Po dokončení mletí se naváží asi 10 g vzorku s přesností na 0,01 g.

2.3   Příprava extrakční patrony

Zkušební vzorek se převede do extrakční patrony a utěsní se vatovým tamponem. Je-li použit filtrační papír, zkušební vzorek se do něj zabalí.

2.4   Vysušení předem

Jsou-li olivové pokrutiny velmi vlhké (tj. vlhkost a obsah těkavých látek je vyšší než 10 %), provede se vysušení předem umístěním naplněné extrakční patrony (nebo filtračního papíru) na vhodnou dobu do sušárny vyhřáté na teplotu nejvýše 80 °C, aby došlo ke snížení vlhkosti a obsahu těkavých látek na hodnotu menší než 10 %.

2.5   Příprava extrakční baňky

Extrakční baňka s několika kousky pemzy, která byla předem vysušena v sušárně při teplotě 103 ± 2 °C a zchlazena po dobu nejméně 1 hodiny v exsikátoru, se zváží s přesností na 1 mg.

2.6   První extrakce

Extrakční patrona (nebo filtrační papír) se zkušebním vzorkem se vloží do extrakčního přístroje. Do baňky se nalije potřebné množství hexanu. Extrakční baňka se nasadí na extrakční přístroj a to celé se umístí na elektricky vyhřívanou lázeň. Extrakční baňka se zahřívá tak, aby kondenzace extrakčního rozpouštědla byla nejméně 3 kapky za sekundu (tzn. mírný, ne prudký var). Extrahuje se 4 hodiny. Potom se extrakční přístroj nechá vychladnout. Extrakční patrona se vyjme z extrakčního přístroje a postaví se do proudu vzduchu, aby se odpařila většina rozpouštědla.

2.7   Druhá extrakce

Obsah extrakční patrony se vysype do mikromlýnku a co nejjemněji se rozemele. Rozemletá směs se převede zpět do extrakční patrony, která se vloží zpět do extrakčního přístroje.

Znovu se extrahuje další dvě hodiny do téže extrakční baňky, obsahující již prvou část extraktu.

Roztok obsažený v extrakční baňce musí být čirý. Není-li tomu tak, je nutno jej přefiltrovat přes filtrační papír, přičemž původní baňka a filtrační papír se několikrát propláchnou hexanem. Filtrát a proplachovací rozpouštědlo se převede do druhé předem vysušené baňky zvážené s přesností na 1 mg.

2.8   Odstranění rozpouštědla a vážení extraktu

Větší část rozpouštědla se z extrakční baňky odstraní oddestilováním na elektricky vyhřívané lázni. Poslední stopy rozpouštědla se odstraní zahříváním extrakční baňky po dobu 20 minut v sušárně při 103 ± 2 °C. Zbytku rozpouštědla se mohou odstranit proudem vzduchu, anebo výhodněji inertním plynem zaváděným do baňky po krátkou dobu, nebo pod vakuem.

Baňky s vyextrahovaným olejem se nechají vychladnout na okolní teplotu po dobu nejméně jedné hodiny a zváží se s přesností na 1 mg.

Zvážené baňky se za stejných podmínek znovu zahřívají po dobu 10 minut, opět se nechají vychladnout v exsikátoru a znovu se zváží.

Rozdíl mezi dvěma váženími nesmí být vyšší než 10 mg. Pokud je rozdíl vyšší, opakuje se zahřívání, vychlazení a vážení tak dlouho, dokud rozdíl mezi dvěma po sobě následujícími váženími je nejvýše 10 mg. Potom se zaznamená konečná hmotnost baňky.

Na stejném zkušebním vzorku se vždy provedou dvě zkoušky;.

3.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

3.1   Metoda výpočtu a vzorec

Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení za předpokladu, že jsou splněny požadavky na opakovatelnost.

Výsledek se uvádí s přesností na jedno desetinné místo.

kde	S = procento hmotnostní extraktu z půdního produktu, U = jeho vlhkost a obsah těkavých látek.

3.2   Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi dvěma jednotlivými na sobě nezávislými výsledky zkoušky, získanými stejným pracovníkem v rozmezí krátkého časového intervalu nebo souběžně může činit nejvýše 0,2 g hexanového extraktu na 100 g zkušebního vzorku.

Pokud je rozdíl větší, analýza se opakuje na dalších dvou zkušebních vzorcích. Pokud je rozdíl opět vyšší než 0,2 g, za výsledek se považuje aritmetický průměr všech čtyřech stanovení.

---

PŘÍLOHA XVI

STANOVENÍ JODOVÉHO ČÍSLA

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato mezinárodní norma specifikuje metodu stanovení jodového čísla v živočišných a rostlinných tucích a olejích, dále jen „tuky“.

2.   DEFINICE

Pro účely této mezinárodní normy platí tato definice:

2.1	Jodové číslo: vyjadřuje hmotnost jodu vázaného na vzorek za pracovních podmínek specifikovaných touto mezinárodní normou. Jodové číslo je vyjádřeno v g jodu na 100 g vzorku.

3.   PODSTATA ZKOUŠKY

Zkušební vzorek se rozpustí v rozpouštědle a přidá se Wijsovo činidlo. Po stanoveném čase se přidá roztok jodidu draselného a voda a uvolněný jod se titruje roztokem thiosíranu sodného.

4.   CHEMIKÁLIE

Všechna činidla musí mít čistotu p. a.

4.2	Jodid draselný, 100 g/l roztoku; nesmí obsahovat volný jod nebo jodičnany.

4.3	Škrobový roztok. 5 g rozpustného škrobu se smísí se 30 ml vody a ke směsi se přidá 1 000 ml vroucí vody, vaří se tři minuty a roztok se nechá vychladnout.

4.4	Thiosíran sodný, standardní odměrný roztok c(Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l, standardizovaný ne déle než 7 dnů před použitím.

4.5	Rozpouštědlo připravené smícháním stejných objemů cyklohexanu a kyseliny octové.

4.6	Wijsovo činidlo, obsahující jodmonochlorid v kyselině octové. Doporučuje se použít Wijsovo činidlo obchodně dostupné. Poznámka:Činidlo obsahuje 9 g ICl3 + 9 g I v kyselině octové.

5.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Běžné laboratorní vybavení, a zejména:

5.1	Skleněná váženka, odpovídající hmotnosti zkušebního vzorku a hodící se do baňky (5.2).

5.2	Erlenmeyerovy baňky na 500 ml se skleněnou zabroušenou zátkou, dokonale vysušené.

6.   PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍHO VZORKU

Homogenizovaný vzorek se vysuší síranem sodným a přefiltruje.

7.   POSTUP ZKOUŠKY

7.1

Zkušební vzorek Hmotnost zkušebního vzorku se liší podle očekávaného jodového čísla, viz tabulka 1. Tabulka 1 Očekávané jodové číslo Hmotnost zkušebního vzorku v g Méně než 5 3,00 5 až 20 1,00 21 až 50 0,40 51 až 100 0,20 101 až 150 0,13 151 až 200 0,10 Zkušební vzorek se navažuje s přesností 0,1 mg do skleněné váženky (5.1).

7.2

Stanovení Váženka se zkušebním vzorkem se vloží do 500ml baňky (6.2). Přidá se 20 ml rozpouštědla (4.5), a tuk se rozpustí. Přidá se přesně 25 ml Wijsova činidla (4.6), baňka se uzavře zátkou, obsah se promíchá a baňka se umístí na tmavé místo. Pipetování Wijsova činidla se neprovádí ústy. Stejným způsobem se připraví slepý pokus s přídavkem rozpouštědla a Wijsova činidla, ale vynechá se zkušební vzorek. Pro vzorky s jodovým číslem nižším než 150 se baňka ponechá 1 hodinu v temnotě, pro vzorky s jodovým číslem nad 150, pro polymerované výrobky a výrobky ve značné míře oxidované je nutno dobu prodloužit na 2 hodiny. Po této době se do každé baňky přidá 20 ml roztoku jodidu draselného (4.2) a 150 ml vody (4.1). Obsah baňky se titruje standardním odměrným roztokem thiosíranu sodného (4.4), dokud téměř nezmizí žluté zbarvení jodu. Potom se přidá několik kapek škrobového roztoku (4.3) a pokračuje se v titraci, dokud po intenzivním protřepání nezmizí modré zabarvení. Poznámka:Připouští se stanovení bodu ekvivalence potenciometrickou indikací.

7.3	Počet stanovení Z jednoho zkušebního vzorku se provádějí dvě stanovení.

8.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Jodové číslo se vypočítá podle vzorce:

kde

c

=

přesná koncentrace standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) v mol/l,

V1

=

objem použitého standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) na slepý pokus v ml,

V2

=

objem použitého standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) pro vlastní stanovení v ml,

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v g (7.1).

Jako výsledek se uvádí aritmetický průměr dvou stanovení za předpokladu, že je splněna podmínka opakovatelnosti.

▼M11

---

PŘÍLOHA XVII

METODA PRO STANOVENÍ STIGMASTADIENOLŮ V ROSTLINNÝCH OLEJÍCH

1.   ÚČEL

Stanovení stigmastadienolů v rostlinných olejích obsahujících nízké koncentrace těchto uhlovodíků, zejména v panenském olivovém oleji a surovém olivovém oleji z pokrutin.

2.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato norma může být použita pro všechny rostlinné oleje, ačkoliv měření jsou spolehlivá jedině tehdy, leží-li obsah těchto uhlovodíků mezi 0,01 a 4,0 mg/kg. Metoda je obzvlášť vhodná pro zjišťování přítomnosti rafinovaných rostlinných olejů (olivového oleje, olivového oleje z pokrutin, slunečnicového oleje, palmového oleje atd.) v panenském olivovém oleji, protože na rozdíl od panenských olejů rafinované oleje obsahují stigmastadienoly.

3.   PODSTATA METODY

Izolace nezmýdelnitelného extraktu. Separace steroidové uhlovodíkové frakce kolonovou chromatografií na silikagelu a analýza pomocí kapilární plynové chromatografie.

4.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1	250 ml baňky pro použití se zpětným chladičem.

4.2	Dělicí nálevky na 500 ml.

4.3	100 ml baňky s kulatým dnem.

4.4	Rotační odpařovač.

4.5

Skleněná chromatografická kolona (vnitřní průměr 1,5 až 2,0 cm, délka 50 cm) s teflonovým kohoutem a se dnem se zátkou ze skelné vaty nebo s kotoučem ze sintrovaného skla. Za účelem připravení silikagelové kolony se do chromatografické kolony nalije hexan do výšky přibližně 5 cm a poté se kolonu naplní suspenzí tvořenou 15 g silikagelu a ve 40 ml hexanu pomocí dávek hexanu. Nechá se úplně usadit pomocí mírných vibrací. Přidá se bezvodý síran sodný do výšky přibližně 0,5 cm a nadbytečný hexan se nakonec eluuje.

4.6	Plynový chromatograf s plameno-ionizačním detektorem, vstřikovacím systémem pro nástřik pomocí děliče nebo studeným vstřikovacím systémem typu on-column a termostatickou komorou, nastavitelnou na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C.

4.7	Kapilární kolona z taveného křemene pro plynovou chromatografii (vnitřní průměr 0,25 nebo 0,32 mm, délka 25 m) potažená 5 % fenylmethylsilikonem o tloušťce filmu 0,25 mm. Poznámka 1: Mohou být použity jiné kolony s podobnou nebo nižší polaritou.

4.8	Zapisovač s integrátorem s možností integrace mezi dvěma minimálními hodnotami.

4.9	Mikrostříkačka na 5 až 10 ml pro plynovou chromatografii opatřená tvrzenou jehlou.

4.10	Elektrický ohřívací plášť nebo topná deska.

5.   ČINIDLA

Všechna činidla musí být čistoty p. a., není-li uvedeno jinak. Používá se destilovaná voda nebo voda přinejmenším ekvivalentní čistoty.

▼M32

5.1

Hexan nebo směs alkanů s bodem varu v rozmezí od 65 do 70 oC, destilované v rektifikační koloně. Hexan lze nahradit isooktanem (2,2,4-trimethylpentanem pro chromatografii) za předpokladu, že je dosaženo srovnatelných hodnot přesnosti. Lze zkontrolovat zbytek po odpaření 100 ml rozpouštědla. Rozpouštědla s vyšším bodem varu, než má n-hexan, se odpařují delší dobu. Z důvodu toxicity hexanu se však upřednostňují.

▼M11

5.2	96 % ethanol (V/V).

5.3	Bezvodý síran sodný.

5.4	10 % alkoholový roztok hydroxidu draselného. 10 ml vody se přidá k 50 g hydroxidu draselného, zamíchá se a doplní se ethanolem na objem 500 ml. Poznámka 3: Stáním alkoholový uhličitan draselný hnědne. Měl by být připraven každý den čerstvý a uchováván v dobře uzavřených lahvích z tmavého skla.

5.5

Silikagel 60 pro kolonovou chromatografii, s velikostí částic 70-230 mesh (Merck, č. zboží 7734 apod.). Poznámka 4: Obvykle může být silikagel použit přímo z balení bez jakéhokoli úpravy. Některé šarže silikagelu však mohou vykazovat nízkou aktivitu, která vede k neuspokojivým chromatografickým separacím. V takových případech je nutno postupovat takto: silikagel se aktivuje nejméně 4hodinovým zahříváním na teplotu 550 °C. Po zahřátí se silikagel vloží do exsikátoru a po vychladnutí se převede do uzavíratelné baňky. Přidá se 2 % vody a protřepává se, dokud nezmizí hrudky a dokud se prášek volně nepřesýpá. Šarže silikagelů, jejichž výsledkem jsou chromatogramy se vzájemně se překrývajícími píky, je nutno upravit výše uvedeným způsobem. Jinou alternativou může být použití extra čistého silikagelu 60 (Merck, č. zboží 7754).

5.6	Zásobní roztok (200 ppm) cholesta-3, 5-dienu (Sigma, 99 % čistoty) v hexanu (10 mg v 50 ml).

5.7	Standardní roztok cholesta-3, 5-dienu v hexanu o koncentraci 20 ppm získaný naředěním výše uvedeného roztoku. Poznámka 5: Roztoky 5.6 a 5.7 uchovávané při teplotě do 4 °C jsou stabilní po dobu nejméně čtyř měsíců.

5.8	Roztok n-nonakosanu v hexanu o koncentraci přibližně 100 ppm.

5.9	Nosný plyn pro chromatografii: helium nebo vodík o 99,9990 % čistotě.

5.10	Pomocné plyny pro plameno-ionizační detektor: vodík o 99,9990 % čistotě a čistý vzduch.

6.   POSTUP

6.1   Příprava nezmýdelnitelných látek

6.1.1

Do 250ml baňky (4.1) se naváží 20 ± 0, 1 g oleje, přidá se 1 ml standardního roztoku cholesta-3, 5-dienu (20 μg) a 75 ml 10 % alkoholového roztoku hydroxidu draselného, připojí se zpětný chladič a zahřívá se na mírný var po dobu 30 minut. Baňka obsahující vzorek se odstraní ze zdroje tepla a roztok se nechá mírně vychladnout (nenechá se vychladnout úplně, protože vzorek by se usadil). Přidá se 100 ml vody a roztok se převede do dělící nálevky (4.2) pomocí 100 ml hexanu. Směs se po 30 sekund energicky protřepe a nechá se stát až do separace fází. Poznámka 6: Pokud vznikne emulze, která hned znovu nezmizí, přidávají se malá množství ethanolu.

6.1.2

Spodní vodná fáze se převede do druhé dělící nálevky a znovu se extrahuje 100 ml hexanu. Spodní fáze se nechá znovu vypustit a hexanové extrakty (smíchané v jiné dělící nálevce) se třikrát properou pokaždé 100 ml směsi ethanolu a vodu (1:1), dokud se nedocílí neutrální hodnoty pH.

6.1.3

Hexanový roztok se nechá projít bezvodým síranem sodným (50 g), propere se 20 ml hexanu a odpaří se v rotačním odpařovači do sucha při 30 °C a za sníženého tlaku.

6.2   Separace steroidové uhlovodíkové frakce

6.2.1

Zbytek se převede do rektifikační kolony pomocí dvou 1ml množství hexanu, vzorek se zavede do kolony tak, že se hladina roztoku nechá poklesnout na úroveň síranu sodného, a zahájí se chromatografická eluce s hexanem s rychlostí průtoku přibližně 1 ml/min. Prvních 25 až 30 ml eluátu se vyhodí a použije se dalších 40 ml frakce. Tato frakce se převede do 100ml baňky s kulatým dnem (4.3). Poznámka 7: První frakce obsahuje nasycené uhlovodíky (obrázek 1a) a druhá frakce steroidové uhlovodíky. Další eluce poskytuje squalen a příbuzné sloučeniny. Pro dosažení dobré separace nasycených a steroidových uhlovodíků je nutná optimalizace objemů frakcí. Za tímto účelem je nutno objem první frakce upravit tak, aby při analýze druhé frakce byly píky reprezentující nasycené uhlovodíky nízké (viz obrázek 1c). Pokud se žádné takové píky neobjeví, avšak standardní píky mají zároveň pouze omezenou velikost, je třeba objem první frakce snížit. Úplná separace složek první a druhé frakce navíc není nutná, poněvadž během analýzy plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodě 6.3.1 nedochází k žádnému překrývání píků. Optimalizace objemu druhé frakce není zpravidla nutná, protože další složky se dobře separují. Nicméně přítomnost většího píku s retenčním časem přibližně o 1,5 minuty nižším než u standardu je způsobena squalenem a svědčí o špatné separaci.

6.2.2

Druhá frakce se zcela odpaří v rotačním odpařovači při 30 °C v mírném vakuu a zbytek se rozpustí neprodleně v 0,2 ml hexanu. Roztok se až do analýzy uchovává v ledničce. Poznámka 8: Zbytky 6.1.3 a 6.2.2 by neměly být přechovávány v suchém stavu a při pokojové teplotě. Jakmile jsou zbytky získány, je nutno k nim přidat neprodleně rozpouštědla a roztoky uchovávat v ledničce.

6.3   Plynová chromatografie

6.3.1

Pracovní podmínky pro nástřik pomocí děliče: — teplota vstřikovací komůrky: 300 °C, — teplota detektoru: 320 °C, — integrátor se zapisovačem: parametry pro integraci by měly být zvoleny tak, aby se správně určily plochy píků. Doporučuje se integrace mezi dvěma minimy, — citlivost: zhruba 16násobek nejmenšího útlumu, — množství nastříknutého roztoku: 1 μl roztoku, — programu termostatu: 6minutová izoterma o hodnotě 235 °C, potom nárůst na teplotu 285 °C rychlostí 2 °C/min, — vstřikovací komůrka s rozdělovačem toku (dělicí poměr 1:15), — nosný plyn: helium nebo vodík o tlaku asi 120 kPa. Tyto podmínky mohou být upraveny podle specifikací chromatografu a kolony tak, aby poskytly chromatogramy splňující následující podmínky: pík vnitřního standardu se musí objevit během pěti minut před, nebo po čase uvedeném v bodu 6.3.2 a musí dosáhnout nejméně 80 % plného rozsahu stupnice. Systém plynové chromatografie je nutno přezkoušet nástřikem směsi zásobního roztoku cholestadienu (5.6) a roztoku n-nonakosanu (5.8). Pík cholesta-3, 5-dienu se musí objevit dříve, než pík n-nonakosanu (obrázek 1c). Pokud se neobjeví, je možno snížit teplotu termostatu a/nebo nahradit kolonu pro plynovou chromatografii kolonou s nižší polaritou.

6.3.2

Identifikace píků Pík vnitřního standardu se objeví přibližně za 19 minut a píky stigmastadienolů s relativním retenčním časem přibližně 1,29 (viz obrázek 1b). Stigmasta-3, 5-dien se objevuje s malými množstvími izomeru a obvykle se obě tyto látky eluují současně jako jediný pík. Je-li však kolona příliš polární nebo vykazuje-li vysokou rozlišovací schopnost, může se izomer objevit jako malý pík těsně před píkem stigmasta-3, 5-dienu (obrázek 2). Aby byla zajištěna eluce stigmastadienolů jako jednoho píku, doporučuje se nahradit kolonu kolonou s nižší polaritou, nebo kolonou s větším vnitřním průměrem. Poznámka 9: Referenční chromatogram pro stigmastadienoly je možné získat analýzou rafinovaných rostlinných olejů s použitím menšího vzorku (1 až 2 g). Stigmastadienoly vytvářejí nápadný a snadno identifikovatelný pík.

6.3.3

Kvantitativní analýza Obsah stigmastadienolů se stanoví podle vzorce: mg/kg stigmastadienolů = kde: As = plochy píků stigmastadienolů (jestliže je pík rozdělen, součet ploch obou izomerů), Ac = plochy píků vnitřního standardu (cholestadienu), Mc = hmotnost přidaného standardu v mikrogramech, Mo = hmotnost navážených olejů v gramech. Detekční limit: asi 0,01 mg/kg. ▼M32 Poznámka 10: Pokud se stigmastadienoly vyskytují v koncentraci vyšší než 4 mg/kg a je-li požadována kvantifikace, musí být použita metoda Mezinárodní rady pro olivy pro stanovení sterenů v rafinovaných olejích. ▼M11

Obrázek č. 1

Plynové chromatogramy vzorků olivového oleje analyzovaných v kapilární koloně z taveného křemene (vnitřní průměr 0,25 mm, délka 25 m) potažené 5 % fenylmethylsilikonem o tloušťce filmu 0,25 μm.

Obrázek č. 2

Plynový chromatogram získaný ze vzorku rafinovaného olivového oleje analyzovaného na koloně DB-5, vykazující izomer stigmasta-3, 5-dienu.

▼M25

---

PŘÍLOHA XVIII

STANOVENÍ ROZDÍLU MEZI SKUTEČNÝM A TEORETICKÝM OBSAHEM TRIACYLGLYCEROLŮ S EKVIVALENTNÍM POČTEM UHLÍKOVÝCH ATOMŮ 42 (ECN 42)

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Stanovení absolutního rozdílu mezi experimentálními hodnotami triacylglycerolů (TAG) s ekvivalentním počtem atomů uhlíku 42, které byly v oleji stanoveny vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (ECN42HPLC), a teoretickou hodnotou TAG s ekvivalentním počtem atomů uhlíku 42 vypočtenou ze složení mastných kyselin (ECN 42teoretická).

2.   OBLAST POUŽITÍ

Tato metoda je použitelná pro olivové oleje. Metoda je použitelná pro určení přítomnosti malých množství semenného oleje (bohatého na linoleovou kyselinu) v olivových olejích všech tříd.

3.   PRINCIP

Obsah triacylglycerolů ECN42 stanovený analyticky pomocí HPLC a teoretický obsah triacylglycerolů ECN42 (vypočítaný ze stanovení složení mastných kyselin pomocí GLC) odpovídá v jistém rozmezí pravému olivovému oleji. Pokud je rozdíl větší, než hodnoty přijaté pro každý druh oleje, znamená to, že olej obsahuje semenné oleje.

4.   METODA

Metoda výpočtu teoretického obsahu triacylglycerolů s ECN 42 a rozdílu od údajů získaných HPLC je v podstatě provedená kombinací analytických údajů získaných jinými metodami. Dala by se rozdělit do tří fází: stanovení složení mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií, výpočet teoretického složení triacylglycerolů s ECN 42, stanovení triacylglycerolů s ECN 42 pomocí HPLC.

4.1    Přístroje a pomůcky

4.1.1

Baňky s kulatým dnem (250 ml a 500 ml)

4.1.2

Kádinky (100 ml)

4.1.3

Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 21 mm, délce 450 mm, s kohoutem a standardně ukončená na horním konci spojkou s vnitřním zábrusem

4.1.4

Dělicí nálevky (250 ml) s normalizovaným kohoutem na spodu kužele, vhodné ke spojení s horní částí kolony

4.1.5

Skleněná tyčinka o délce 600 mm

4.1.6

Skleněná nálevka o průměru 80 mm

4.1.7

Odměrné baňky (50 ml)

4.1.8

Odměrné baňky (20 ml)

4.1.9

Rotační odparka

4.1.10

Vysoce účinný kapalinový chromatograf s termostatickou regulací teploty kolony

4.1.11

Dávkovače na nástřik 10 μl dávek

4.1.12

Detektor: diferenciální refraktometr; schopnost měření v rozsahu nejméně 10–4 jednotky refrakčního indexu

4.1.13

Kolona: korozivzdorná trubice o délce 250 mm a vnitřním průměru 4,5 mm plněná silikagelem o průměru částic 5 μm a obsahu uhlíku ve formě oktadecylsilanu 22 % až 23 %

4.1.14

Programové vybavení pro zpracování dat

4.1.15

Nádobky (přibližně 2 ml) se septy potaženými teflonem a šroubovými uzávěry

4.2    Činidla

Reakční činidla by měla být analytické čistoty. Eluční rozpouštědla by měla být odplyněna a mohou být několikrát recyklována, aniž by ovlivnila separaci.

▼M32

4.2.1

Petrolether pro chromatografii (40–60 oC) nebo hexan. Hexan lze nahradit isooktanem (2,2,4-trimethylpentanem pro chromatografii) za předpokladu, že je dosaženo srovnatelných hodnot přesnosti. Rozpouštědla s vyšším bodem varu, než má n-hexan, se odpařují delší dobu. Z důvodu toxicity hexanu se však upřednostňují.

▼M25

4.2.2

Čerstvě destilovaný diethylether bez peroxidu

4.2.3

Eluční rozpouštědla pro čištění oleje směsí petroletheru/diethyletheru 87/13 (v/v) pro sloupcovou chromotografii

4.2.4

Silikagel typu Merck 7734 o velikosti částic 70–230 s normalizovaným obsahem vody 5 % hmotnostních

4.2.5

Skelná vata

4.2.6

Aceton pro HPLC

4.2.7

Acetonitril nebo propionitril pro HPLC

4.2.8

Eluční rozpouštědlo pro HPLC: acetonitril + aceton (poměr se upraví podle požadované separace; začíná se se směsí o poměru 50:50) nebo propionitril

4.2.9

Solubilizační rozpouštědlo: aceton

4.2.10

Referenční triglyceridy: mohou se použít komerční triglyceridy (tripalmitin, triolein atd.); retenční časy se pak vynesou podle ekvivalentního počtu atomů uhlíku, nebo se mohou použít referenční chromatogramy pro sojový olej, směs sojového oleje a olivového oleje v poměru 30:70 a olivový olej (viz poznámky 1 a 2 a obrázky 1 až 4).

4.2.11

Kolonka (6 ml) pro extrakci na pevnou fázi se silikagelem (1 g)

▼M32

4.2.12

Heptan pro chromatografii. Heptan lze nahradit isooktanem (2,2,4-trimethylpentanem pro chromatografii).

▼M25

4.3    Příprava vzorků

Vzhledem k celé řadě rušivých látek, které mohou vést k falešným pozitivním výsledkům, musí být vzorek vždy čištěn podle metody 2.507 IUPAC používané pro stanovení polárních sloučenin a tuků na smažení.

4.3.1    Příprava chromatografické kolony

Kolona (4.1.3) se naplní 30 ml elučního rozpouštědla (4.2.3). Pak se dovnitř kolony vsune trochu skelné vaty (4.2.5) a zatlačí se směrem dolů za pomocí skleněné tyčinky (4.1.5).

V 100 ml kádince se rozmíchá 25 g silikagelu (4.2.4) v 80 ml eluční směsi (4.2.3), poté se za pomocí skleněné nálevky (4.1.6) nalije do kolony.

Aby se veškerý silikagel vpravil do kolony, vypláchne se kádinka elučním roztokem a tento podíl se rovněž nalije do kolony.

Otevře se kohout a rozpouštědlo se nechá z kolony eluovat tak dlouho, dokud jeho hladina není přibližně 1 cm nad úrovní silikagelu.

4.3.2    Kolonová chromatografie

Olej se přefiltruje, homogenizuje a případně zbaví vody; poté se do 50 ml odměrné baňky (4.1.7) odváží 2,5 ± 0,1 g oleje s přesností na 0,001 g.

Olej se rozpustí přibližně ve 20 ml elučního rozpouštědla (4.2.3.). Pro snazší rozpouštění se případně lehce zahřeje. Poté se zchladí na pokojovou teplotu a objem se doplní elučním rozpouštědlem.

Za pomocí odměrné pipety se do kolony vpraví 20 ml roztoku připraveného podle bodu 4.3.1, otevře se kohout a rozpouštědlo se nechá eluovat na úroveň silikagelu.

Poté se eluuje 150 ml elučního rozpouštědla (4.2.3); průtok rozpouštědla se nastaví přibližně na 2 ml/min (150 ml projde kolonou přibližně za 60–70 minut).

Eluát se jímá do 250 ml baňky s kulatým dnem (4.1.1) předem vysušené v sušárně a přesně zvážené. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku v rotační odparce (4.1.9) a residuum se zváží. Residuum se použije pro přípravu roztoku k analýze HPLC a pro přípravu methylesteru.

Výtěžek vzorku z kolony musí být nejméně 90 % pro kategorie extrapanenský, panenský, rafinovaný a olivový olej, a nejméně 80 % pro lampantový olej a olivový olej z pokrutin.

4.3.3    Přečištění SPE

Silikagelová kolona SPE se aktivuje průchodem 6 ml hexanu (4.2.3) ve vakuu, aby se zabránilo vysušení.

Množství 0,12 g se s přesností na 0,001 g odváží do 2 ml lahviček (4.1.15) a rozpustí se v 0,5 ml hexanu (4.2.3).

Roztok se vlije do kolony SPE a eluuje se ve vakuu s 10 ml roztoku hexan–diethylether (87:13 v/v) (4.2.3).

Shromážděné frakce se odpaří do sucha v rotačním odparce (4.1.9) za sníženého tlaku a při pokojové teplotě. K analýze triacylglycerolů (TAG) se reziduum rozpustí ve 2 ml acetonu (4.2.6).

4.4    Analýza HPLC

4.4.1    Příprava vzorků pro chromatografickou analýzu

5 % roztok analyzovaného vzorku se připraví odvážením 0,5 ± 0,001 g vzorku do a 10 ml odměrné baňky a doplněním solubilizačním rozpouštědlem (4.2.9) na objem 10 ml.

4.4.2    Postup

Nastavení chromatografického systému. Eluční rozpouštědlo (4.2.8) se pumpuje rychlostí 1,5 ml/min, aby se celý systém propláchl. Počká se, až se ustálí základní linie.

Velikost nástřiku vzorku připraveného podle bodu 4.3 je 10 μl.

4.4.3    Výpočet a vyjádření výsledků

Používá se metoda normalizace plochy, tj. předpokládá se, že součet ploch všech píků odpovídajících triacylglycerolům s ECN42 až ECN52 je roven 100 %.

Relativní procentní zastoupení jednotlivých triglyceridů se vypočítá podle vzorce:

.

Výsledky by měly být uvedeny alespoň na dvě desetinná místa.

Viz poznámky 1 až 4.

4.5    Výpočet triacylglycerolového složení (% molární) z údajů o složení mastných kyselin (% plochy)

4.5.1    Stanovení složení mastných kyselin

Složení mastných kyselin se určuje podle ISO 5508 pomocí kapilární kolony. Methylestery se připraví podle COI/T.20/Doc. No 24.

4.5.2    Mastné kyseliny pro výpočet

Glyceridy se seskupují podle ekvivalentního počtu uhlíkových atomů (ECN) a zohledňuje se následná ekvivalence mezi ECN a mastnými kyselinami. V úvahu se berou pouze mastné kyseliny s počtem uhlíkových atomů mezi 16 a 18, protože jedině takové mastné kyseliny jsou významné z hlediska olivového oleje. Mastné kyseliny se normalizují do 100 %.

4.5.3    Převod plochy (%) na moly pro všechny mastné kyseliny (1)

4.5.4    Normalizace molů mastných kyselin na 100 % (2)

Výsledkem je procentní zastoupení každé mastné kyseliny v % molárních ve všech (1,2,3-) polohách triacylglycerolů.

Celkové množství nasycených mastných kyselin (SFA) P a S a nenasycených mastných kyselin (UFA) Po, O, L a Ln se vypočítá:

4.5.5    Výpočet složení mastných kyselin v pozicích 2- a 1,3- triacylglycerolů

Mastné kyseliny jsou rozděleny do tří skupin takto: jedna s polohou 2- a dvě stejné s polohou 1- a 3-, s různými koeficienty pro nasycené kyseliny (P a S) a nenasycené kyseliny (Po, O, L a Ln).

4.5.5.1   Nasycené mastné kyseliny s polohou 2- [P(2) a S(2)]

4.5.5.2   Nenasycené mastné kyseliny s polohou 2- [Po(2), O(2), L(2) a Ln(2)] (5):

4.5.5.3   Mastné kyseliny s polohou 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) a Ln(1,3)] (6):

4.5.6    Výpočet triacylglycerolů

4.5.6.1   Triacylglyceroly s jednou mastnou kyselinou (AAA, zde LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2   Triacylglyceroly se dvěma mastnými kyselinami (AAB, zde PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3   Triacylglyceroly se třemi různými mastnými kyselinami (ABC, zde OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4   Triacylglyceroly s ekvivalentním počtem uhlíkových atomů 42

Triacylglyceroly s ECN42 se vypočítávají podle rovnic 7, 8 a 9 a jsou poté uvedeny v pořadí podle předpokládané eluce při HPLC (obvykle pouze tři píky).

Triacylglyceroly s ECN42 se vyjádří jako součet devíti triacylglycerolů včetně jejich polohových izomerů. Výsledky by měly být uvedeny alespoň na dvě desetinná místa.

5.   HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ

Porovná se vypočtený teoretický obsah a obsah stanovený analýzou HPLC. Pokud je absolutní hodnota rozdílu výsledku z HPLC a výsledku určeného teoreticky vyšší než hodnota stanovená normou pro příslušnou kategorii oleje, vzorek obsahuje semenný olej.

Výsledky se uvádí na dvě desetinná místa.

6.   PŘÍKLAD (ČÍSELNÉ ODKAZY SE VZTAHUJÍ NA ODDÍL TEXTU POPISUJÍCÍ METODU)

— 4.5.1    Výpočet % molárních mastných kyselin z údajů GLC (% normalizované oblasti)

Následující údaje o složení mastných kyselin byly získány pomocí GLC:

— 4.5.3    Převedení plochy (%) na látkové množství (mol) pro všechny mastné kyseliny (viz vzorec (1))

mol P

=

mol S

=

mol Po

=

mol O

=

mol L

=

mol Ln

=

Celkem

=

0,35821 mol TAG

— 4.5.4    Normalizace mastných kyselin (mol) na 100 % (viz vzorec (2))

mol % P(1,2,3)

=

mol % S(1,2,3)

=

mol % Po(1,2,3)

=

mol % O(1,2,3)

=

mol % L(1,2,3)

=

mol % Ln(1,2,3)

=

Celkem % molárních

=

100 %

Součet nasycených a nenasycených mastných kyselin v poloze 1,2,3- TAG (viz vzorec (3):

— 4.5.5    Výpočet složení mastných kyselin v polohách 2- a 1,3- TAG

— 4.5.5.1   Nasycené mastné kyseliny v poloze 2- [P(2) a S(2)] (viz vzorec (4))

— 4.5.5.2   Nenasycené mastné kyseliny v poloze 2- [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) a Ln(1,3)] (viz vzorec (5))

— 4.5.5.3   Mastné kyseliny v poloze 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) a Ln(1,3)] (viz vzorec (6))

— 4.5.6    Výpočet triacylglycerolů

Z vypočítaného složení mastných kyselin v polohách 2- a 1,3-:

se vypočítají následující triacylglyceroly:

— 4.5.6.1.   Triacylglyceroly s jednou mastnou kyselinou (LLL, PoPoPo) (viz vzorec (7))

= 0,09706 mol LLL

— 4.5.6.2   Triacylglyceroly se dvěma mastnými kyselinami (PoLL, SLnLn, PoPoL) (viz vzorec (8))

0,03210 mol PoLL

0,00094 mol SLnLn

0,00354 mol PoPoL

— 4.5.6.3   Triacylglyceroly se třemi různými mastnými kyselinami (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) viz vzorec (9)

0,00761 mol PPoLn

0,43655 mol OLLn

0,06907 mol PLLn

0,04812 mol PoOLn

ECN42 = 0,69512 mol TAG

Poznámka 1 Pořadí eluce je možné stanovit výpočtem ekvivalentního počtu atomů uhlíku, často definovaných jako
, kde CN je počet atomů uhlíku a n je počet dvojných vazeb. Výpočet může být přesnější, pokud se vezme v úvahu původ dvojné vazby. Pokud jsou no, nl a nln počty dvojných vazeb náležejících olejové, linoleové resp. linolenové kyselině, ekvivalentní počet atomů uhlíku se může vypočítat použitím následujícího vzorce:

kde se koeficienty do, dl a dln mohou vypočítat použitím referenčních triglyceridů. Za podmínek popsaných v této metodě platí přibližně tento vztah:

Poznámka 2 S několika referenčními triglyceridy je rovněž možné vypočítat rozlišení vzhledem k trioleinu:

trioleinza použití sníženého retenčního času

.

Grafické vyjádření závislosti log α na f (počtu dvojných vazeb) umožňuje určit retenční hodnoty všech triglyceridů mastných kyselin obsažených v referenčních triglyceridech – viz obrázek 1.

Poznámka 3 Účinnost kolony by měla umožnit jasné oddělení píku trilinoleinu od píků triglyceridů s blízkým retenčním časem RT. Eluce se zastaví po píku odpovídajícímu ECN 52.

Poznámka 4 Správnost měření ploch píků sledovaných v rámci tohoto stanovení je zajištěna, pokud druhý pík odpovídající ECN 50 je 50 % plného rozsahu záznamové stupnice.

Obrázek 1

Graf závislosti log α na f (počtu dvojných vazeb)

Počet dvojných vazeb

La: laurová kyselina; My: myristová kyselina; P: palmitová kyselina; S: stearová kyselina; O: olejová kyselina; L: linoleová kyselina; Ln: linolenová kyselina

Obrázek 2

Olivový olej s nízkým obsahem linoleové kyseliny

a

Rozpouštědlo: aceton/acetonitril

Profil a: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS.

b

Rozpouštědlo: propionitril

Profil b: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS

Obrázek 3

Olivový olej s vysokým obsahem linoleové kyseliny

a)

Rozpouštědlo: aceton/acetonitril (50:50)

Profil a: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1‘) LLL + PoLL; (2‘) OLLn + PoOLn; (3‘) PLLn; ECN44: (4‘) OLL + PoOL; (5‘) OOLn + PLL; (6‘) POLn + PPoPo; ECN46: (7‘) OOL + PoOO; (8‘) PLO + SLL + PoOP; (9‘) PLP + PoPP; ECN48: (10‘) OOO; (11‘) POO + SLL + PPoO; (12‘) POP + PLS; ECN50: (13‘) SOO; (14‘) POS + SLS

b)

Rozpouštědlo: propionitril

Profil b: hlavní složky chromatografických píků: ECN42: (1) LLL; (2 + 2‘) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN52: (19) AOO.

▼M32

---

PŘÍLOHA XIX

STANOVENÍ SLOŽENÍ A OBSAHU STEROLŮ A ALKOHOLOVÝCH SLOUČENIN KAPILÁRNÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato metoda popisuje postup pro stanovení obsahu jednotlivých alkoholových sloučenin a celkový obsah alkoholových sloučenin v olivových olejích a olivových olejích z pokrutin a jejich směsích.

Alkoholové sloučeniny v olivových olejích a olivových olejích z pokrutin sestávají z alifatických alkoholů, sterolů a triterpenických dialkoholů.

2.   PODSTATA METODY

Oleje, k nimž je přidán α-cholestanol a 1-ikosanol jako vnitřní standard, jsou zmýdelněny pomocí ethanolového roztoku hydroxidu draselného; nezmýdelnitelné látky se následně extrahují pomocí diethyletheru.

Jednotlivé sloučeniny alkoholu se od nezmýdelnitelných látek oddělí tenkovrstvou chromatografií na bazické silikagelové desce (referenční metoda) nebo vysoce účinnou kapalinovou chromatografií pomocí kolony naplněné silikagelem. Frakce oddělená ze silikagelu se převede na trimethylsilylethery a analyzuje se pomocí kapilární plynové chromatografie.

ČÁST 1

PŘÍPRAVA NEZMÝDELNITELNÝCH LÁTEK

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato část popisuje přípravu a extrakci nezmýdelnitelných látek. Zahrnuje přípravu a extrakci nezmýdelnitelných látek z olivového oleje a olivového oleje z pokrutin.

2.   PODSTATA METODY

Vzorek se zmýdelní varem pod zpětným chladičem s ethanolovým roztokem hydroxidu draselného. Nezmýdelnitelné látky se extrahují pomocí diethyletheru.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení a zejména:

4.   ČINIDLA

130 g hydroxidu draselného (4.1) se za současného chlazení rozpustí ve 200 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem (4.7). Tento roztok je nutno uchovávat v dobře uzavřených skleněných láhvích z tmavého skla a skladovat po dobu maximálně dvou dnů.

5.   POSTUP

Pomocí mikrostříkačky na 500 μl (3.4) se do baňky na 250 ml (3.1) dá objem vnitřního standardního roztoku α-cholestanolu (4.10) a objem 1-ikosanolu (4.12) obsahující množství cholestanolu a ikosanolu rovnající se přibližně 10 % obsahu sterolu a alkoholu ve vzorku. Například při analýze olivového oleje se na 5 g vzorku olivového oleje přidá 500 μl roztoku α-cholestanolu (4.10) a 250 μl roztoku 1-ikosanolu (4.12). Při analýze olivového oleje z pokrutin se přidá 1 500  μl roztoku α-cholestanolu (4.10) a 1500 μl roztoku 1-ikosanolu (4.12). Vzorek se nechá odpařit do sucha v mírném proudu dusíku a v teplé vodní lázni. Po vychladnutí baňky se do stejné baňky naváží 5,00 ± 0,01 g vysušeného přefiltrovaného vzorku.

Přidá se 50 ml ethanolového roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 M (4.2) a malé množství pemzy, připojí se zpětný chladič a zahřeje se do mírného varu, dokud nedojde ke zmýdelnění (roztok se vyčeří). V zahřívání se pokračuje dalších 20 minut a poté se přes chladič přidá 50 ml destilované vody, chladič se pak odpojí a baňka se vychladí na teplotu přibližně 30 °C.

Obsah baňky se kvantitativně převede do dělicí nálevky na 500 ml (3.2) a propláchne se několika dávkami destilované vody (50 ml). Přidá se přibližně 80 ml diethyletheru (4.6), vše se důkladně protřepe po dobu přibližně 60 sekund a pravidelně se uvolňuje tlak obracením dělicí nálevky a otevíráním kohoutku. Nechá se odstát až do úplného oddělení obou fází (viz poznámka 2). Poté se co nejvíce mýdlového roztoku odčerpá do druhé dělicí nálevky. Stejným způsobem se provedou další dvě extrakce vodně-alkoholové fáze, vždy s použitím 60 až 70 ml diethyletheru (4.6).

Všechny tři etherové extrakty se smíchají v jedné dělicí nálevce obsahující 50 ml vody. Dále se promývá vodou (50 ml), dokud se promývací voda při přidání kapky roztoku fenolftaleinu nepřestane zbarvovat růžově (4.11). Odstraní se vodná fáze, etherová fáze se přefiltruje na bezvodém síranu sodném (4.4) do předem zvážené baňky na 250 ml, přičemž nálevka a filtr se promyjí malými množstvími diethyletheru (4.6).

Rozpouštědlo se nechá odpařit destilací ve vakuu v rotačním odpařovači při 30 °C. Přidá se 5 ml acetonu (4.5) a těkavé rozpouštědlo se zcela odstraní mírným proudem dusíku. Zbytek se suší v sušárně při 103 ± 2 °C po dobu 15 min. Po vychlazení v exsikátorech se zváží s přesností na 0,1 mg.

ČÁST 2

SEPARACE FRAKCÍ ALKOHOLOVÝCH SLOUČENIN

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Nezmýdelnitelné látky, jejichž příprava je popsána v části 1, se nechají frakcionovat v různých alkoholových sloučeninách, alifatických alkoholech, sterolech a triterpenických dialkoholech (erythrodiolu a uvaolu).

2.   PODSTATA METODY

Nezmýdelnitelné látky lze frakcionovat pomocí základní tenkovrstvé chromatografie (referenční metoda), zviditelnit a odpovídající pásma seškrábat a extrahovat. Alternativní metodou separace je vysoce účinná kapalinová chromatografie za použití kolony se silikagelem a UV detektoru, jejíž pomocí lze získat jednotlivé frakce. Alifatické a triterpenické alkoholy, sterol a triterpenické dialkoholy se společně izolují.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení a zejména:

4.   ČINIDLA

130 g hydroxidu draselného (4.1) se za současného chlazení rozpustí ve 200 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem (4.9). Tento roztok je nutno uchovávat v dobře uzavřených skleněných láhvích z tmavého skla a skladovat po dobu maximálně dvou dnů.

13 g hydroxidu draselného (4.1) se rozpustí ve 20 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem (4.9).

5.   REFERENČNÍ METODA SEPARACE ALKOHOLOVÝCH SLOUČENIN POMOCÍ ZÁKLADNÍ TENKOVRSTVÉ CHROMATOGRAFICKÉ DESKY

Příprava bazických desek pro tenkovrstvou chromatografii. Silikagelové desky (4.5) se na 10 sekund ponoří nebo namočí zhruba 4 cm hluboko do ethanolového roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,2 M (4.4), poté se nechají dvě hodiny sušit v digestoři a nakonec na jednu hodinu umístí do sušárny vyhřáté na 100 °C.

Desky se vyjmou ze sušárny a až do okamžiku použití uloží do exsikátoru s chloridem vápenatým (3.7) (takto upravené desky musí být použity během patnácti dnů).

Vyvíjecí komora se naplní směsí hexanu a diethyletheru (4.13) (viz poznámka 3) do výšky přibližně 1 cm. Vyvíjecí komora se uzavře vhodným krytem a nejméně půl hodiny ponechá v klidu a chladnu, aby se mohla vytvořit rovnováha mezi parami a kapalinou. Na vnitřní povrch vyvíjecí komory je možné připojit proužky filtračního papíru namočené v eluční směsi za účelem zkrácení doby vyvolávání přibližně o jednu třetinu a docílení stejnoměrnější, pravidelné eluce složek.

Připraví se přibližně 5 % roztok nezmýdelnitelné látky, jejíž příprava je popsána v části 1, v ethylacetátu (4.10) a 0,3 ml tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 100 μl (3.3) nastříkne jako úzký a rovnoměrný pruh k dolnímu okraji (2 cm) chromatografické desky (4.5). Ve stejné úrovni se nanese 2 až 3 μl referenčního roztoku materiálu (4.11) za účelem stanovení sterolového pásma a pásma triterpenických dialkoholů a alkoholů po dokončení vyvíjení.

Deska se umístí do vyvíjecí komory (3.1). Teplota okolí se udržuje mezi 15 a 20 °C (viz poznámka 4). Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu nebo se deska na chvíli nechá v digestoři.

Deska se lehce a rovnoměrně postříká roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu (4.12) a nechá se uschnout. Při pozorování pod UV lampou (3.2) je možné stanovit sterolové pásmo a pásmo triterpenických dialkoholů a alkoholů porovnáním skvrn vytvořených referenčním roztokem (bod 4.11). Obrysy pásem podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem (viz obrázek tenkovrstvé desky č. 1).

Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové stěrky. Odebraná hmota se rozmělní na malé části a převede do filtrační nálevky (3.4). Přidá se 10 ml horkého ethylacetátu (4.10). Obsah se důkladně promíchá kovovou stěrkou a přefiltruje (v případě potřeby ve vakuu). Filtrát se shromáždí v Erlenmeyerově baňce (3.5) připojené na filtrační nálevku.

Zbytek v baňce se třikrát propláchne diethyletherem (4.3) (přibližně 10 ml při každém propláchnutí). Filtrát se přitom sbírá do stejné baňky připojené k nálevce. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do předem zvážené zkumavky na 10 ml (3.6). Zkumavka se vysuší pod mírným proudem dusíku. Zbytek se znovu rozpustí několika kapkami acetonu (4.6) a opět vysuší. Zbytek ve zkumavce je tvořen sterolem a triterpenickýcmi dialkoholy nebo frakcemi alkoholů a triterpenických dialkoholů.

6.   SEPARACE ALKOHOLOVÉ FRAKCE POMOCÍ VYSOCE ÚČINNÉ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE

Nezmýdelnitelné látky získané podle postupu v části 1 se rozpustí ve 3 ml mobilní fáze (4.14), roztok se přefiltruje přes injekční filtr (3.10) a uchová se.

200 μl přefiltrovaného roztoku nezmýdelnitelných látek se vstříkne do zařízení vysoce účinné kapalinové chromatogrofie (3.8).

Nechá se proběhnout separace vysoce účinnou kapalinovou chromatografií při toku 0,8 ml/min. Prvních pět minut se nezohlední; do 25 ml Erlenmeyerových baněk (3.11) se zachytí alifatické a triterpenické alkoholy odseparované mezi 5. a 10. minutou a steroly a erytrodiol a uvaol odseparované mezi 11. a 25. minutou (viz poznámka 5).

Separaci lze sledovat UV detektorem při vlnové délce 210 nm nebo detektorem indexu lomu (viz obrázek 6).

Frakce se odpaří do sucha a připraví se na chromatografickou analýzu.

ČÁST 3

ANALÝZA FRAKCÍ ALKOHOLOVÝCH SLOUČENIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato část popisuje použití plynové chromatografie v kapilární koloně pro stanovení kvalitativního a kvantitativního složení alkoholových sloučenin izolovaných podle metody uvedené v části 2.

2.   PODSTATA METODY

Frakce získané z nezmýdelnitelných látek pomocí tenkovrstvé chromatografie nebo vysokoúčinné kapalinové chromatografie se derivatizují na trimethylsilylethery a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie opatřené nástřikovým zařízením s děličem a plameno-ionizačním detektorem.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Obvyklé laboratorní vybavení a zejména:

4.   ČINIDLA

5.   PŘÍPRAVA TRIMETHYLSILYLETHERŮ

Do zkumavky (3.1) obsahující frakci alkoholových sloučenin se přidá činidlo pro silylaci (4.8) (viz poznámka 6), v množství 50 μl na každý mg alkoholové sloučeniny. Přitom je nutné zabránit jakékoli absorpci vlhkosti (viz poznámka 7).

Zkumavka (3.1) se uzavře a pečlivě protřepe bez převracení, dokud se sloučeniny nerozpustí. Poté se nechá v klidu nejméně 15 minut při laboratorní teplotě a následně několik minut odstřeďuje. Čirý roztok je připraven pro plynovou chromatografickou analýzu.

6.   ANALÝZA PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

6.1.   Přípravné operace a kondicionace kapilární kolony

Kapilární kolona se připojí (3.3) k plynovému chromatografu tak, že vstup kolony se připojí k nástřikovému zařízení s děličem a výstup kolony se připojí k detektoru.

Provede se kompletní kontrola plynového chromatografu (těsnost plynových okruhů, účinnost detektoru, účinnost oddělovacího a zapisovacího systému atd.).

Kolonu, která má být použita poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kolonou se nechá protékat malé množství plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20 °C vyšší, než je provozní teplota (viz poznámka 8). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do pracovního režimu (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení výpočetního systému, nastavení teploty kolony, detektoru, injektoru atd.) a zaznamená se signál s citlivostí, která činí nejméně dvojnásobek citlivosti uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony.

6.2.   Provozní podmínky

Je zapotřebí optimalizovat teplotní program a průtok nosného plynu tak, aby se získaly chromatogramy podobné chromatogramům na obrázcích 3 až 6.

Byly testovány a shledány jako užitečné následující parametry:

6.2.1.   Alifatické alkoholy

6.2.2.   Sterol a triterpenické dialkoholy

Tyto podmínky se mohou měnit podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto požadavky:

6.3.   Analytický postup

Do mikrostříkačky na 10 μl (3.4) se natáhne 1 μl hexanu, poté 0,5 μl vzduchu a nakonec 0,5 až 1 μl zkušebního roztoku. Píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes membránu injektoru a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. Lze užít rovněž automatický injektor.

Zaznamenávání je prováděno, dokud přítomná trimethylsilyletherová směs příslušných alkoholových sloučenin není zcela eluována. Základní linie musí i nadále splňovat požadavky odpovídajících provozních podmínek (6.2.1 nebo 6.2.2).

6.4.   Identifikace píků

Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsí alifatických a triterpenických alkoholů nebo sterolu a triterpenických dialkoholů TMSE, analyzovanou za stejných podmínek. Chromatogram frakce alifatických a triterpenických dialkoholů je znázorněn na obrázku 3 a odpovídající chromatogramy sterolů a triterpenických dialkoholů na obrázku 2.

Alifatické alkoholy se eluují v tomto pořadí: C20-ol (V.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol a C28-ol.

Steroly a triterpenické dialkoholy se eluují v tomto pořadí: cholesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-methylen-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, chlerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erythrodiol a uvaol.

6.5.   Kvantitativní vyhodnocení

Pomocí systému sběru dat se vypočítají plochy píků 1-ikosanolu a alifatických alkoholů C22, C24, C26 a C28. Faktor odezvy 1-eikosanolu by se měl považovat za rovný 1.

Pomocí výpočetního systému se vypočítá plocha píků α-cholestanolu, sterolů a triterpenických dialkoholů. Píky jakýchkoli sloučenin, které nejsou mezi sloučeninami uvedenými v tabulce 1 (výpočet pro ergosterol se provádět nesmí) se ignorují. Faktor odezvy α-cholestanolu by se měl považovat za rovný 1.

Obsah jednotlivých alkoholových sloučenin vyjádřený v mg/kg tuku se vypočítá podle vzorce:

kde:

Ax

=

plocha píku alkoholové sloučeniny x vypočtená dle výpočetního systému.

As

=

plocha píku 1-ikosanolu/α-cholestanolu vypočtená dle výpočetního systému.

ms

=

množství přidaného 1-ikosanolu/α-cholestanolu v mg.

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v g.

7.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se obsah jednotlivých alifatických a triterpenických alkoholů v mg/kg tuku a jejich souhrn jako „celkový obsah alifatických alkoholů“. Celkový obsah je součet C22, C24, C26 a C28.

Složení jednotlivých alkoholových sloučenin by se mělo vyjadřovat s přesností na jedno desetinné místo.

Celková koncentrace sterolů by se měla vyjádřit v celých číslech.

Procentní podíl jednotlivých sterolů z poměru plochy příslušného píku k celkové ploše píků sterolů se vypočítá podle vzorce:

kde:

Ax

=

plocha píku sterolu x,

ΣA

=

celková plocha píků sterolů.

Zjevný β -sitosterol: Δ5,23-stigmastadienol + chlerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-stigmastadienol.

Vypočítá se procentní podíl erythrodiolu a uvaolu:

kde:

AEr

=

plocha erythrodiolu vypočtená dle výpočetního systému,

AUv

=

plocha uvaolu vypočtená dle výpočetního systému.

Σ AT

=

součet ploch píků sterolu + erythrodiolu + uvaolu vypočtených dle výpočetního systému.

Kromě výpočtu relativního podílu jednotlivých sterolů a triterpenických dialkoholů a celkové koncentrace sterolů se musí vypočítat také koncentrace erythrodiolu a uvaolu a jejich součet v mg/kg tuku, a to podle následujících vzorců:

kde:

Aer

=

plocha píku erythrodiolu vypočtená dle výpočetního systému,

Auv

=

plocha uvaolu vypočtená dle výpočetního systému,

As

=

plocha píku α-cholestanolu vypočtená dle výpočetního systému,

ms

=

množství přidaného α-cholestanolu v mg.

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v g.

---

Dodatek

Obrázek 1 – tenkovrstvá chromatografie nezmýdelnitelné frakce z olivového oleje z pokrutin dvakrát eluované s hexanem:diethyletherem (65:35), vyvinuté s SO4H2 (50 %) a zahřáté. Pásma, která je třeba seškrábat, se nachází v obdélníku; 1 jsou pásma alifatických alkoholů a 2 sterolů a triterpenických dialkoholů.

Obrázek 2 – GC-FID chromatografický profil sterolu a triterpenických dialkoholů z rafinovaného olivového oleje. (1) Cholesterol, (2) α-cholestanol (V.S.), (3) 24-methylencholesterol, (4) kampesterol, (5) kampestanol, (6) stigmasterol, (7) Δ5,23-stigmastadienol, (8) chlerosterol, (9) β-sitosterol, (10) sitostanol, (11) Δ5-avenasterol, (12) Δ5,24-stigmastadienol, (13) Δ7-stigmastenol, (14) Δ7-avenasterol, (15) erythrodiol, (16) uvaol.

Obrázek 3 – GC-FID chromatografický profil sterolu a triterpenických dialkoholů z lampantového olivového oleje. (1) Cholesterol, (2) α-cholestanol, (3) brassikasterol, (4) 24-methylencholesterol, (5) kampesterol, (6) kampestanol, (7) stigmasterol, (8) Δ7-kampesterol, (9) Δ5,23-stigmastadienol, (10) chlerosterol, (11) β-sitosterol, (12) sitostanol, (13) Δ5-avenasterol, (14) Δ5,24-stigmastadienol, (15) Δ7-stigmastenol, (16) Δ7-avenasterol, (17) erythrodiol, (18) uvaol.

Obrázek 4 – GC-FID chromatografický profil alifatických alkoholů a triterpenických alkoholů z olivového oleje. (V.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenické alkoholy.

Obrázek 5 – GC-FID chromatografický profil alifatických alkoholů a triterpenických alkoholů z rafinovaného olivového oleje a olivového oleje po druhém odstřeďování. (V.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenické alkoholy.

Obrázek 6 – Chromatogram nezmýdelnitelných látek z olivového oleje separovaných vysoce účinnou kapalinovou chromatografií za použití UV detektoru. (1) Alifatické a triterpenické alkoholy, (2) steroly a triterpenické dialkoholy.

▼M23

---

PŘÍLOHA XX

Metoda stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin kapilární plynovou chromatografií

1.   ÚČEL

Tato metoda slouží ke stanovení obsahu vosků, methylesterů mastných kyselin a ethylesterů mastných kyselin v olivových olejích. Jednotlivé vosky a alkylestery jsou separovány podle počtu atomů uhlíku. Metoda je doporučeným nástrojem pro rozlišení mezi olivovým olejem a olivovým olejem z pokrutin a stanoví jakostní parametr pro extra panenský olivový olej, což umožňuje rozeznat podvodně smíchané extra panenské olivové oleje s oleji nižší kvality, ať už se jedná o panenské, lampantové či jiné dezodorizované oleje.

2.   PODSTATA METODY

K oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   ZAŘÍZENÍ

3.1.	Kónická 25ml baňka.

3.2.	Skleněná kolona pro kapalnou chromatografii o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm vybavená vhodným kohoutem.

3.3.

Plynový chromatograf, vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený systémem pro přímý nástřik na kolonu, obsahující následující části: 3.3.1. termostaticky ovládatelná kolonová komora s nastavitelnou teplotou; 3.3.2. studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony; 3.3.3. plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač; 3.3.4. integrátor se zapisovačem (poznámka 1), vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (bod 3.3.3), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekunda a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru; Poznámka 1:  Jsou-li data plynové chromatografie zadávána do počítače, lze také použít počítačem řízené systémy. 3.3.5. kapilární kolona z taveného křemene (pro analýzu vosků, methylesterů a ethylesterů), dlouhá 8 až 12 m s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi (poznámka 2), o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm; Poznámka 2:  Pro tento účel jsou k dispozici vhodné komerční kapalné fáze, např. SE52, SE54 atd.

3.4.	mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou;

3.5.	elektrický vibrátor;

3.6.	rotační odparka;

3.7.	muflová pec;

3.8.	analytická váha pro vážení s přesností ± 0,1 mg;

3.9.	běžné laboratorní sklo.

4.   ČINIDLA

4.1.	Silikagel, 60–200 μm mesh. Silikagel se umístí alespoň na čtyři hodiny do muflové pece o teplotě 500 °C. Nechá se ochladit a přidají se 2 % vody v závislosti na množství použitého silikagelu. Řádným protřepáním se směs homogenizuje a před použitím se ponechá nejméně 12 hodin v exsikátoru.

▼M32

4.2.

n-hexan pro chromatografii nebo pro residuální analýzu. Hexan lze nahradit isooktanem (2,2,4-trimethylpentanem pro chromatografii) za předpokladu, že je dosaženo srovnatelných hodnot přesnosti. Rozpouštědla s vyšším bodem varu, než má n-hexan, se odpařují delší dobu. Z důvodu toxicity hexanu se však upřednostňují. Musí být kontrolována čistota – lze například zkontrolovat zbytek po odpaření 100 ml rozpouštědla. POZOR! – Výpary se mohou vznítit. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami či přímým plamenem. Ujistěte se, že jsou láhve vždy řádně uzavřeny. Při použití zajistěte řádné větrání. Zabraňte hromadění výparů a eliminujte veškeré příčiny možného vzniku požáru, jako jsou topná tělesa a elektrická zařízení, jež nejsou vyrobena z nehořlavého materiálu. Vdechnutí je škodlivé, neboť může dojít k poškození nervových buněk. Zabraňte vdechnutí výparů. V případě nutnosti použijte vhodný respirační přístroj. Zabraňte styku s očima a s pokožkou. Isooktan je hořlavá kapalina představující nebezpečí požáru. Meze výbušnosti v ovzduší odpovídají 1,1 % až 6,0 % (obsahu v % objemových). Při požití a vdechnutí je toxický. Při práci s tímto rozpouštědlem použijte digestoř v dobrém provozním stavu.

▼M23

4.3.

Ethylether pro chromatografii POZOR! - Vysoce hořlavý a mírně jedovatý. Dráždí pokožku. Vdechnutí je škodlivé. Může způsobit poškození zraku. Účinky mohou být opožděné. Může vytvářet výbušné peroxidy. Výpary se mohou vznítit. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami či přímým plamenem. Ujistěte se, že jsou láhve vždy řádně uzavřeny. Při použití zajistěte řádné větrání. Zabraňte hromadění výparů a eliminujte veškeré příčiny možného vzniku požáru, jako jsou topná tělesa a elektrická zařízení, jež nejsou vyrobena z nehořlavého materiálu. Neodpařujte do sucha nebo téměř do sucha. Přidání vody nebo vhodného redukčního prvku může omezit tvorbu peroxidů. Nepijte. Zabraňte vdechnutí výparů. Zabraňte dlouhotrvajícímu či opakovanému styku s pokožkou.

4.4.

N-heptan čistoty pro chromatografii nebo isooktan. POZOR! - Hořlavý. Vdechnutí je škodlivé. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami či přímým plamenem. Ujistěte se, že jsou láhve vždy řádně uzavřeny. Při použití zajistěte řádné větrání. Zabraňte vdechnutí výparů. Zabraňte dlouhotrvajícímu či opakovanému styku s pokožkou.

4.5.	Standardní roztok 0,05 % (m/V) laurylcharidátu (poznámka 3) v heptanu (vnitřní standard pro vosky). Poznámka 3:  Lze také použít palmityl-palmitát, myristyl-stearát či arachidyl-laureát.

4.6.	Standardní roztok 0,02 % (m/V) methylheptakaprinátu v heptanu (vnitřní standard pro methylestery a ethylestery).

4.7.	Sudan 1 (1-fenylazo-2-naftol).

4.8.

Nosný plyn: vodík či helium, čistý pro plynovou chromatografii. POZOR! Vodík. Pod tlakem vysoce hořlavý. Chraňte před zdroji tepla, jiskrami, přímým plamenem a uchovávejte mimo dosah elektrických přístrojů z hořlavého materiálu. Ujistěte se, zda je ventil láhve po použití vodíku vždy uzavřen. Používejte vždy s redukčním ventilem. Před otevřením ventilu láhve uvolněte pnutí pružiny redukčního ventilu. Při otvírání ventilu nestůjte před výpustným otvorem láhve. Při použití zajistěte řádné větrání. Nepřepouštějte vodík z jedné láhve do druhé. Nemíchejte plyn v láhvi. Ujistěte se, že láhve nelze převrhnout. Chraňte je před slunečním světlem a před zdroji tepla. Skladujte v nekorozivním prostředí. Nepoužívejte poškozené nebo neoznačené láhve. Helium. Vysoce stlačený plyn. Snižuje množství kyslíku pro dýchání. Uchovávejte v zavřené láhvi. Při použití zajistěte řádné větrání. Nevstupujte do skladovacích prostor, pokud nejsou řádně větrány. Používejte vždy s redukčním ventilem. Před otevřením ventilu láhve uvolněte pnutí pružiny redukčního ventilu. Nepřepouštějte plyn z jedné láhve do druhé. Ujistěte se, že láhve nelze převrhnout. Při otvírání ventilu nestůjte před výpustným otvorem láhve. Chraňte je před slunečním světlem a před zdroji tepla. Skladujte v nekorozivním prostředí. Nepoužívejte poškozené nebo neoznačené láhve. Nevdechujte. Používejte výhradně pro technické účely.

4.9.

Pomocné plyny: — Vodík, čistý pro plynovou chromatografii. — Vzduch, čistý pro plynovou chromatografii. POZOR! Vzduch. Vysoce stlačený plyn. Dbejte opatrnosti při použití v přítomnosti hořlavých látek, protože teplota pro samovznícení většiny organických složek vzduchu je při vysokém tlaku znatelně nižší. Ujistěte se, že je ventil láhve po použití vždy uzavřen. Vždy používejte redukční ventil. Před otevřením ventilu láhve uvolněte pnutí pružiny redukčního ventilu. Při otvírání ventilu nestůjte před výpustným otvorem láhve. Nepřepouštějte plyn z jedné láhve do druhé. Nemíchejte plyn v láhvi. Ujistěte se, že láhve nelze převrhnout. Chraňte je před slunečním světlem a před zdroji tepla. Skladujte v nekorozivním prostředí. Nepoužívejte poškozené nebo neoznačené láhve. Vzduch pro technické účely nesmí být vdechován nebo používán v respiračních přístrojích.

5.   POSTUP

5.1.    Příprava chromatografické kolony

15 g silikagelu (bod 4.1) se suspenduje v n-hexanu (bod 4.2) a zavede do kolony (bod 3.2). Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru, aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější. Provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot. Do 25ml baňky (bod 3.1) se na analytické váze (bod 3.8) naváží přesně 500 mg vzorku a přidá se vhodné množství vnitřního standardu (bod 4.5) v závislosti na předpokládaném obsahu vosku, např. 0,1 mg laurylcharidátu v případě olivového oleje, 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin a 0,05 mg methylheptakaprinátu v případě olivových olejů (bod 4.6).

Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu (bod 4.2) převede do chromatografické kolony.

Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu. Perkoluje se další n-hexan/diethyleter (99:1) a odebere se 220 ml při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund. (Tato frakce obsahuje methylestery, ethylestery a vosky.) (poznámka 4) (poznámka 5)

Retenční doba barviva je mezi retenční dobou vosků a triglycerolů. Když tedy barvivo dosáhne dna chromatografické kolony, musí být eluce suspendována, protože veškeré vosky byly eluovány.

Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači, až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku. Odebere se frakce obsahující methylestery a ethylestery tak, že se naředí 2 až 4 ml n-heptanu nebo isooktanu.

5.2.    Plynová chromatografická analýza

5.2.1.    Přípravné práce

Kolona se spojí s plynovým chromatografem (bod 3.3), vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detektoru. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detektoru a záznamníku atd.).

Kolonu, která má být použita poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf. Nechá se postupně zahřívat, dokud není po přibližně čtyřech hodinách dosaženo teploty 350 °C.

Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do předepsaných podmínek (regulace průtoku plynu, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače (bod 3.3.4), nastavení teploty kolonové komory, detektoru, atd.). Signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů.

Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony.

5.2.2.    Výběr pracovních podmínek pro vosky, methylestery a ethylestery (poznámka 6).

Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto:

—	Teplota kolony : 20 °C/min 5 °C/min počáteční teplota 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Teplota detektoru : 350 °C.

—	Množství nastříknuté látky : 1 μl roztoku n-heptanu (2 až 4 ml).

—	Nosný plyn : helium nebo vodík při optimální lineární rychlosti pro zvolený plyn (viz dodatek A).

—	Citlivost přístroje : vhodná pro dosažení výše uvedených podmínek.

Tyto podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem oddělit veškeré vosky, methylestery mastných kyselin a ethylestery mastných kyselin a dosáhnout přijatelné separace píků (viz obrázky 2, 3 a 4) a retenčního času vnitřního standardu laurylcharidátu 18 ± 3 minuty. Nejreprezentativnější pík vosků musí dosáhnout 60 % z plného rozsahu, vnitřní standard methylheptakaprinát pro methylestery a ethylestery musí dosáhnout plného rozsahu.

Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků.

5.3.    Provedení analýzy

Do 10μl mikrostříkačky se natáhne 10 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede do vstřikové komory a po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne.

Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nebo stigmastadieny nejsou zcela eluovány v závislosti na analyzované frakci.

Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadovaným podmínkám.

5.4.    Identifikace píků

Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známy a které byly analyzovány za stejných podmínek. Alkylestery se identifikují ze směsí methylesterů a ethylesterů hlavních mastných kyselin v olivových olejích (palmitová a olejová).

Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku 1. Obrázky 2 a 3 zobrazují chromatogramy dvou maloobchodně prodávaných extra panenských olivových olejů, jeden obsahuje methylestery a ethylestery, v druhém obsaženy nejsou. Na obrázku 4 jsou chromatogramy extra panenského olivového oleje nejvyšší třídy a stejného oleje uměle obohaceného 20 % dezodorizovaného oleje.

5.5.    Kvantitativní vyhodnocení vosků

Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu laurylcharidátu a alifatickým esterům C40 až C46.

Celkový obsah vosků se vypočítá sečtením jednotlivých vosků v mg/kg tukové látky takto:

kde:

Ax

=

plocha píku příslušného esteru vypočtená počítačem

As

=

plocha píku vnitřního standardu laurylcharidátu vypočtená počítačem

ms

=

hmotnost přidaného vnitřního standardu laurylcharidátu v mg;

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v gramech.

5.5.1.    Kvantitativní vyhodnocení methylesterů a ethylesterů

Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu methylheptakaprinátu, methylesterů mastných kyselin C16 a C18 a ethylesterů mastných kyselin C16 a C18.

Obsah každého alkylesteru v mg/kg tukové látky se vypočítá takto:

kde:

Ax

=

plocha píku příslušného esteru C16 a C18 vypočtená počítačem

As

=

plocha píku vnitřního standardu methylheptakaprinátu vypočtená počítačem

ms

=

hmotnost přidaného vnitřního standardu methylheptakaprinátu v mg;

m

=

hmotnost vzorku použitého pro stanovení v gramech.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se souhrn obsahů jednotlivých vosků C40 až C46 (poznámka 7) v mg/kg tukové látky.

Uvádí se souhrn obsahů jednotlivých methylesterů a ethylesterů C16 až C18 a celkový součet methylesterů a ethylesterů.

Výsledky se zaokrouhlují na celé mg/kg.

Uvádí se poměr mezi ethylestery a methylestery.

Obrázek 1

Příklad plynového chromatogramu frakce vosků olivového oleje ( 6 )

Píky methylesterů a ethylesterů mastných kyselin s retenční dobou 5 až 8 minut.

Vysvětlivky:

I.S.

=

(vnitřní standard) Laurylcharidát

1

=

Estery diterpenu

2+2′

=

Estery C40

3+3′

=

Estery C42

4+4′

=

Estery C44

5

=

Estery C46

6

=

Estery sterolů a triterpenické alkoholy

Obrázek 2

Methylestery, ethylestery a vosky v panenském olivovém oleji

Vysvětlivky:

1

–

Methyl C16

2

–

Ethyl C16

3

–

Vnitřní standard methylheptakaprinát

4

–

Methyl C18

5

–

Ethyl C18

6

–

Squalene

7

–

Vnitřní standard laurylcharidát

A

–

Estery diterpenů

B

–

Vosky

C

–

Estery sterolů a triterpenů

Obrázek 3

Methylestery, ethylestery a vosky v extra panenském olivovém oleji

Vysvětlivky:

1

–

Vnitřní standard methylheptakaprinát

2

–

Methyl C18

3

–

Ethyl C18

4

–

Squalen

5

–

Vnitřní standard laurylcharidát

A

–

Estery diterpenů

B

–

Vosky

C

–

Estery sterolů a triterpenů

Obrázek 4

Část chromatogramu extra panenského olivového oleje a stejného oleje uměle obohaceného dezodorizovaným olejem

Vysvětlivky:

1

–

Vnitřní standard methyl-myristát

2

–

Methyl-palmitát

3

–

Ethyl-palmitát

4

–

Vnitřní standard methylheptakaprinát

5

–

Methyl-linoleát

6

–

Methyl-oleát

7

–

Methyl-stearát

8

–

Ethyl-linoleát

9

–

Ethyl-oleát

10

–

Ethyl-stearát

---

Dodatek A

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se nastříkne 1:3 μl methanu (nebo propanu). Pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku vzniku píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a tM je čas v sekundách, změřený stopkami.

▼M28 —————

▼M25

---

PŘÍLOHA XXI

---

( 1 ) Úř. věst. L 228, 1.9.2009, s. 3.

( 2 ) Směrnice Evropského parlamentu a Rady 2011/91/EU ze dne 13. prosince 2011 o údajích nebo značkách určujících šarži, ke které potravina patří (Úř. věst. L 334, 16.12.2011, s. 1).

( 3 ) Po eluování esterů sterolů musí být chromatografická linie bez významných píků (triglyceridů).

( 4 ) Nařízení Evropského parlamentu a Rady (EU) č. 1308/2013 ze dne 17. prosince 2013, kterým se stanoví společná organizace trhů se zemědělskými produkty a zrušují nařízení Rady (EHS) č. 922/72, (EHS) č. 234/79, (ES) č. 1037/2001 a (ES) č. 1234/2007 (Úř. věst. L 347, 20.12.2013, s. 671).

( 5 ) Může ochutnávání oleje odmítnout, pokud při přímém čichovém vnímání zaznamená, že některý z negativních znaků je extrémně intenzivní. Tuto výjimečnou okolnost zaznamená do profilového listu.

( 6 ) Po eluaci esterů sterolů nesmí chromatogram vykazovat žádné výrazné píky (triacylglyceroly).