82/434/EHSDruhá směrnice Komise 82/434/EHS ze dne 14. května 1982 o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků

►B

DRUHÁ SMĚRNICE KOMISE

ze dne 14. května 1982

o sbližování právních předpisů členských států týkajících se metod analýzy nezbytných pro kontrolu složení kosmetických prostředků

(82/434/EHS)

(Úř. věst. L 185, 30.6.1982, p.1)

Úřední věstník

  No

page

date

►M1

Směrnice Komise 90/207/EHS ze dne 4. dubna 1990,

  L 108

92

28.4.1990

2.1

0,5 % (m/v) vodné referenční roztoky následujících sloučenin:

2.2

Vyvíjecí rozpouštědlo A, 80 % (v/v) ethanol

2.3

Vyvíjecí rozpouštědlo B, benzen – methanol – 3-methyl-butan-1-ol – voda (34: 38: 18: 10 objemově)

2.4

Detekční činidlo A, 10 % (m/v) vodný roztok jodidu draselného

2.5

Detekční činidlo B, 1 % (m/v) vodný roztok škrobu

2.6

Detekční činidlo C, 10 % (m/m) kyselina chlorovodíková

2.7

4 N kyselina chlorovodíková

3.1

Chromatografický papír (papír Whatman č. 3 nebo č. 4 nebo jejich ekvivalenty)

3.2

Mikropipeta na 1 μl

3.3

Odměrné baňky na 100 ml

3.4

Skládané filtry

3.5

Zařízení pro sestupnou papírovou chromatografii

4.2.1.

Naváží se 1 g a 5 g vzorku a rozptýlí se v 50 ml vody, v obou případech se doplní vodou na 100 ml a promíchají se. Obě suspenze se přefiltrují přes skládaný filtr (3.4) a z každého z filtrátů se použije 1 μl pro provedení papírové chromatografie popsané v oddílu 5.

4.2.2

Ještě jednou se připraví dvě suspenze vzorků rozptýlením 1 g a 5 g v 50 ml vody, okyselí se zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (2.7), doplní se vodou na 100 ml a promíchají se. Suspenze se přefiltrují přes skládaný filtr (3.4) a 1 μl každého z těchto roztoků se použije pro provedení papírové chromatografie popsané v oddílu 5.

5.1

Přiměřené množství rozpouštědel A (2.2) a B (2.3) se umístí do dvou oddělených chromatografických komor, aby se provedla sestupná papírová chromatografie. Chromatografické komory se sytí párami rozpouštědla alespoň 24 hodin.

5.2

1 μl roztoku vzorku a všech referenčních roztoků připravených podle oddílu 4 a bodu 2.1 se nanese na startovní body proužku chromatografického papíru (Whatman č. 3 nebo ekvivalentní) 40 cm dlouhého a 20 cm širokého (3.1) nebo jiných vhodných rozměrů a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.

5.3

Chromatografický proužek (5.2) se umístí do chromatografické kolony naplněné vyvíjecím rozpouštědlem A (5.1) a vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí o 35 cm (asi 15 hodin).

5.4

Postup popsaný v bodech 5.2 a 5.3 se opakuje za použití chromatografického papíru (Whatman č. 4 nebo ekvivalentní) (3.1) a vyvíjecího roztoku B. Chromatografie probíhá, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí o 35 cm (asi pět hodin).

5.5

Po ukončení vyvíjení se chromatogramy vyjmou a usuší se na vzduchu.

5.6

Skvrny se objeví po následném postříkání:

5.7

Za výše zmíněných podmínek vztahujících se k vyvíjecím rozpouštědlům A (2.2) a B (2.3) jsou hodnoty Rf referenčních látek (2.1) přibližně následující:

2.1

Methanol

2.2

36 % (m/m) koncentrovaná kyselina chlorovodíková

2.3

6 N kyselina chlorovodíková

2.4

4 N kyselina sírová

2.5

Disodná sůl kyseliny rhodizonové (5,6-dihydroxycyklohex-5-en1,2,3,4-tetron, sodná sůl)

2.6

Chlorid barnatý (BaCl2·2H2O)

2.7

Bezvodý uhličitan sodný

2.8

1 % (m/v) vodný roztok chloridu barnatého

2.9

Vyvíjecí rozpouštědlo skládající se z methanolu, koncentrované kyseliny chlorovodíkové (koncentrace 36 %) a vody (80: 10: 10 objemově)

2.10

Detekční činidlo, 0,1 % (m/v) vodný roztok disodné soli kyseliny rhodizonové, připravuje se bezprostředně před použitím.

3.1

Mikropipeta na 5 μl

3.2

Platinové kelímky

3.3

Odměrné baňky na 100 ml

3.4

Chromatografický papír Schleicher and Schüll 2043 b nebo ekvivalentní. Papír se vyčistí tak, že se přes noc nechá vyvíjet v komoře pro sestupnou chromatografii (A.3.5) obsahující vyvíjecí rozpouštědlo (B.2.9) a poté se usuší.

3.5

Skládaný filtrační papír

3.6

Běžné zařízení pro provádění vzestupné papírové chromatografie

4.1.1

2 g výrobku se rozptýlí v 50 ml vody a pH suspenze se upraví přibližně na hodnotu 1 kyselinou chlorovodíkovou (B.2.3).

4.1.2

Suspenze se pomocí vody převede do odměrné baňky na 100 ml, doplní se po rysku vodou a promíchá se. Tato suspenze se použije pro analýzu papírovou chromatografií popsanou v oddílu 5 a pro důkaz barya vysrážením síranu.

4.2.1

2 g výrobku se rozptýlí ve 100 ml vody a přefiltruje se.

4.2.2

K vysušenému zbytku se přidá množství uhličitanu sodného odpovídající sedmi až desetinásobku hmotnosti zbytku (B.2.7), promíchá se a směs se půl hodiny taví v platinovém kelímku (B.3.2).

4.2.3

Ochladí se na pokojovou teplotu, tavenina se rozpustí v 50 ml vody a přefiltruje se (B.3.5).

4.2.4

Zbytek z taveniny se rozpustí v kyselině chlorovodíkové (B.2.3) a doplní se vodou na 100 ml. Tento roztok se použije pro analýzu papírovou chromatografií popsanou v oddílu 5 a pro důkaz barya vysrážením síranu.

5.1

Přiměřené množství vyvíjecího rozpouštědla (B.2.9) se umístí do komory pro vzestupnou chromatografii a komora se sytí alespoň 15 hodin.

5.2

Na kus chromatografického papíru – předem upraveného tak, jak je popsáno v bodu B.3.4 – se nanese do třech startovních bodů 5 μl každého z roztoků připravených podle bodů B.4.1.2 a B.4.2.4 a referenční roztok B.2.8.

5.3

Vzorek a referenční skvrny se vysuší na vzduchu. Chromatogram se vyvíjí, dokud čelo rozpouštědla nepostoupí o 30 cm.

5.4

Chromatogram se vyjme z komory a usuší na vzduchu.

5.5

Skvrny na chromatogramu se objeví po postříkání papíru detekčním činidlem B.2.10. V přítomnosti barya se na chromatogramu objeví červené skvrny s hodnotou Rf asi 0,10.

3.1

2 N kyselina sírová

3.2

Jodid draselný

3.3

Molybdenan amonný

3.4

0,1 N thiosíran sodný

3.5

10 % (m/v) roztok jodidu draselného, připravuje se bezprostředně před použitím

3.6

20 % (m/v) roztok molybdenanu amonného

3.7

1 % (m/v) roztok škrobu

4.1

Kádinky na 100 ml

4.2

Byreta na 50 ml

4.3

Odměrné baňky na 250 ml

4.4

Odměrné válce na 25 a 100 ml

4.5

Nedělené pipety na 10 ml

4.6

Erlenmeyerovy baňky na 250 ml

5.1

Do kádinky na 100 ml se naváží 10 g (m gramů) výrobku obsahujícího asi 0,6 g peroxidu vodíku. Obsah se pomocí vody převede do odměrné baňky na 250 ml, doplní se po rysku vodou a promíchá se.

5.2

10 ml roztoku vzorku (5.1) se odpipetuje do Erlenmeyerovy baňky na 250 ml (4.6) a postupně se přidá 100 ml 2 N kyseliny sírové (3.1), 20 ml roztoku jodidu draselného (3.5) a tři kapky roztoku molybdenanu amonného (3.6).

5.3

Vzniklý jod se okamžitě titruje 0,1 N roztokem thiosíranu sodného (3.4) a těsně před dosažením bodu ekvivalence se přidá několik mililitrů roztoku škrobu (3.7) jako indikátoru. Zaznamená se spotřeba 0,1 N roztoku thiosíranu sodného (3.4) v mililitrech (V).

5.4

Způsobem popsaným v bodech 5.2 a 5.3 se provede slepý pokus, přičemž se nahradí 10 ml roztoku vzorku 10 ml vody. Zaznamená se spotřeba 0,1 N roztoku thiosíranu sodného na slepý pokus (V0 v ml).

m

=

množství analyzovaného výrobku (5.1) v gramech,

V0

=

spotřeba 0,1 N roztoku thiosíranu sodného na slepý pokus (5.4) v mililitrech,

V

=

spotřeba 0,1 N roztoku thiosíranu sodného při titraci roztoku vzorku (5.3) v mililitrech.

3.1

Ethanol, bezvodý

3.2

Aceton

3.3

Ethanol, 96 % (v/v)

3.4

3.5

Kyselina L(+)askorbová

3.6

Chloroform

3.7

Cyklohexan

3.8

Dusík, technický

3.9

Toluen

3.10

Benzen

3.11

n-Butanol

3.12

Butan-2-ol

3.13

Kyselina fosforná, 50 % roztok (v/v)

3.14

Diazotační činidlo. Buď:

nebo ekvivalentní.

3.15

Dusičnan stříbrný

3.16

p-Dimethylaminobenzaldehyd

3.17

2,5-Dimethylfenol

3.18

Chlorid železitý hexahydrát

3.19

Kyselina chlorovodíková, 10 % roztok (m/v)

3.20

Referenční látky jsou sloučeniny uvedené v oddílu 1 „Rozsah a oblast použití“. V případě aminosloučenin musí být referenční sloučenina buď ve formě hydrochloridu (mono nebo dihydrochloridu), nebo jako volná báze.

3.21

Připraví se 0,5 % roztoky (m/v) referenčních látek uvedených v bodu 3.20.

Naváží se 50 ± 1 mg referenční látky do odměrné baňky na 10 ml.

Přidá se 5 ml 96 % ethanolu (3.3) a 250 ml kyseliny askorbové (3.5).

Roztok se alkalizuje přidáním roztoku amoniaku (3.4) na hodnotu pH 10 (zjišťuje se indikátorovým papírkem).

Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3) a promíchá se.

Roztoky je možno uchovávat po dobu jednoho týdne v chladu a temnu.

V některých případech může po přidání kyseliny askorbové a roztoku amoniaku vzniknout sraženina. Před dalším postupem je třeba ji nechat usadit.

3.22

3.23

3.23.1   Diazotační činidlo

Připraví se 5 % (m/v) vodný roztok zvoleného činidla (3.14). Tento roztok se musí připravit bezprostředně před použitím.

3.23.2   Ehrlichovo činidlo

2 g p-dimethylaminobenzaldehydu (3.16) se rozpustí ve 100 ml 10 % vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (m/v) (3.19).

3.23.3   2,5-dimethylfenol – chlorid železitý hexahydrát

Roztok 1: Rozpustí se 1 g dimethylfenolu (3.17) ve 100 ml 96 % ethanolu (3.3).

Roztok 2: Rozpustí se 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18) ve 100 ml 96 % ethanolu (3.3).

Při vyvolání chromatogramu se těmito roztoky provádí postřik samostatně, nejprve roztokem 1, poté roztokem 2.

3.23.4   Amoniakální dusičnan stříbrný

25 % amoniak (3.4) se přidá k 5 % (m/v) vodnému roztoku dusičnanu stříbrného (3.15), až se sraženina rozpustí. Toto reakční činidlo se připravuje bezprostředně před použitím.

Nelze jej uchovávat.

4.1

Běžné laboratorní vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě.

4.2

Odstředivka, 4000 ot./min.

4.3

Centrifugační zkumavky na 10 ml se šroubovými uzávěry potaženými PTFE nebo ekvivalentní.

6.1.1

β-naftol (β N)

6.1.2

2-aminofenol (OAP)

6.1.3

3-aminofenol (MAP)

6.1.4

4-aminofenol (PAP)

6.1.5

2-nitro-1,4-fenylendiamin (2-NPPD)

6.1.6

4-nitro-1,2-fenylendiamin (4-NOPD)

Připraví se 0,5 % (m/v) roztoky všech dalších referenčních látek způsobem popsaným v bodu 3.21.

6.2.1

Ethylacetát – cyklohexan – 25 % roztok amoniaku (65: 30: 0,5 objemově)

6.4.1

Podle obrázku 1 se na desce pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1.3) vyznačí na straně s absorbentem dvě linky.

6.4.2

V dusíkové atmosféře (4.1.1) se nanese 1 až 4 μl extraktu (5.1) do základního bodu 1 (obr. 1), který leží asi 2 cm od obou okrajů. Množství extraktu závisí na intenzitě skvrn na chromatogramech (5.2).

6.4.3

Mezi body 2 a 3 (obr. 1) se nanesou oxidační barviva dokázaná nebo pokládaná za dokázaná podle bodu 5.2 (vzdálenost mezi body je 1,5 cm). Nanáší se 2 μl každého referenčního roztoku – kromě DAP, který je nutno nanést v objemu 6 μl. Nanášení se provádí v atmosféře dusíku (6.4.2).

6.4.4

Postup podle bodu 6.4.3 se opakuje v základních bodech 4 a 5 (obr. 1) a deska se uchovává pod dusíkem až do zahájení vyvolávání chromatogramu (vzdálenost mezi body je 1,5 cm).

6.4.5

Chromatografická komora se propláchne dusíkem (3.8) a umístí se do ní vhodné množství vyvíjecího rozpouštědla 3.22.2. Deska (6.4.4) se vloží do komory a vyvíjí se ve tmě v prvním vyvíjecím směru (obr. 1).

Vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na desce (přibližně 13 cm).

6.4.6

Deska se z komory vyjme a umístí do jiné chromatografické komory, předem propláchnuté dusíkem, aby se vyvíjecí rozpouštědlo odpařovalo alespoň 60 minut.

6.4.7

Pomocí dělené zkumavky se do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) převede vhodné množství vyvíjecího rozpouštědla (6.2), do komory se vloží deska otočená o 90° (6.4.6) a chromatogram se vyvíjí ve druhém směru (opět ve tmě), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na straně s adsorbentem. Deska se vyjme z komory a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.

6.4.8

Deska se na 10 minut umístí do chromatografické komory obsahující páry jodu (6.3) a dvourozměrný chromatogram se interpretuje s využitím hodnot Rf a barev současně chromatografovaných referenčních látek (hodnoty Rf a barvy skvrn jsou uvedeny v tabulce II).

Poznámka

Nejlepšího vybarvení skvrn se dosáhne tehdy, ponecháli se po vyvíjení chromatogram v atmosféře po dobu půl hodiny.

6.4.9

Přítomnost oxidačních barviv nalezených podle bodu 6.4.8 je možno definitivně potvrdit opakováním postupu popsaného v bodech 6.4.1 až 6.4.8, kdy se v základním bodu 1 přes množství extraktu podle bodu 6.4.2 nanese 1 μl referenčních látek identifikovaných v bodu 6.4.8. Neobjeví-li se oproti chromatogramu získanému podle bodu 6.4.8 žádná jiná skvrna, je interpretace chromatogramu podle bodu 6.4.8 správná.

3.1

3.2

3.3

Methanol

3.4

Roztok 2-aminobenzaldehydfenylhydrazonu (reakční činidlo Nitrin®) v methanolu.

Naváží se 2,0 g Nitrinu® a převede se kvantitativně do odměrné baňky na 100 ml. Po kapkách se přidají 4 ml zředěné kyseliny chlorovodíkové (3.2) a protřepe se. Doplní se po rysku methanolem a míchá, dokud se roztok úplně nevyčeří. Roztok se uchovává v hnědé skleněné lahvi (4.3).

4.1

Kádinky na 50 ml

4.2

Odměrná baňka na 100 ml

4.3

Hnědá skleněná láhev na 125 ml

4.4

Skleněná deska 10 × 10 cm

4.5

Špachtle z plastu

4.6

Filtrační papír 10 × 10 cm

5.1

Část analyzovaného vzorku se rovnoměrně rozetře na skleněnou desku (4.4) tak, aby byl povrch pokryt vrstvou nejvýše 1 cm silnou.

5.2

List filtračního papíru (4.6) se nasákne destilovanou vodou. Položí se na vzorek a přitiskne špachtlí z plastu (4.5).

5.3

Počká se asi jednu minutu a do středu filtračního papíru se nanesou:

5.4

Po 5 až 10 sekundách se filtrační papír odstraní a prohlédne se proti dennímu světlu. Červenofialové zbarvení indikuje přítomnost dusitanů.

Je-li obsah dusitanů nízký, změní se červenofialové zbarvení během 5 až 15 sekund na žluté. Je-li přítomno velké množství dusitanů, dojde k této barevné změně až po jedné nebo dvou minutách.

4.1

Čeřidla: tato reakční činidla nelze používat déle než jeden týden po přípravě.

4.2

Roztok dusitanu sodného:

0,500 g dusitanu sodného se rozpustí v destilované vodě v odměrné baňce na 1000 ml a doplní se vodou po rysku. 10,0 ml tohoto zásobního standardního roztoku se zředí na 500 ml; 1,0 ml výsledného roztoku = 10 mikrogramů NaNO2.

4.3

1 N roztok hydroxidu sodného

4.4

0,2 % roztok sulfanilamidhydrochloridu:

2,0 g sulfanilamidu se za zahřívání rozpustí v 800 ml vody. Po ochlazení se za míchání přidá 100 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Zředí se vodou na 1000 ml.

4.5

5 N kyselina chlorovodíková

4.6

N-1-naftylové činidlo:

Tento roztok se musí připravit v den použití. Rozpustí se 0,1 g dihydrochloridu N-1-naftylethylendiaminu ve vodě a zředí se vodou na 100 ml.

5.1

Analytické váhy

5.2

Odměrné baňky na 100, 250, 500 a 1000 ml

5.3

Nedělené nebo dělené pipety

5.4

Odměrné válce na 100 ml

5.5

Skládaný filtrační papír, bez dusitanů, průměr 15 cm

5.6

Vodní lázeň

5.7

Spektrofotometr a kyvety s optickou drahou 1 cm

5.8

pHmetr

5.9

Mikrobyreta na 10 ml

5.10

Kádinky na 250 ml

6.1

S přesností na 0,1 mg se naváží asi 0,5 g (m gramů) homogenizovaného vzorku, kvantitativně se převede horkou destilovanou vodou do kádinky na 250 ml (5.10) a doplní se horkou destilovanou vodou asi na 150 ml. Kádinka (5.10) se na půl hodiny vloží do vodní lázně (5.6) vyhřáté na 80 °C. Během této doby se obsah občas protřepe.

6.2

Ochladí se na pokojovou teplotu a postupně se za míchání přidají 2 ml Carrezova činidla I (4.1.1) a 2 ml Carrezova činidla II (4.1.2).

6.3

Přidává se 1 N roztok hydroxidu sodného (4.3), dokud se pH neupraví na 8,3. (Použije se pHmetr (5.8)). Obsah se kvantitativně převede do odměrné baňky na 250 ml (5.2) a doplní destilovanou vodou po rysku.

6.4

Obsah se promíchá a zfiltruje přes skládaný papírový filtr (5.5).

6.5

Do odměrné baňky na 100 ml (5.2) se odpipetuje (5.3) odpovídající alikvotní část (V mililitrů) čirého filtrátu, avšak ne více než 25 ml, a doplní se destilovanou vodou na objem 60 ml.

6.6

Po promíchání se přidá 10,0 ml roztoku sulfanilamid–hydrochloridu (4.4) a poté 6,0 ml 5 N kyseliny chlorovodíkové (4.5). Promíchá se a ponechá stát pět minut. Přidají se 2,0 ml N-1-naftylového činidla (4.6), promíchá se a ponechá stát tři minuty. Zředí se vodou po rysku a promíchá se.

6.7

Připraví se slepý pokus opakováním operací popsaných v bodech 6.5 a 6.6 bez přídavku N1-naftylového činidla (4.6).

6.8

Změří se (5.7) absorbance roztoku připraveného podle bodu 6.6 při 538 nm proti roztoku slepého pokusu (6.7).

6.9

Z kalibračního grafu (6.10) se odečte obsah dusitanu sodného v mikrogramech na 100 ml roztoku (m1 mikrogramů), odpovídající absorbance změřené podle bodu 6.8.

6.10

S využitím roztoku dusitanu sodného o koncentraci 10 μg na ml (4.2) se sestrojí kalibrační graf pro koncentrace 0, 20, 40, 60, 80 a 100 μg dusitanu sodného ve 100 ml.

m

=

hmotnost vzorku odebraného pro analýzu v gramech (6.1),

m1

=

obsah dusitanu sodného v mikrogramech zjištěný podle bodu 6.9,

V

=

počet mililitrů filtrátu použitého pro měření (6.5).

3.2.1

Fuchsin;

3.2.2

Siřičitan sodný heptahydrát;

3.2.3

Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (d = 1,19);

3.2.4

Kyselina sírová, asi 1M;

3.2.5

Do kádinky se naváží 100 mg fuchsinu (3.2.1) a rozpustí se v 75 ml vody o teplotě 80 °C. Po ochlazení se přidá 2,5 g siřičitanu sodného heptahydrátu (3.2.2) a 1,5 ml kyseliny chlorovodíkové (3.2.3). Objem se doplní do 100 ml.

Je použitelné do dvou týdnů.

3.3.1

Do kádinky na 10 ml se naváží 2 g vzorku.

3.3.2

Přidají se dvě kapky kyseliny sírové (3.2.4) a 2 ml Schiffova činidla (3.2.5). Toto činidlo musí být při použití naprosto bezbarvé.

Obsah se protřepe a nechá stát 5 minut.

3.3.3

Objeví-li se do pěti minut růžové nebo lila zbarvení, je přítomen formaldehyd v množství vyšším než 0,01 % a musí být stanoven volný a vázaný formaldehyd metodou podle bodu 4 a v případě potřeby metodou podle bodu 5.

4.2.1

Bezvodý octan amonný;

4.2.2

Koncentrovaná kyselina octová, d4 20= 1,05;

4.2.3

Pentan2,4dion, čerstvě předestilovaný za sníženého tlaku 25 mm Hg při 25 °C – nesmí vykazovat žádnou absorpci při 410 nm;

4.2.4

Butan1ol;

4.2.5

Kyselina chlorovodíková, 1M;

4.2.6

Kyselina chlorovodíková, asi 0,1M;

4.2.7

Hydroxid sodný, 1M;

4.2.8

Roztok škrobu, čerstvě připravený (1 g/50 ml vody) podle Evropského lékopisu, 2. vydání 1980, část I-VII-1-1;

4.2.9

Formaldehyd, 37 % až 40 % (m/V);

4.2.10

Odměrný roztok jodu, 0,05 M;

4.2.11

Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1 M;

4.2.12

V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí:

Doplní se na 1000 ml vodou (pH roztoku asi 6,4).

Toto činidlo musí být připraveno čerstvě.

4.2.13

Činidlo (4.2.12) bez přídavku pentan-2,4-dionu;

4.2.14

5 g roztoku formaldehydu (4.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.

Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:

Odebere se 10,00 ml; přidá se 25,00 ml odměrného roztoku jodu (4.2.10) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (4.2.7).

Nechá se stát pět minut.

Okyselí se 11,00 ml HCl (4.2.5) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (4.2.11), jako indikátor se použije roztok škrobu (4.2.8).

Spotřeba 1 ml 0,05M odměrného roztoku jodu (4.2.10) odpovídá 1,5 mg formaldehydu;

4.2.15

Zásobní roztok formaldehydu se zředí vodou nejprve v poměru 1/20 a poté v poměru 1/100.

1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 1 μg formaldehydu.

Přesný obsah se vypočte.

4.3.1

Běžné laboratorní vybavení;

4.3.2

Filtr pro separaci fází, Whatman 1 PS (nebo ekvivalentní);

4.3.3

Odstředivka;

4.3.4

Vodní lázeň nastavená na teplotu 60 °C;

4.3.5

Spektrofotometr;

4.3.6

Skleněné kyvety s délkou optické dráhy 1 cm.

4.4.4.1

Směsi připravené podle bodů 4.4.1, 4.4.2 a 4.4.3 se protřepou. Erlenmeyerovy baňky se přesně na 10 minut vloží do vodní lázně vyhřáté na 60 °C. Nechají se vychladnout dvě minuty v lázni s ledovou vodou.

4.4.4.2

Obsah se převede do dělicí nálevky na 50 ml obsahující 10 ml butan-1-olu (4.2.4). Každá baňka se vypláchne 3 až 5 ml vody. Směs se přesně 30 sekund důkladně třepe. Fáze se nechají oddělit.

4.4.4.3

Obsah se přefiltruje do měřicích kyvet (4.3.2) přes filtr pro separaci fází. Fáze lze rovněž odstředit (při 3000 ot./min po dobu 5 minut).

4.4.4.4

Absorbance (A1) extraktu roztoku vzorku podle bodu 4.4.1 proti extraktu referenčního roztoku 4.4.2 se změří při 410 nm V.

4.4.4.5

Obdobně se změří absorbance (A2) extraktu roztoku slepého pokusu podle bodu 4.4.3 proti butan-1-olu.

Poznámka: Všechny tyto operace musí být provedeny do 25 minut od okamžiku, kdy byly Erlenmeyerovy baňky vloženy do lázně vyhřáté na 60°C.

4.4.5.1

Do Erlenmeyerovy baňky na 50 ml se přidá:

4.4.5.2

Postupuje se tak, jak je popsáno v bodu 4.4.4, a měří se absorbance proti butan-1-olu (4.2.4).

4.4.5.3

Postup se opakuje s 10, 15, 20 a 25 ml zředěného standardního roztoku (4.2.15).

4.4.5.4

Nulová hodnota (odpovídající zabarvení reakčních činidel) se získá postupem podle bodu 4.4.4.5.

4.4.5.5

Po odečtení nulové hodnoty od každé hodnoty absorbance získané podle bodu 4.4.5.1 a 4.4.5.3 se sestrojí kalibrační křivka. Beerův zákon platí až do 30 μg formaldehydu.

4.5.1

Od hodnoty A1 se odečte hodnota A2 a z kalibrační křivky (4.4.5.5) se odečte množství C formaldehydu v roztoku vzorku (4.4.1) v μg.

4.5.2

Obsah formaldehydu ve vzorku (% m/m) se vypočte pomocí vzorce

kde

5.2.1

Voda čistoty pro HPLC nebo voda ekvivalentní kvality;

5.2.2

Bezvodý octan amonný;

5.2.3

Koncentrovaná kyselina octová;

5.2.4

Pentan-2,4-dion (uchovává se při 4 °C);

5.2.5

Bezvodý hydrogenfosforečnan disodný;

5.2.6

Kyselina trihydrogenfosforečná, 85 % (d = 1,7);

5.2.7

Methanol čistoty pro HPLC;

5.2.8

Dichlormethan;

5.2.9

Formaldehyd, 37 % až 40 % (m/V);

5.2.10

Hydroxid sodný, 1M;

5.2.11

Kyselina chlorovodíková, 1M;

5.2.12

Kyselina chlorovodíková, 0,002M;

5.2.13

Roztok škrobu čerstvě připravený podle Evropského lékopisu (viz 4.2.8);

5.2.14

Odměrný roztok jodu, 0,05M;

5.2.15

Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1M;

5.2.16

Vodný roztok hydrogenfosforečnanu disodného (5.2.5), 0,006 M, upravený na pH 2,1 kyselinou trihydrogenfosforečnou (5.2.6);

5.2.17

V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí

Objem se doplní po rysku vodou (5.2.1).

Roztok se uchovává ve tmě.

Skladovatelnost: nejvýše tři dny při 25 °C.

Barva roztoku by se neměla měnit.

5.2.18

10 g roztoku formaldehydu (5.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.

Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:

Odebere se 5 ml; přidá se 25 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) a 10 ml roztoku hydroxidu sodného (5.2.10).

Nechá se stát pět minut.

Okyselí se 11 ml HCl (5.2.11) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (5.2.15), jako indikátor se použije roztok škrobu (5.2.13).

Spotřeba 1 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) odpovídá 1,5 mg formaldehydu.

5.2.19

Zásobní roztok formaldehydu se zředí v poměru 1/100 mobilní fází (5.2.16).

1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 37 μg formaldehydu.

Přesný obsah se vypočte.

5.3.1

Běžné laboratorní vybavení;

5.3.2

Bezpulsní čerpadlo pro HPLC;

5.3.3

Nízkotlaké bezpulsní čerpadlo (případně druhé čerpadlo pro HPLC);

5.3.4

Nastřikovací ventil se smyčkou o objemu 10 μl;

5.3.5

Reaktor za kolonou obsahující následující prvky:

5.3.6

Membránový filtr, velikost pórů 0,45 μm;

5.3.7

Patrona SEPPAKR C18 nebo ekvivalentní; (C18 se píše s 18 jako spodním indexem)

5.3.8

Hotové kolony:

5.3.9

Bischoff K1 hypersil RP 18 (typ K1 G 6301 1805)

(5 μm, délka 10 mm), nebo ekvivalentní.

5.3.10

Kolona a předkolona se spojí systémem Ecotube (typ A 15020508 Bischoff) nebo ekvivalentním.

5.3.11

Aparatura (5.3.5) se sestaví podle blokového schématu v doplňku 2.

Spoje za nastřikovacím ventilem musí být co nejkratší. V tomto případě má trubka z korozivzdorné oceli mezi výstupem z reaktoru a vstupem do detektoru ochladit směs před detekcí; teplota detektoru není známa, ale je konstantní.

5.3.12

Detektor pro viditelnou a UV oblast;

5.3.13

Zapisovač;

5.3.14

Odstředivka;

5.3.15

Ultrazvuková lázeň;

5.3.16

Vibrační míchadlo (Vortex nebo ekvivalentní).

m

=

hmotnost analyzovaného vzorku v gramech (5.4.2.1),

C

=

koncentrace formaldehydu v μg/100 ml odečtená z kalibrační křivky (5.4.1).

4.1

25 % kyselina chlorovodíková (m/m)

4.2

Methanol

4.3

Ethanol 96 % (v/v)

4.4

Silikagelové desky pro chromatografii na tenké vrstvě připravené k použití (plastové nebo hliníkové) s fluorescenčním indikátorem. Desky se deaktivují následujícím postupem: běžná silikagelová deska se nastříká vodou, dokud se povrch neleskne. Nastříkané desky se nechají schnout při pokojové teplotě jednu až tři hodiny.

Poznámka

Bez deaktivace může docházet ke ztrátám resorcinolu v důsledku ireverzibilní adsorpce na silikagelu.

4.5

Vyvíjecí rozpouštědlo: aceton – chloroform – kyselina octová (20: 75: 5 objemově).

4.6

Standardní roztok resorcinolu: rozpustí se 400 mg resorcinolu ve 100 ml 96 % ethanolu (4.3) (1 ml odpovídá 4000 μg resorcinolu).

4.7

Roztok vnitřního standardu: rozpustí se 400 mg 3,5dihydroxytoluenu (DHT) ve 100 ml 96 % ethanolu (4.3) (1 ml odpovídá 4000 μg DHT).

4.8

Směs standardů: v odměrné baňce na 100 ml se smíchá 10 ml roztoku 4.6 a 10 ml roztoku 4.7, doplní se po rysku 96 % ethanolem (4.3) a promíchá (1 ml roztoku odpovídá 400 μg resorcinolu a 400 μg DHT).

4.9

Silylační činidla:

5.1

Běžné vybavení pro chromatografii na tenké vrstvě a plynovou chromatografii

5.2

Skleněné laboratorní nádobí

6.1.1

Do kádinky na 150 ml se přesně naváží zkušební vzorek (m gramů) výrobku, který obsahuje asi 20 až 50 mg resorcinolu.

6.1.2

Okyselí se kyselinou chlorovodíkovou (4.1) do kyselé reakce (je potřeba přibližně 2 až 4 ml), přidá se 10 ml (40 mg DHT) roztoku vnitřního standardu (4.7) a promíchá se. Ethanolem (4.3) se převede do odměrné baňky na 100 ml, doplní se ethanolem po rysku a promíchá.

6.1.3

250 μl roztoku (6.1.2) se nanese na deaktivovanou desku se silikagelem (4.4) jako nepřerušovaná linie o délce přibližně 8 cm. Je třeba dbát na to, aby linie byla co nejužší.

6.1.4

Na stejnou desku se stejným způsobem (6.1.3) nanese 250 μl směsi standardů (4.8).

6.1.5

Do dvou bodů startovací linie se nanese po 5 μl roztoků 4.6 a 4.7 k usnadnění lokalizace skvrn po vyvolání.

6.1.6

Deska se vyvíjí v nenasycené komoře naplněné vyvíjecím rozpouštědlem 4.5, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti 12 cm od startovací linie; obvykle to trvá asi 45 minut. Deska se usuší na vzduchu a zóna resorcinolu/DHT se lokalizuje pod krátkovlnným UV světlem (254 nm). Obě tyto sloučeniny mají přibližně stejnou hodnotu Rf. Poloha pásů se vyznačí tužkou ve vzdálenosti 2 mm od vnějšího tmavého rozhraní pásů. Tyto zóny se z desky odstraní a adsorbenty každého pásu se shromáždí v lahvi na 10 ml.

6.1.7

Adsorbent obsahující vzorek a absorbent obsahující směs standardů se extrahují následujícím způsobem:

přidají se 2 ml methanolu (4.2) a extrahuje se jednu hodinu za neustálého míchání. Směs se zfiltruje a extrakce se opakuje po dobu dalších 15 minut se 2 ml methanolu.

6.1.8

Extrakty se spojí a rozpouštědlo se nechá přes noc odpařit ve vakuovém exsikátoru naplněném vhodným sušicím prostředkem. Nezahřívá se.

6.1.9

Odparky (6.1.8) se silylují způsobem popsaným v bodu 6.1.9.1 nebo 6.1.9.2.

r1 a r2

=

retenční časy dvou píků v minutách,

w1 a w2

=

šířky píků v polovině výšky píků v mm,

d’

=

rychlost posuvu papíru v mm za minutu.

6.2.2

Do plynového chromatografu se nastříkne 1 až 3 μl roztoků připravených podle bodu 6.1.9. Pro každý roztok (6.1.9) se provede pět nástřiků, změří se plochy píků, vypočte se průměr a poměr ploch píků: S = plocha píku resorcinolu/plocha píku DHT.

M

=

hmotnost zkušebního vzorku v gramech (6.1.1),

Svzorku

=

průměrná plocha píku podle bodu 6.2.2 pro roztok vzorku,

Sstandardní směsi

=

průměrná plocha píku podle bodu 6.2.2 pro směs standardů.

4.1

Methanol

4.2

Absolutní ethanol

4.3

Propan-2-ol

4.4

Chloroform zbavený alkoholů promytím vodou

5.1

Plynový chromatograf:

5.2

Odměrné baňky na 100 ml

5.3

Pipety na 2 ml, 20 ml a 0 až 1 ml

5.4

Mikrostříkačky na 0 až 100 μl a 0 až 5 μl

a (pouze pro aerosolové vzorky) speciální plynotěsná injekční stříkačka s posuvným ventilem (viz obrázek 5 ( 9 ), postup odběru vzorků).

6.1.1

Vzorky z výrobků v obalech na aerosoly se odebírají postupem podle kapitoly II přílohy ke směrnici Komise 80/1335/EHS ze dne 22. prosince 1980 ( 10 ) a poté se analyzují plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodu 6.2.1.

6.1.2

Vzorky výrobků, které nejsou v obalech na aerosoly, odebírané postupem podle výše uvedené kapitoly II se zředí vodou na koncentraci 1 až 2 % ethanolu či propan-2-olu a poté se analyzují plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodu 6.2.2.

6.2.1

Pro aerosolové vzorky se použije tepelně vodivostní detektor.

6.2.2

Jiné než aerosolové vzorky:

7.1

Pro plynovou chromatografii podle bodu 6.2.1 (náplň kolony Hallcomid M18) se použijí následující standardní směsi. Tyto směsi se připraví odměřením pomocí pipet, ale přesné množství se stanoví zvážením pipety nebo baňky po každém přidání.

Do chromatografu se nastřikují 2 až 3 μl za podmínek uvedených v bodu 6.2.1.

Pro každou směs se vypočtou poměry ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan2ol). Sestrojí se kalibrační graf vynesením:

7.2

Pro plynovou chromatografii podle bodu 6.2.2 (náplň kolony Porapak QS nebo Chromosorb 105) se použijí následující standardní směsi. Tyto směsi se připraví odměřením pomocí pipet, ale přesné množství se stanoví zvážením pipety nebo baňky po každém přidání.

Do chromatografu se nastřikují 2 až 3 μl za podmínek uvedených v bodu 6.2.2.

Pro každou kalibrační směs se vypočtou poměry ploch píků (methanol/ethanol) nebo (methanol/propan2ol) a sestrojí se kalibrační graf vynesením:

7.3

Kalibrační graf musí být přímkový.

1

=

Čerpadlo pro HPLC

2

=

nastřikovací ventil

3

=

kolona s předkolonou

4

=

čerpadlo pro činidla

5

=

díl ve tvaru T bez mrtvého objemu

5‘

=

díl ve tvaru T (Vortex)

6 6‘

=

spojka bez mrtvého objemu

7

=

„francouzské pletivo“

7‘

=

reaktor

8

=

tříhrdlá baňka s vroucí vodou

9

=

topné hnízdo

10

=

chladič

11

=

výměník tepla z trubky z korozivzdorné oceli

11‘

=

výměník tepla

12

=

detektor pro viditelnou a UV oblast

13

=

modul za kolonou PCRS 520